Apikální smykové napětí Zvýšený transport organických kationtů u člověka OCT2/MATE1-transfekované Madin-Darbyho psí ledvinové buňky zahrnuje ciliární snímání

Pro více informací:emily.li@wecistanche.com

Aishwarya Jayagopal, Paul R. Brakeman, Peter Soler, Nicholas Ferrell, William Fissell, Deanna L. Kroetz a Shuvo Roy

Ústav bioinženýrství a terapeutických věd (AJ, PS, DLK, SR) a Pediatrie (PRB),

University of California San Francisco (UCSF), San Francisco, Kalifornie;

a oddělení medicíny, Divize nefrologie, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, Tennessee (NF, WF)

ABSTRAKTNÍ

Aktivní dopravaledvinovéproximální tubuly hrají významnou roli v dispozici léků. Během vývoje léku se odhady oledvinovévylučování jsou zásadní pro stanovení dávky. Ledvinové bioreaktory, které reprodukují fyziologické příbuzné ledviny, jako je smykový stres vyvolaný průtokem, mohou lépe předpovídat chování léků in vivo než současné modely in vitro. V této studii jsme zkoumali roli smykového napětí na aktivní transport 4-(4-(dimethylamino)-styryl)-N-methyl pyridinium jodidu (ASP plus) psem Madin-Darbyledvinabuňkyexogenně exprimující lidské přenašeče organických kationtů přenašeč organického kationtu 2 (OCT2) a protein 1 pro vytlačování více léčiv a toxinů (MATE1). Buňky kultivované na paralelní plotně za kontinuální perfuze média vytvořily těsnou monovrstvu s vysokou bariérou pro inulin. V reakci na zvyšující se úrovně smykového napětí (0.2-2 dyn/cm) buňky vykazovaly odpovídající zvýšení transportu ASP plus , dosahující maximálního 4{7}}násobného nárůstu při 2. dynes/cm² ve ​​srovnání s buňkami kultivovanými za statických podmínek. Tento transport byl inhibován imipraminem, což ukazuje, že aktivní transport byl přítomen za podmínek smykového napětí. Buňky vystavené smykovému napětí 2 dyny/cm² také vykazovaly zvýšení exprese RNA jak u transfekovaných lidí, tak u endogenních OCT2(3.7- a 20-násobně). Odstranění řasinek síranem amonným eliminovalo účinky smyku na transport ASP plus při 0,5 dynů/cm² bez vlivu na transport ASP plus za statických podmínek. Tyto výsledky ukazují, že smykové napětí ovlivňuje aktivní transport organických kationtů dovnitřledvinovétrubkovýepiteliální buňky způsobem závislým na řasinkách.

Cistanche je dobrý pro funkci ledvin

Úvod

Navzdory velkému pokroku v preklinických metodách výběru optimálních kandidátů na léky zůstává vývoj léků dlouhým a nákladným procesem, který má velmi nízký výtěžek nových molekulárních entit na trhu (Watkins, 2011). Hlavním nedostatkem preklinických modelů je neschopnost předpovědět clearance a toxicitu u lidí. Přibližně 30 procent léků, které jsou úspěšné v preklinických studiích, selhává u lidí v důsledku neočekávaných hodnot clearance nebo toxicity (Kola a Landis, 2004).

Ledviny jsou zvláště důležitým cílem pro modelování buněčných kultur in vitro, protože jsou zodpovědné za eliminaci více než třetiny všech léků a většiny metabolitů (Morrissey et al., 2013). Theledvinovéproximální tubulus je důležitý pro testování léků během vývoje, protože provádí většinu aktivního transportu kandidátních léků a je zvláště citlivý na toxické poškození (Giacominiet al., 2010). Theledvinovétrubičkaje monovrstva epiteliálních buněk s filtrátem proudícím přes apikální povrch. Pod tubulárním epitelem se nachází bazální membrána a přilehlé peritubulární kapiláry umožňují reabsorpci vody a salutů. Mikroprostředí proximálního tubulu, zejména smykové napětí tekutiny a apikobazální onkotické gradienty, je neúplně reprodukováno konvenčními technikami buněčné kultury. Bioreaktory epiteliálních buněk, které zachycují význačnou fyziologii in vivo, mohou zlepšit přesnost předpovědí clearance a toxicity odvozených z in vitro testů (Pfaller a Gstraunthaler, 1998; Astashkina et al., 2012).

