Izolace a kvantifikace Ginsenosidu Rh23, nové antimelanogenní sloučeniny z listů Panax Ginseng

Abstraktní:

Nový ginsenosid s názvem ginsenosid Rh23 (1) a 20-O- -D-glukopyranosyl-3 ,6 , 12 ,20 ,25-pentahydroxydammar-23-en (2) byly izolovány z listů hydroponického ženšenu Panax. Sloučeniny byly izolovány pomocí různých sloupcových chromatografií a jejich struktury byly stanoveny na základě spektroskopických metod, včetně kvadrupólové hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením/doba letu (HR-QTOF/MS), nukleární magnetické rezonance (NMR) a infračervené (IR) spektroskopie. . Pro stanovení antimelanogenní aktivity byla testována změna obsahu melaninu v Melan-a buňkách ošetřených identifikovanými sloučeninami.

Kromě toho jsme zkoumali inhibiční účinky ginsenosidu Rh23 na melanin na pigmentaci v modelu zebrafish in vivo. Sloučenina 1 inhibovala silnou melanogenezi v melan-a buňkách s 370 procenty inhibice melanogeneze při 80 µM a také vykazovala inhibici pigmentace těla v modelu zebrafish. Ačkoli sloučenina 2 vykazovala mírně nižší inhibiční aktivitu než sloučenina 1, vykazovala také významně sníženou melanogenezi v buňkách Melan-a a modelu zebrafish. Tyto výsledky ukázaly, že sloučeniny izolované z hydroponického P. ginseng mohou být použity jako nové sloučeniny pro bělení kůže prostřednictvím systémů in vitro a in vivo. Kromě toho tato studie prokázala užitečnost sloučeniny 1 na bázi MS pro kvantitativní analýzu. Ginsenosid Rh23 (1) byl nalezen v hladině 0,31 mg/g v listech hydroponického P. ginseng.

U melaninu jsme zjistili, že Cistanche může významně snížit aktivitu tyrosinázy, která je hlavním enzymem omezujícím rychlost v biosyntéze kožního melaninu a je komplexem mědi a bílkovin. Může hydroxylovat tyrosin, hlavní surovinu pro produkci melaninu v těle, produkovat L-dopa a poté oxidovat dopa na dopachinon. Dopachinon prochází řadou metabolických procesů, přeskupuje a polymerizuje a nakonec se spojuje s proteiny a vytváří řadu melaninových pigmentů, které způsobují hnědnutí. Melanin je nejdůležitějším faktorem při určování barvy kůže lidského těla. Nadměrná syntéza může způsobit tvorbu pigmentových kožních onemocnění, jako jsou pihy, chloasma, stařecké skvrny a melanom. Díky výzkumu inhibice aktivity tyrosinázy mohou být proto vyřazeny účinné složky pro inhibici pigmentace kůže, takže lze vidět, že celkové glykosidy Cistanche deserticola mají účinek na inhibici pigmentace kůže a bělení krásy.

Klikněte na dávkování produktu cistanche

klíčová slova:

ginsenosid Rh23; Panax ginseng; NMR; UPLC-QTOF/MS; zebrafish; kvantitativní analýza.

1. Úvod

Panax ginseng CA Meyer je velmi známá tradiční léčivá bylina v asijských zemích. Panax pochází z „všeléku“, což znamená všelék na nemoci. P. ginseng je vytrvalá bylina patřící do čeledi Araliaceae [1]. K léčebným účelům se využívají především čtyřleté až šestileté kořeny P. ginseng. Květy kvetou v červnu a listy mají tvar patra. P. ginseng byl pěstován hlavně ve východní Asii, včetně Koreje, Číny a Japonska [2]. K dnešnímu dni bylo popsáno mnoho studií o chemických složkách kořenů, listů a bobulí ženšenu; bylo izolováno více než 100 druhů ginsenosidů. Byly popsány různé bioaktivity P. ginseng, jako je zvýšení imunomodulační aktivity, nutriční fortifikace, zlepšení jaterních funkcí, antidiabetické, protirakovinné, antiapoptotické a antioxidační aktivity [3–10].