Rostoucí důkazy naznačují, že morfologie a funkčnost buněk proximálního tubulu se může měnit s růstovým prostředím, jako je pórovitost povrchu růstu, vystavení tekutině na obou stranách a/nebo smykové napětí tekutiny. Předchozí práce Essiga a Friedlandera (2003), stejně jako z naší laboratoře (Ferrell et al. 2010), prokázaly, že přeuspořádání vyvolané průtokem tubulární tekutiny v apikálním aktinovém cytoskeletu buněk proximálního tubulu (Ferrell et al., 2010) . Následně několik studií prokázalo, že smykové napětí ovlivňuje úrovně exprese a lokalizaci mnohočetných absorpcí a efluxních transportérů, včetně sodno-vodíkového antiporteru 3. Na/K-ATPáza, glukózové transportéry, epiteliální sodíkový kanál a receptory endocytózy, megalin a tubulin (Duan et al., 2010; Raghavan et al., 2014; Jansen et al.. 2016; Ernandez et al., 2018). Jiná práce ukázala, že smykové proudění v trubkovém bioreaktorovém systému se orientuje a prodlužujeledvinovétrubkovýbuňky podél dráhy toku (Venzac et al. 2018). Důkazy in vitro naznačují, že některé změny v cytoskeletální struktuře a transportní funkci pravděpodobně souvisí s mechanosensorickou funkcí řasinek (Overgaard et al.. 2009; Raghavan et al..2014); jen málo studií však zvažovalo účinek smykového napětí na transportéry léčiv v renálních buňkách. Kromě toho je málo známo o účinku různých smykových rychlostí na funkčnost buněk, zejména při dlouhodobém vystavení smykovému napětí. Většina studií uvažovala o rychlosti jednoduchého smykového napětí a prováděla pouze krátkodobé experimenty (1-6 hodin), takže je obtížné rozlišit mezi skutečnými účinky smyku a buněčnou stresovou reakcí na náhlé změny v mikroprostředí (Duan a kol.2010;Jang a kol.2013: Maggiorani a kol.2015).

Zde byl použit mikrofluidní bioreaktor ke zkoumání vlivu odstupňovaných úrovní smykového napětí naledvinovétransportéry léčiv z buněk proximálního tubulu transportér organického kationtu 2 (OCT2) a protein 1 pro vytlačování více léčiv a toxinů (MATE1). Ukazujeme, že zvyšující se apikální smykové napětí vede ke zvýšení transportu organických kationtů a expresi transportéru a že řasinky se účastní této buněčné reakce na smykové napětí.

Materiály a metody

Výroba a montáž zařízení. Již dříve jsme publikovali náš návrh bioreaktoru s paralelními deskami, který poskytuje dráhu toku tekutiny s nastavitelnou výškou přes apikální stranu buněk a statickou nádrž na bazální straně (Brakeman et al., 2016). Pro zde prezentovanou práci jsme přizpůsobili náš předchozí návrh tak, abychom vytvořili multiplexní zařízení se čtyřmi samostatnými průtokovými cestami, které umožní testování čtyř biologických stavů najednou (obr. 1). Každé zařízení se skládá ze tří vrstev: základna s 5-ml apikálním rezervoárem, střední destička pro uložení vložky Snapwell（Costar, Corning, Corning, NY）s buněčnou plochou 1,12 cm² a horní destička obsahující 1-až 2-ml bazolaterální rezervoár. Talíře

byly vyrobeny z polysulfonu pro umožnění sterilizace autoklávováním. Laserem řezaná silikonová těsnění o výšce 500- až 1000- um byla vložena mezi každou sadu desek pro utěsnění tekutinových oddílů a na apikální straně pro definování výšky kanálu. Bioreaktor byl sestaven pomocí šroubů. Zásobník média a lapač bublin byly vestavěny do kolony. Vstupy a výstupy byly připojeny pomocí ostnatých konektorů k silikonovým hadičkám Masterflex LS14 s vnitřním průměrem 1,5{6}} mm (Cole Parmer Lab Supplies, Vernon Hills, IL). Proudění tekutiny a tím apikální smykové napětí byly nastaveny a řízeny peristaltickým čerpadlem (Cole Parmer).

Buněčná kultura a tok. MDCK buňky transfekované buď prázdným vektorem nebo párem vychytávacích a efluxních transportérů (hOCT2/hMATE1) (Konig et al..2011) poskytl Dr. Martin Fromm (Erlangen, Německo) a kultivovány v minimální základní médium s Earleovým vyváženým solným roztokem (UCSF Cell Culture Facility) s 10 procenty fetálního bovinního séra (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) a 1 procentem penicilin-streptomycinu (UCSF Cell Culture Facility). Pět set mikrogramů na mililitr hygromycinu (UCSF Cell Culture Facility) a 100 mg/hml geneticinu (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO) bylo přidáno do média pro dvojitě transfekované buňky. Pro průtokové experimenty byla hOCT2/hMATE1 MDCK buňka byly umístěny na spodní stranu vložek Snapwell (Corning) v hustotě 300,000 buněk/jamka (250,000 buněk/cm"), pěstovány za statických podmínek až do konfluence. a poté umístěny do bioreaktor. Průtok apikálního média se během 7 dnů zvyšoval z 0,1 na 1-6 ml/min, dokud nebylo dosaženo požadovaného smykového napětí, a poté se nechal stabilní 72 hodin před experimentem. Buňky byly pěstovány za statických podmínek po stejnou dobu jako kontroly .

Imunofluorescence. Buňky byly fixovány 4% paraformaldehydem (Thermo Fisher Scientific), permeabilizovány 0,1% Triton-Xin PBS (Sigma-Aldrich) a blokovány hovězím sérovým albuminem (Sigma-Aldrich). Následně byly inkubovány s 1:50 ředěním Alexa 488 značené zonula occludens{9}} myší monoklonální protilátkou (Life Technologies, Carlsbad, CA) nebo primární acetylovanou - tubulinovou myší monoklonální protilátkou (Life Technologies) po dobu 60 minut. Buňky ošetřené a-tubulinovou protilátkou byly poté inkubovány se sekundární 561 anti-myší kozí protilátkou (Life Technologies) a faloidinem (Thermo Fisher Scientific) pro barvení F-aktinem. Zobrazování bylo prováděno pomocí spektrálního konfokálního mikroskopu Nikon (Tokio, Japonsko) s olejovým objektivem 40x.

Bariérový výkon. Inulin, 5000 Da polymer, je dobře známým markerem rychlosti glomerulární filtrace a je markerem netěsnosti proximálního tubulu in vivo (Sohtell et al, 1983):

Inulin značený FITC (Sigma-Aldrich) byl přidán do apikálního média a ponechán protékat zařízeními. Vzorky byly odebírány z bazálního rezervoáru každých 24 hodin a analyzovány na obsah inulinu pomocí čtečky fluorescenčních destiček Genios Pro (Tecan, Mannedorf, Švýcarsko). Bariérová funkce buněčné monovrstvy byla vypočtena z hladin inulinu naměřených v apikálním a bazálním kompartmentu, jak je popsáno v rovnici 1. Zde je Capital koncentrace inulinu v apikálním kompartmentu a C Mal je koncentrace v bazálním kompartmentu. Únik inulinu byl vypočten jako koncentrace v bazálním (dárcovském) oddělení dělená plochou buněk po 24 hodinách.

ASP plus Transport. Transdukované transportní geny byly indukovány 10 mM Na-butyrátem (Sigma-Aldrich) 24 hodin před transportním experimentem, jak bylo popsáno dříve (Konig et al, 2011). Pokud to bylo vhodné, byly buňky inkubovány s inhibitorem (500 μM imipraminem nebo 1 mM cimetidinem (Sigma-Aldrich)) na bazální straně po dobu 30 minut, poté bylo přidáno 25 μM 4-（4-dimethylamino）- styryl-N-methyl pyridinium (ASP plus) (Life Technologies) a inkubace po dobu 1 hodiny. Vzorky byly odebrány z apikálního a bazálního média. Buňky byly poté třikrát promyty ledově chladným fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem a lyžovány pro měření ASP plus akumulace a transportu. Transportní experimenty byly současně prováděny na buňkách pod smykovým napětím a kultivovány za statických podmínek. Koncentrace ASP plus byla kvantifikována na čtečce fluorescenčních destiček Genios Pro (Tecan) při excitační vlnové délce 485 nm a emisní vlnové délce 590 nm.

Kvantifikace proteinů. Buňky byly lyžovány lyzačním pufrem 1% SDS-10M NaOH za třepání přes noc. Obsah proteinu byl měřen pomocí standardní soupravy pro stanovení proteinů Pierce BCA (Thermo Fisher). Kde to bylo vhodné, byl obsah proteinu normalizován podle oblasti buněčného růstu.

RNA exprese. RNA byla extrahována z buněk pomocí soupravy RNeasy RNA Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Německo) a cDNA byla vytvořena pomocí skriptovací soupravy (Bio-Rad, Hercules, CA). cDNA byla použita pro detekci lidských a psích OCT2 a MATE1 a psí P-glykoprotein (P-GP) kvantitativní reverzní transkriptázou-polymerázovou řetězovou reakcí za použití Tagmanova testu a sond (Applied Biosystems) na přístroji Fast Realtime PCR (Applied Biosystems). Ribozomální protein S18 (RS-18) byl použit jako kontrola domácnosti. Vliv smykového napětí na expresi transportéru byl analyzován pomocí metody 4ACt s použitím hladin transportéru vyjádřených relativně k RS-18 (Peters et al.2007; Schmittgen a Livak,2008). P-GP byl použit jako měřítko globálních účinků smykového napětí na expresi transportéru.

Deciliation. Buňky byly pěstovány do konfluence a poté inkubovány v nepřítomnosti nebo přítomnosti 30 mM síranu amonného (Fluka AG) po dobu 24 hodin před měřením ASP plus transport (Oxergard et al 2009). Přítomnost řasinek byla stanovena zobrazením a-tubulinu, jak zde již bylo popsáno.