V současné době se postupně zvyšuje zájem o vysoce kvalitní zemědělské produkty související s blahobytem, ​​což vede k hydroponickému pěstování ženšenu. Hydroponické pěstování má výhody jednoduchého kultivačního procesu a kratší dobu růstu než kultivace půdy. Hydroponický ženšen potřebuje pouze 2–4 měsíce v systému, který kontroluje teplotu, je bez pesticidů, je vlhký, lehký, má organické složky atd. [11]. Listy ženšenu pěstovaného v půdě se nepoužívají pro léčebné účely a funkční zeleninu, zatímco listy hydroponického ženšenu lze použít.

In a previous study, the contents and composition of ginsenosides in different parts, such as leaves, roots, and fruits of ginseng, were investigated after a short-term hydroponic system [12]. The total ginsenoside content of the ginseng leaves was found to be significantly higher at 15.30%, while the content of the ginseng roots was at 1.27%. Additionally, the contents of the major ginsenosides components produced in the ginseng leave cultured in the hydroponic system were observed in the order of Rg1 > Rd > Re > Rc > Rb2 > Rg2 >Rb1 > Rh1 > Rf [11]. Hydroponické podmínky vedly k vysokému obsahu ginsenosidu a celkový obsah ginsenosidu v listech byl výrazně vyšší než v kořenech, což naznačuje, že listy ženšenu mohou být dobrým zdrojem funkční zeleniny a léčivých bylin.

Několik známých bělících sloučenin, jako je arbutin a kyselina kojová, bylo zkoumáno pro jejich účinnost při snižování melanogeneze [13]. Bohužel je nutné najít bezpečnější a účinnější prostředky na bělení kůže, a to kvůli karcinogennímu potenciálu kyseliny kojové a jak bezpečnosti, tak vedlejším účinkům arbutinu [14]. Díky tomu je neustále věnována velká pozornost vývoji nových přírodních produktů v kosmetickém průmyslu [15,16]. Několik studií uvádí inhibici syntézy melaninu z P. ginseng pěstovaného v půdě [17–20].

Tyto studie však byly hlášeny s dobře známými sloučeninami, jako je kyselina skořicová a fenolické sloučeniny, a bělící aktivita nebyla hlášena z listů hydroponického P. ginseng (HPGL). Naše pokračující práce vedla k izolaci minoritních ginsenosidů z HPGL. Obvykle nelze pomocí HPLC detekovat ginsenosidy v malých nebo stopových množstvích. Jinak je analytická doba velmi dlouhá, což není vhodné pro kvalifikaci ginsenosidů v koření ženšenu [21,22]. Pro rychlou kvantifikaci nových sloučenin by měla být vytvořena rychlá a citlivá metoda, která dokáže důkladně detekovat stopová množství nových sloučenin. V této studii byla pro kvantifikaci nové sloučeniny zavedena citlivá ultravysokoúčinná kapalinová chromatografie spojená s metodou hmotnostní spektrometrie kvadrupól/čas letu (UPLC-QTOF-MS).

Na základě výše uvedeného popisu byla v této práci odhalena izolace a identifikace nové sloučeniny, včetně fyzikálních vlastností a kvantifikace, spektroskopickými metodami a jejich antimelanogenní aktivity byly zkoumány prostřednictvím systémů in vitro a in vivo.

2. Výsledky a diskuse

Listy hydroponického Panax ginseng (HPGL) byly extrahovány vodným MeOH a rozděleny do frakcí ethylacetátu (EtOAc), n-butanolu (n-BuOH) a H20. Opakované Si02 a ODS sloupcové chromatografie n-BuOH frakce poskytly jeden nový ginsenosid (1) a jeden vzácný ginsenosid (2) byl izolován z EtOAc frakce HPGL.