Statistika. Všechny experimenty byly provedeny trojmo s minimálně dvěma technickými replikáty v rámci každého experimentu. Data jsou vyjádřena jako průměr ± SD a vynesena do grafu jako box a whisker grafy. Statistické analýzy byly provedeny nepárovou jednosměrnou nebo dvoucestnou analýzou rozptylu a P-hodnotou<0.05 was="" considered="" significant.="" data="" were="" analyzed="" using="" prism="" version="" 6.0="" (graphpad,="" san="" diego,="">

Výsledek

Buněčná morfologie a bariérová funkce. Nedávná analýza buněk umístěných pod tokem společnosti Immunofluo odhalila jednotnou tvorbu monovrstvy s proteinem s těsným spojením, zonula ocludens{1}}, lokalizovaným v těsných spojeních mezi buňkami za statických i průtokových podmínek (obr. 2, A–C). Kvantifikace celkového obsahu bílkovin prokázala až 1,{4}}násobné zvýšení obsahu bílkovin na čtvereční centimetr monovrstvy v reakci na smykové napětí (obr. 2D). Dále jsme měřili permeabilitu inulinu, markeru netěsnosti proximálního tubulu, přes monovrstvu. Zařízení si udržela bariérovou výkonnost 97,9 procenta 6 1,42 procenta po 7 dnech kultivace při smykovém napětí až 2 dyny/cm2 (obr. 2E), což vedlo ke konečné rychlosti úniku inulinu 6. den { {15}},13–0,69 mg/cm2 za den.

Vliv smykového napětí na transport organických kationtů. Transport ASP plus, autofluorescenčního substrátu OCT2 a MATE1, byl měřen po dobu 1 hodiny při různých úrovních smykového napětí（0.2-2 dyn/cm²）. MDCK buňky exogenně exprimující hOCT2 a hMATE1 vykázaly 4.2-násobné zvýšení ASP plus transport v reakci na smykové napětí 2 dynů/cm², jak se odráží v měření buněčné akumulace (obr. 3A) a transcelulárního transportu (obr. 3B). Účinek smykového napětí na ASP plus akumulaci nebo transcelulární transport byl podobný při smykovém napětí 0,5 a 2 dyn/cm². Aby se určilo, zda došlo ke zvýšení aktivního ASP plus transportu, byl měřen transport ASP plus buňkami vystavenými 0,2 dyn/cm smykového stresu s nebo bez předběžného ošetření 500 uM imipraminem, OCT{{20} } a MATE1-specifický inhibitor. Transport ASP plus byl inhibován imipraminem ze 60,3 procent ± 15,8 procent za podmínek smykového napětí ve srovnání se 47,6 procenty ± 19,7 procent za statických podmínek (obr. 3C).

Pro další pochopení tohoto pozorování byl měřen účinek smykového stresu na expresi lidského OCT2 (transfekovaného), psího OCT2 (endogenního) a psího P-GP (endogenního) v buňkách vystavených různým úrovním smyku po dobu 72 hodin po pomalé narůstání smyku během 7 dnů (obr. 4). Ve srovnání s buňkami kultivovanými za statických podmínek vykazovaly MDCK buňky vystavené střihu zvýšenou expresi transfekovaného lidského a endogenního OCT2 (až 3.7- a 2{11}}násobně), bez významného účinku. na expresi transfekovaného MATE1 nebo endogenního P-GP.

Role Cilie v reakci na střih. Zobrazování ukázalo, že dvojitě transfekované MDCK buňky exprimují řasinky za statických i průtokových podmínek (obr. 5, A a E). Expozice buněk 30 mM síranu amonnému po dobu 24 hodin způsobila úplnou ztrátu řasinek (obr. 5, C a G). Důležité je, že deciliace neměla žádné hrubé účinky na spojení buněčná membrána, jak bylo měřeno zobrazením F-aktinu, který ukotvuje proteiny těsného spojení na spojení buněčná membrána v epiteliálních buňkách (obr. 5.D a HD (Stevenson a Begg. 1994). Ačkoli na těchto snímcích dochází k určitému zesílení barvení F-aktinu, nebylo to konzistentní zjištění, a proto jsme tento efekt nekvantifikovali. Deciliace neměla žádný vliv na transport buňkami kultivovanými za statických podmínek. eliminoval účinky smykového napětí na ASP plus transport v buňkách vystavených 0,5 dyn/cm² smyku (obr. 6).

Diskuse

Ledviny hrají ústřední roli při eliminaci léčiv v lidském těle. Je důležité přesně napodobit složitost renální fyziologie pro testování léčiv in vitro, zejména s ohledem na průtok tekutin. Bylo prokázáno, že smykové napětí z proudění tekutiny ovlivňuje buněčnou morfologii a iontové transportéry in vitro, ale o účincích na lékové transportéry je známo jen málo (Duan et al., 2010; Ferrell et al., 2012; Jansen et al., 2016). . Většina předchozích studií navíc měřila pouze účinek krátkodobého smyku (1-6 hodin), který pravděpodobně plně izoluje účinky smykového napětí od jiných buněčných stresových reakcí (Duan et al..2010; Jang et al. 2013; Maggiorani et al..2015). V těchto studiích jsme se zaměřili na účinky trvalého (7 dní) smykového napětí z proudění tekutiny na transport léčiva, abychom lépe napodobili trvalé smykové napětí, které zažívajíledvinovétrubkovýbuňky in vivo.

Pochopení toho, jak lékové transportéry reagují na trvalé smykové napětí, může zlepšit in vitro předpovědi in vivo manipulace s lékem ledvinami. Přesně navržené in vitro modely ledvin mohou standardizovat preklinické testování a snížit míru selhání léků.

V této práci byl mikrofluidní bioreaktor s paralelními deskami použit ke stanovení účinků trvalého smykového napětí na transport organických kationtů pomocí OCT2 a MATE1 vledvinovétrubičkabuněčná linie. Pro tyto studie bylo zvažováno několik buněčných linií, včetně lidských buněčných linií, jako jsou buňky lidských proximálních tubulů ze skupiny Hopfer (Orosz et al, 2004) a RPTECs (CRL-4031: American Type Culture Collection, Manassas, VA)( Wieser et al., 2008), ale dvakrát transfekované buňky hOCT2/hMATE1 MDCK byly považovány za nejvhodnější volbu pro tuto studii z několika důvodů. Za prvé, buňky MDCK důsledně demonstrují robustní připojení k vložkám transwell, což jim umožňuje odolat počátečnímu stresu proudění tekutiny. Za druhé, tyto buňky tvoří těsné monovrstvy, což zabraňuje prosakování a je nezbytné pro studium transcelulárního transportu markerových substrátů. A konečně, exogenní exprese transportérů umožňuje lepší detekci aktivního transportu a účinku poruch.

Buňky umístěné pod tokem vytvořily konfluentní monovrstvu a lokalizovaly protein těsného spojení na periferii buňky. Zachovaly si také vysokou bariérovou funkci měřenou permeabilitou inulinu. Pro správnou funkci tubulu je nesmírně důležitá schopnost epiteliálních buněk tvořit monovrstvu, která zabraňuje úniku tekutin a bílkovin. Zde byl únik přes buňky MDCK minimální, méně než 1 ug/cm² za den a výrazně nižší než přes lidské buňky. Již dříve jsme ukázali, že monovrstvy buněk lidských ledvin mají únik inulinu 10-20 ug/cm² za den (Brakeman et al., 2016), což podporuje závěr, že buňky hOCT2/hMATE1 MDCK vytvořily robustní monovrstvu.

Transport ASP plus byl významně zvýšen u buněk hOCT2/hMATE1 MDCK vystavených různým úrovním smykového napětí po dobu 72 hodin ve srovnání se statickými kontrolami. ASP plus je přijímán OCT2 (SLC22A2) a efluxován MATE1 (SLC47A1), dvěma transportéry organických kationtů, které spolupracují, aby usnadnilyledvinovésekrece běžně používaných léků, jako je metformin a cisplatina (Biermann et al. 2006; Wittwer et al. 2013). Podobné účinky smykového napětí byly popsány u transportérů iontů v proximálních tubulech. Zvýšení vychytávání albuminu, reabsorpce iontů a exprese a funkce megalinu a tubulinu byly hlášeny v reakci na zvýšený smykový stres (Overgaard et al..2009; Duan et al.2010: Ferrell et al..2012:Raghavan et al., 2014). VystaveníledvinovéSmykové napětí buněk proximálního tubulu je také spojeno se sníženou apoptózou a rychlejším zotavením z akutní toxicity cisplatiny a zvýšenou inhibicí transportu organických aniontů (Jang et al.2013). Vzhledem k tomu, že v proximálním tubulu je neustále přítomno smykové napětí z proudění tekutiny, tato zjištění společně podporují použití více fyziologických in vitro modelových systémů k predikci renální dispozice léčiva a toxicity. Je pozoruhodné, že mezi 0,5 a 2.0 dynů/cm² smykového napětí není žádný významný rozdíl ve funkci transportéru. Předchozí studie Essiga a Friedlandera (2003) zjistily, že k vyvolání změny morfologie buněk je zapotřebí minimální úroveň smyku 0,17 dynů/cm2 a další studie měřily účinky na fyziologie při až 1 dyne/cm²（Duan et al.,2010）. Toto je první studie, která zkoumá účinky řady vyšších a trvalých úrovní smykového napětí na funkčnost renálních transportérů léčiv a je možné, že velikost biologického rozdílu mezi smykovým napětím 0,5 a 2,0 dyn/cm² hodnocená nebyla dostatečně velká, aby umožnila identifikaci rozdílů mezi těmito úrovněmi smykového napětí v našich testech. Ačkoli je zapotřebí další zkoumání, naše výsledky osvětlují požadované podmínky pro fyziologicky relevantní modely a účinky zvýšené úrovně smykového napětí způsobeného onemocněním na renální manipulaci s léčivem.