Sloučenina 1, bílý prášek (methanol), vykazovala fialovou barvu na TLC postřikem 10 procent H2SO4 a zahřátím. Molekulární vzorec byl určen jako C37H64O10 z píku kvazimolekulárního iontu m/z 713,44723 [M plus COOH]- v negativním QTOF/MS. IR spektrum naznačovalo přítomnost hydroxylové skupiny (3377 cm-1 ) a dvojné vazby (1647 cm-1 ). 1H-NMR spektrum (tabulka 1 a doplňkové materiály) ukázalo dva protonové signály olefinu methinu (5H 6,02, 5,64), tři signály protonů okysličeného methinu (8H 4,38, 4,03, 3,49), jeden signál protonu methoxy (5H 3,18), a singletové methyl protonové signály (5H 1,94, 1,55, 1,43, 1,33, 1,31, 1,14, 1,04, 0,92), což naznačuje, že sloučenina 1 má tetracyklickou triterpenovou skupinu obsahující jednu dvojnou vazbu s trans konformací a tři hydroxylové skupiny.

Dále bylo potvrzeno, že sloučenina 1 je typu protopanaxatriolu (PPT) z chemického posunu methyl protonového signálu při 5H 1,94 (H-28). Chemický posun H-28 v typu protopanaxadiolu (PPD) je obvykle pozorován při cca δH 1,30 [23]. Dále byl pozorován hemiacetalový protonový signál (δH 5,15) a několik okysličených methinů a methylenový protonový signál na δH 4,45–3,95 jako signály cukerné skupiny. Z interakční konstanty protonového signálu anomeru (J=7,6 Hz) byly jak hemiacetalový proton, tak H-2 cukerné skupiny v axiálním uspořádání. Kombinace výše uvedených dat dospěla k závěru, že sloučenina 1 je protopanaxatriol aminoglykosid. 13C-NMR spektrum vykazovalo 37 uhlíkových signálů v důsledku triterpenových, methoxylových a hexózových skupin. Dva olefinové methinové uhlíky (δC 138,5 (C-24), 126,8 (C-23)), jeden okysličený kvartérní uhlík (δC 74,9 (C-25)), tři okysličené methinové uhlíky (δC 78,5 (C-3), 7{{90}},3 (C-12), 67,7 (C-6)), jeden methoxy uhlík (δC 50,2 ( 25-OCH3)) a osm methylových uhlíků (δC 31,9 (C-28), 26,3 (C-27), 26,1 (C-26), 23,0 (C{{ 57}}), 17,6 (C-18), 17,4 (C-19), 17,3 (C-30), 16,4 (C-29)) byly pozorovány pro aglykonová část. Údaje NMR sloučeniny 1 byly podobné údajům sloučeniny 2, s výjimkou chemického posunu pro okysličený kvartérní uhlík, tj. C-25. Kromě toho byl cukr identifikován jako -glukopyranóza z uhlíkových signálů hemiacetal (δC 98,3, (C-10)), čtyři okysličené methiny (δC 78,9 (C-30), 78,2 (C{{82 }}), 75,2 (C-20), 71,6 (C-40)) a jeden okysličený methylen (δC 63,0 (C-60)). Ve spektrech gradientní korelace heteronukleárních mnohočetných vazeb (gHMBC) byla pozorována korelace na dlouhé vzdálenosti mezi anomerním protonovým signálem (δH 5,15 (H-10 )) a signálem okysličeného kvartérního uhlíku aglykonu (δC 83,0 (C -20)), což ukazuje, že -glukopyranóza byla navázána na hydroxyl C-20 (obrázek 1).

Kromě toho korelace mezi protonovým signálem methoxy (δH 3,18 (25-OCH3)) a signálem okysličeného kvartérního uhlíku (δc 74,9 (C-25)) ukázala, že methoxy byl navázán na C{{ 7}} (obrázek 1). Na základě výše uvedených údajů byla chemická struktura 1 určena jako 20-O- -D-glukopyranosyl-3 ,6 ,12 ,20 -tetrahydroxy-25- methoxydammar-23-en a pojmenovaný jako ginsenosid Rh23. Sloučenina 2 byla ze srovnání NMR a MS data s těmi uvedenými v literatuře [23,24] (obrázek 1). Sloučeniny 1 a 2 byly poprvé izolovány z HPGL.