Jedním z omezení našich experimentálních metod je, že jsme řešili transport pouze při pH 7,4 pomocí média s pH 7,4 na apikální i bazální straně napodobující experimentální metody dříve popsané pro buňky hOCT2/hMATE1 MDCK (Konig et al..2011). Apikální až bazální gradient pH může ovlivnit funkci OCT2 a MATE1 a obvykle existuje gradient pH za fyziologických podmínek (Muller et al., 2013). Naše metody proto omezily naši schopnost hodnotit interakci mezi apikálním a bazálním pH gradientem a smykovým napětím na funkci OCT2 a MATE1. Protože jsme použili konzistentní pH 7,4 ve všech experimentálních podmínkách, je nepravděpodobné, že by tento nedostatek gradientu pH ovlivnil naše zjištění, ale potenciálně omezuje použitelnost našich zjištění na transport OCT2 a MATE1 v přítomnosti apikálního až bazálního gradientu pH.

Překvapivě byla exprese mRNA transfekovaného lidského a endogenního OCT2 zvýšena v buňkách vystavených všem úrovním smykového stresu ve srovnání se statickými kontrolami. Tato upregulace exprese transportéru byla specifická, bez měřitelného účinku na endogenní expresi P-GP nebo transfekovaný MATE1. Upregulace exprese transportéru umožňuje nahlédnout do mechanismu za zvýšeným transportem a může být výsledkem zvýšené stability mRNA nebo zvýšené transkripce mRNA. Je zajímavé poznamenat, že jak transfekované, tak endogenní transportéry byly upregulovány, což je neočekávané, protože transfekovaný OCT2 byl exprimován pod cytomegalovirovým promotorem a neměl by podléhat regulačním mechanismům endogenní genové exprese. I když je toto pozorování překvapivé, není bezprecedentní. Byl popsán podobný účinek na buňky proximálního tubulu transfekované OAT1 vystavené perfuzi, ale mechanismus zvýšené exprese zůstává nejasný (Jansen et al., 2016). V jiné studii bylo zjištěno, že signalizace Nrf2 hraje roli při zvyšování endogenní exprese MATE2-K v reakci na smykový stres (Fukuda et al., 2017). Další studium této problematiky je oprávněné a bude předmětem budoucího vyšetřování.

Také jsme zjistili, že zavedení apikálního smykového toku zvýšilo obsah proteinu na čtvereční centimetr buněk. Tento účinek byl stejně velký pro 0,5 a 2 dyn/cm² střihu, podobný účinku pozorovanému pro expresi mRNA a transport ASP plus. Existují určité důkazy, že smykové napětí vyvolává vyššíledvinovéepiteliální buňky, což by vedlo k většímu objemu buněk na centimetr čtvereční, a tedy pravděpodobnému zvýšení proteinu na centimetr čtvereční; tento dříve publikovaný jev však byl pouze drobným pozorováním ve větším množství dat a nebyl kvantifikován (Long et al., 2017). Zvýšení celkového proteinu v buňkách pěstovaných v přítomnosti apikálního smykového toku může představovat normální obsah proteinu pro zdravéledvinovétrubkovýepiteliálních buněk, kterých lze dosáhnout pouze vystavením buněk apikálnímu smykovému toku. Proto mohou nižší hladiny obsahu proteinu v buňkách pěstovaných ve statické kultuře představovat abnormální buněčný stav, který by se mohl klinicky vyskytnout v situacích nízkého apikálního toku filtrátu, jako je akutní poškození ledvin. Tento fenomén si zaslouží další studium.

Je známo, že řasinky mají v proximálním tubulu mechanosensorické role (Raghavan a Weisz,2016). Aby bylo možné určit, zda hrají kritickou roli ve zvýšeném transportu zprostředkovaném OCT2 a MATE1-, který je zde uváděn, byl měřen účinek odstranění řasinek na funkci transportéru. Úplná blokáda střihově závislého zvýšení ASP plus transport odstraněním řasinek v našich studiích je podobná účinku zjištěnému ve studiích Raghavana et al. (2014), kteří prokázali upregulaci endocytózy závislou na řasinkách v reakci na průtok tekutiny. Síran amonný má pravděpodobně další necharakterizované účinky na chování a funkčnost buněk, které mohou nepřímo ovlivnit transport rozpuštěné látky. Navzdory možným účinkům mimo cíl testuje tato metoda deciliace roli ciliárního snímání na transportem zprostředkovaný pohyb organických rozpuštěných látek. Mechanismus signalizace mezi mechanicko-senzorickými proteiny v řasinkách a transportérem není v současné době znám. Jednou z hypotéz je, že funkce přenašečů organických kationtů se mění změněným transportem iontů. Je známo, že odstranění řasinek mění motilitu solutu v buňkách proximálního tubulu, konkrétně snížením Nat/K plus. Lokalizace membrány ATPázy a modifikace paracelulárního transportu (Overgaard et al., 2009). Je možné, že to povede ke změnám ve funkci MATE1, antiporteru závislém na H gradientu. Další hypotézou je, že snímání smykového napětí ovlivňuje expresi přenašečů organických kationtů. Smykové napětí moduluje funkci MATE2-K prostřednictvím signalizace Nrf2 (Fukuda et al., 2017). Ostatní transportéry organických kationtů mohou reagovat podobně na smykové napětí, které by bylo eliminováno odstraněním mechanosenzorických řasinek. Mnoho z toho není známo a vyžaduje další studium. Je zajímavé, že odstranění řasinek nemělo významný vliv na ASP plus transport buňkami vystavenými 0,2 dyn/cm² smykového napětí, ale silný účinek byl pozorován, když bylo smykové napětí zvýšeno na 0,5 dyn/cm2. To naznačuje, že řasinky cítí prahovou úroveň smykového napětí; naopak, změny signálu řasinek v expresi a funkci transportéru před očekávanými měřitelnými účinky na transport. Celkově závislost transportu organických kationtů na ciliárním snímání smykového napětí poskytuje pohled na zapojenou mechanosensorickou signální dráhu a minimální úroveň stresu, která může být vyžadována ke spuštění robustní reakce na smyk.

V souhrnu tato data ukazují, že smykové napětí z proudění tekutiny má významný vliv na funkci přenašeče organických kationtů a expresi v buňkách MDCK. Kromě toho byla upregulace transportu organických kationtů závislá na přítomnosti řasinek. Navrhujeme, že apikální smykové napětí je důležitou součástí jakéhokoli modelování in vitroledvinovétrubkovýa pravděpodobně je důležitou složkou modelování renální sekreční clearance a nefrotoxicity léčiv. Specifický mechanismus, kterým signály mechanického stresu zvyšují aktivitu a expresi transportéru, je stále nejasný a vyžaduje další studium.

Reference

Astashkina A, Mann B a Grainger DW (2012) Kritické hodnocení modelů buněčných kultur in vitro pro vysoce výkonný screening a toxicitu léků. Pharmacol Ther 134:82–106.

Biermann J, Lang D, Gorboulev V, Koepsell H, Sindic A, Schröter R, Zvirbliene A, Pavenstädt H, Schlatter E a Ciarimboli G (2006) Charakterizace regulačních mechanismů a stavů lidského transportéru organických kationtů 2. Am J Physiol Cell Physiol 290:C1521-C1531.

Brakeman P, Miao S, Cheng J, Lee CZ, Roy S, Fissell WH a Ferrell N (2016) Modulární mikrofluidní bioreaktor se zlepšenou propustností pro hodnocení polarizovaných renálních epiteliálních buněk. Biomicrofluidics 10:064106.

Duan Y, Weinstein AM, Weinbaum S a Wang T (2010) Smykovým stresem indukované změny lokalizace a exprese membránového transportéru v buňkách myších proximálních tubulů. Proč Natl Acad Sci USA 107:21860–21865.

Ernandez T, Udwan K, Chassot A, Martin PY a Feraille E (2018) Union nefrektomie a smykové napětí apikální tekutiny snižují množství ENaC v hlavních buňkách sběrného kanálku. Am J Physiol Renal Physiol 314:F763–F772.

Essig M a Friedlander G (2003) Tubulární smykové napětí a fenotyp renálních proximálních tubulárních buněk. J Am Soc Nephrol 14 (Suppl 1): S33–S35.

Ferrell N, Desai RR, Fleischman AJ, Roy S, Humes HD a Fissell WH (2010) Mikrofluidní bioreaktor s integrovanými elektrodami pro měření transepiteliálního elektrického odporu (TEER) pro hodnocení renálních epiteliálních buněk. Biotechnol Bioeng 107:707-716.

Ferrell N, Ricci KB, Groszek J, Marmerstein JT a Fissell WH (2012) Manipulace s albuminem renálními tubulárními epiteliálními buňkami v mikrofluidním bioreaktoru. Biotechnol Bioeng 109:797-803.

Ferrell N, Ricci KB, Desai RR, Groszek J, Marmerstein JT a Fissell WH (2012) Mikrofluidní bioreaktor pro studie epiteliálních buněk pod napětím ve smyku tekutin. FASEB J 26:911,3.

Fukuda Y, Kaishima M, Ohnishi T, Tohyama K, Chisaki I, Nakayama Y, Ogasawara-Shimizu M a Kawamata Y (2017) Fluidní smykový stres stimuluje expresi MATE2-K prostřednictvím aktivace dráhy Nrf2. Biochem Biophys Res Commun 484:358-364.

Giacomini KM, Huang SM, Tweedie DJ, Benet LZ, Brouwer KLR, Chu X, Dahlin A, Evers R, Fischer V, Hillgren KM a kol.; International Transporter Consortium (2010) Membránové transportéry ve vývoji léků. Nat Rev Drug Discov 9: 215–236.

Jang KJ, Mehr AP, Hamilton GA, McPartlin LA, Chung S, Suh KY a Ingber DE (2013) Proximální tubul v lidské ledvině na čipu pro transport léčiv a hodnocení nefrotoxicity. Integr Biol 5:1119-1129.

Jansen J, Fedecostante M, Wilmer MJ, Peters JG, Kreuser UM, van den Broek PH, Mensink RA, Boltje TJ, Stamatialis D, Wetzels JF a kol. (2016) Bioinženýrské ledvinové tubuly účinně vylučují uremické toxiny. Sci Rep 6:26715.