Čistota ginsenosidu Rh23 byla stanovena jako více než 99 procent normalizací ploch píku detekovaných analýzou UPLC. Protože se UPLC-OTOF/MS osvědčilo jako vhodný nástroj pro identifikaci ginsenosidu Rh23, separace složek v HPGL extraktu byla provedena pomocí UPLC-OTOF/MS v režimu negativních iontů. Obrázek 2 ukazuje typický celkový iontový chromatogram (TIC) ginsenosidu Rh23 a extraktu s hmotnostní detekcí.

Lineární kalibrační křivka byla získána pro ginsenosid Rh23 při různých úrovních koncentrace. Charakteristiky kalibračních grafů jsou shrnuty v tabulce 2. Jak je vidět z tabulky, ginsenosid Rh23 vykazuje vynikající korelační koeficienty. Počty detektorů (relativní plocha píku) byly lineárně závislé na koncentraci vzorku v rozsahu 0.02–0,8 µg/ml pro ginsenosid Rh23. LOD ginsenosidu Rh23 bylo 0.{18}}02 ppm. LOQ ginsenosidu Rh23 byly stanoveny na 0,005 ppm pomocí UPLC-QTOF/MS v režimu negativních iontů. Množství ginsenosidu Rh23 v HPGL získané pomocí validačních metod (tabulka 2) bylo 0,319 mg/g.

Pro stanovení antimelanogenní aktivity byla studována změna obsahu melaninu v melan-a buňkách ošetřených purifikovanými a identifikovanými sloučeninami. Buňky Melan-a byly ošetřeny po dobu 72 hodin sloučeninami 1 a 2 v koncentracích v rozmezí od 0 do 80 uM a životaschopnost buněk byla hodnocena pomocí soupravy pro stanovení viability buněk CCK-8. Buněčná životaschopnost sloučenin 1 a 2 při 80 uM koncentraci pro melan-a buňku byla více než 98,1 procent a 97,8 procent, v daném pořadí (data neuvedena). Tyto výsledky ukázaly, že sloučeniny 1 a 2 mají necytotoxickou povahu. Účinek antimelanogenních aktivit sloučenin je znázorněn na obrázku 3. Inhibice syntézy melaninu sloučeniny 1 při 20, 40 a 80 uM byla 8,4 procenta, 15,6 procenta a 37,0 procenta ve srovnání s kontrolou. Sloučenina 2 vykazovala mírně nižší inhibiční aktivitu než sloučenina 1 při 7,6 procentech, 12,8 procentech a 17,8 procentech při 20, 40 a 80 uM, v daném pořadí. Obě sloučeniny inhibovaly syntézu melaninu způsobem závislým na dávce.

Je pozoruhodné, že sloučenina 1 vykazovala nejvyšší inhibiční aktivitu na melanin, 37.0 procent při koncentraci 80 uM. Údajně extrakt z radix ginseng v 0–1000 µg/ml nevykazoval žádnou významnou inhibici melaninu [19] a kyselina skořicová, bělící činidlo, které se vyskytuje hlavně v P. ginseng, vykazovalo 29procentní inhibici syntézy melaninu při 675 µM [20]. Ve srovnání s extraktem z radix ginseng a kyseliny skořicové vykazovala sloučenina 1 silnou inhibiční aktivitu na syntézu melaninu, a dokonce vykazovala 1.2-krát vyšší inhibiční aktivitu syntézy melaninu při osmkrát nižší koncentraci ve srovnání s kyselinou kumarovou [ 17,20].

Zebřička je velmi výhodný modelový organismus obratlovců, protože má podobné orgánové systémy a genové sekvence jako lidské bytosti [25]. Kromě toho se stále větší pozornosti věnuje použití embryí zebrafish, protože jsou považovány za náhradní metodu pro pokusy na zvířatech [26]. Zebřičky mají na povrchu melaninové pigmenty, což umožňuje jednoduché pozorování procesu pigmentace bez složitých experimentálních postupů [27].