Kola I a Landis J (2004) Může farmaceutický průmysl snížit míru opotřebení? Nat Rev Drug Discov 3:711–715.

König J, Zolk O, Singer K, Hoffmann C a Fromm MF (2011) Dvojitě transfekované MDCK buňky exprimující lidský OCT1/MATE1 nebo OCT2/MATE1: determinanty vychytávání a transcelulární translokace organických kationtů. Br J Pharmacol 163:546-555.

Long KR, Shipman KE, Rbaibi Y, Menshikova EV, Ritov VB, Eshbach ML, Jiang Y, Jackson EK, Baty CJ a Weisz OA (2017) Apikální endocytóza proximálního tubulu je modulována smykovým napětím tekutiny prostřednictvím dráhy závislé na mTOR. Mol Biol Cell 28:2508-2517.

Maggiorani D, Dissard R, Belloy M, Saulnier-Blache JS, Casemayou A, Ducasse L, Grès S, Bellière J, Caubet C, Bascands JL a kol. (2015) Smykovým stresem indukovaná změna epiteliální organizace v lidských renálních tubulárních buňkách. PLoS One 10:e0131416.

Morrissey KM, Stocker SL, Wittwer MB, Xu L a Giacomini KM (2013) Renální transportéry ve vývoji léků. Annu Rev Pharmacol Toxicol 53:503–529.

Müller F, König J, Hoier E, Mandery K a Fromm MF (2013) Role organického kationtového transportéru OCT2 a proteinů MATE1 a MATE2-K vytlačování více léčiv a toxinů pro transport a lékové interakce antivirového lamivudinu. Biochem Pharmacol 86:808–815.

Orosz DE, Woost PG, Kolb RJ, Finesilver MB, Jin W, Frisa PS, Choo CK, Yau CF, Chan KW, Resnick MI a kol. (2004) Růst, imortalizace a diferenciační potenciál normálních dospělých lidských buněk proximálního tubulu. In Vitro Cell Dev Biol Anim 40:22–34.

Overgaard CE, Sanzone KM, Spiczka KS, Sheff DR, Sandra A a Yeaman C (2009) Deciliace je spojena s dramatickou remodelací spojení epiteliálních buněk a povrchových domén. Mol Biol Cell 20:102-113.

Peters IR, Peeters D, Helps CR a Day MJ (2007) Vývoj a aplikace vícenásobných interních referenčních (housekeeper) genových testů pro přesnou normalizaci studií exprese psích genů. Vet Immunol Immunopathol 117:55–66.

Pfaller W a Gstraunthaler G (1998) Testování nefrotoxicity in vitro--co víme a co potřebujeme vědět. Environ Health Perspect 106 (Suppl 2): ​​559–569.

Raghavan V, Rbaibi Y, Pastor-Soler NM, Carattino MD a Weisz OA (2014) Regulace apikální endocytózy v buňkách renálního proximálního tubulu zprostředkovaná primární řasinkou závislá na smykovém stresu. Proč Natl Acad Sci USA 111:8506–8511.

Raghavan V a Weisz OA (2016) Rozlišování role mechanosensory při regulaci funkce proximálního tubulu. Am J Physiol Renal Physiol 310:F1–F5.

Schmittgen TD a Livak KJ (2008) Analýza dat PCR v reálném čase srovnávací metodou C(T). Nat Protoc 3:1101–1108.

Sohtell M, Karlmark B a Ulfendahl H (1983) FITC-inulin jako marker ledvinových tubulů u krys. Acta Physiol Scand 119:313–316.

Stevenson BR a Begg DA (1994) Účinky cytochalasinu D závislé na koncentraci na těsná spojení a aktinová vlákna v epiteliálních buňkách MDCK. J Cell Sci 107: 367-375.

Venzac B, Madoun R, Benarab T, Monnier S, Cayrac F, Myram S, Leconte L, Amblard F, Viovy JL, Descroix S a kol. (2018) Konstrukce malých zkumavek se změnami průměru pro studium organizace ledvinových buněk. Biomicrofluidics 12: 024114.

Watkins PB (2011) Vědy o bezpečnosti léčiv a překážka ve vývoji léčiv. Clin Pharmacol Ther 89:788-790.

Wieser M, Stadler G, Jennings P, Streubel B, Pfaller W, Ambros P, Riedl C, Katinger H, Grillari J a Grillari-Voglauer R (2008) samotný hTERT imortalizuje epiteliální buňky proximálních tubulů ledvin bez změny jejich funkčních charakteristik. Am J Physiol Renal Physiol 295:F1365–F1375.

Wittwer MB, Zur AA, Khuri N, Kido Y, Kosaka A, Zhang X, Morrissey KM, Sali A, Huang Y a Giacomini KM (2013) Objev silných, selektivních multidrogových a toxinových extruzních transportérů 1 (MATE1, SLC47A1) inhibitorů prostřednictvím profilování léků na předpis a výpočetního modelování. J Med Chem 56:781-795.