Zkoumali jsme tedy inhibiční účinky sloučeniny 1 na melanin na pigmentaci zebřiček. Jako pozitivní kontrolu jsme použili PTU (N-fenylthiomočovinu; inhibitor tyrozinázy obsahující síru) (obrázek 4B), který je široce používán ve výzkumu zebřiček [28,29]. Jak je znázorněno na obrázku 4C, D, 40 a 80 uM ošetření sloučeninou 1 vedlo k významné inhibici pigmentace těla zebřičky, což výrazně snížilo celkový obsah melaninu ve srovnání s kontrolním vehikulem (obrázek 4A).

V této studii jsme izolovali nový ginsenosid Rh23 (1) z hydroponických listů P. ginseng. Dosud bylo z druhů ženšenu hlášeno více než 100 ginsenosidů. 25-hydroxylované ginsenosidy se však v přírodě vyskytují zřídka, včetně rostlin ženšenu. Navíc nebyla hlášena bělící aktivita. Inhibiční aktivita ginsenosidu Rh23 vykazovala 37 procent při koncentraci 80 uN bez buněčné cytotoxicity v buňkách melan-a, zatímco u ginsenosidu Rh23 nebyla pozorována žádná inhibice aktivity houbové tyrosinázy in vitro (data neuvedena). Nedávno bylo prokázáno, že extrakty nebo purifikované ginsenosidy z kořenů a listů ženšenu mají široce antioxidační vlastnosti (30, 31), zatímco voda nebo organický extrakt ženšenu vykazoval vychytávky vůči DPPH, superoxidovému aniontu a hydroxylovým radikálům (32). Proto náš nový ginsenosid Rh23 izolovaný z listů hydroponického P. ginseng může mít díky své antioxidační vlastnosti down-regulovanou tyrosinázu. Jeho role v melanogenezi však dosud nebyla prozkoumána. Proto je v dalším studiu nutné určit přesné mechanismy působení ginsenosidu Rh23 na regulaci syntézy melaninu.

3. Experimentální

3.1. Všeobecné

Pro sloupcovou chromatografii byly použity pryskyřice Kieselgel 60 a LiChroprep RP-18 (Merck, Darmstadt, Německo). Kieselgel 60 F254 (Merck) a RP-18 F254S (Merck) byly použity jako pevné fáze pro TLC experiment. Detekce skvrn na TLC destičce byla prováděna pozorováním pod UV lampou (Spectroline, model ENF-240 C/F, Spectronics Corp., New York, NY, USA) nebo postřikem 10% vodné H2SO4 na vyvolaný deska s následným ohřevem. Optické rotace byly měřeny pomocí digitálního polarimetru JASCO P-1010 (Tokio, Japonsko). Teploty tání byly získány pomocí přístroje Fisher-Johns Melting Point Apparatus (Fisher vědecká společnost, Pittsburgh, PA, USA) s mikroskopem. Ultrafialová spektra byla měřena na spektrofotometru Shimadzu model UV{12}} (Shimadzu Corp., Kyoto, Japonsko). IR spektra byla získána ze spektrometru Perkin Elmer Spectrum One FT-IR (Buckinghamshire, UK). NMR spektra byla zaznamenána na spektrometru Varian Inova AS 400 (400 MHz, Varian, Palo Alto, CA, USA). Analýza UPLC-QTOF/MS byla provedena pomocí Waters Xevo řady G2-S (Waters Corp., Milford, MA, USA) pracujícího v režimu záporných iontů.

3.2. Rostlinné materiály

Hydroponický ženšen Panax byl vypěstován ve skleníku Oddělení pro výzkum bylinných plodin v Eumseong, provincie Chungbuk, podle protokolu "standardního průvodce pěstováním ženšenu GAP" [11,33] vyvinutého Úřadem pro rozvoj venkova, Korejská republika. Jednoleté kořeny sazenic ženšenu o hmotnosti 0,8 až 1 g byly zakoupeny od Department of Herbal Crop Research, National Institute of Horticultural and Herbal Science (NIHHS), Rural Development Administration (RDA) a uloženy v komory při nízké teplotě (1–2 ◦C) před použitím. Kořeny sazenic ženšenu byly přesazeny do živných lázní a kultivovány v hydroponickém systému. Po třech měsících kultivace byly hydroponické ženšeny vytaženy ke sklizni. Sklizené hydroponické rostliny ženšenu byly omyty od prachu vodou a roztříděny na listy a kořeny, které pak byly sušeny po dobu 72 hodin v lyofilizační sušárně (FD8512, Ilshin Biobase Co., Yangju, Korea). Vzorek voucheru (NIHHS14-03) byl uložen v herbáři Department of Herbal Crop Research, NIHHS, RDA, Eumseong, Korejská republika.

3.3. Extrakce a izolace

Usušené a rozdrcené listy hydroponického P. ginseng (HPGL, 6 kg) byly extrahovány 80% MeOH (30 1 x 3) při teplotě místnosti po dobu 24 hodin. Extrakty byly zfiltrovány přes filtrační papír a odpařeny za sníženého tlaku při 45 °C, čímž bylo získáno 1,4 kg extraktu. Extrakt byl nalit do H20 (3 1) a extrahován postupně EtOAc (3 1 x 3) a n-BuOH (2,6 1 x 3). Každá vrstva byla zahuštěna za sníženého tlaku, čímž byly získány frakce EtOAc (75 g), n-BuOH (470 g) a H20 (855 g).

Frakce n-BuOH (HPGLB, 130 g) byla nanesena na sloupec silikagelu (φ 13 × 17 cm) a eluována CHCl3–MeOH–H2O (8:3:1, 9{42} } L → 6:4:1, 110L), čímž se získají 20 frakce (HPGLB1 až HPGLB20). Frakce HPGLB3 a HPGLB4 byly spojeny (18,9 g, Ve/Vt=0.05–0.12) a dále frakcionovány na sloupci silikagelu (φ 8 × 15 cm, CHCl3–MeOH–H2O=12:3:1, 14 1), čímž se získá 14 frakcí (HPGLB3-1 až HPGLB3-14). Frakce HPGLB3-4 a HPGLB3-5 byly spojeny (1,27 g, Ve/Vt {{40}},09–0,16) a dále frakcionovány přes sloupec ODS (φ 4 × 7 cm, MeOH–H2O=2:1, 2,6 1), čímž se získá devět frakcí (HPGLB3-4-1 až HPGLB3-4-9). Frakce HPGLB3-4-3 (119,4 mg, Ve/Vt=0,14–0,26) byla dále frakcionována přes kolonu ODS (φ 2,5 × 7 cm, MeOH–H2O=1:1, 1 L) za získání devíti frakcí (HPGLB3-4-3-1 až HPGLB3-4-3-9) včetně sloučeniny 1 (HPGLB3-4-3-7, 10,5 mg, Ve/Vt=0,42–0,55, TLC Rf=0,40 (RP-18 F254S, MeOH–H2O=2:1), Rf=0,50 (Kieselgel 60 F254, CHCl3–MeOH–H2O {{90} }:3:1)). Frakce HPGLB5 až HPGLB7 byly spojeny (24,0 g, Ve/Vt=0,12–0,22) a dále frakcionovány na koloně silikagelu (φ 7 × 12 cm, CHCl3–MeOH–H2O=10: 3:1, 10 1 → 6:4:1, 9 1), čímž se získá 16 frakcí (HPGLB5-1 až HPGLB5-16). Frakce HPGLB5-6 (323,1 mg, Ve/Vt=0,28–0,31) byla dále frakcionována přes kolonu ODS (φ 3 × 14 cm, MeOH–H2O=3:2, 1,2 L → 3:1, 1,5 l), čímž se získá deset frakcí (HPGLB5-6-1 až HPGLB5-6-10) včetně sloučeniny 2 (HPGLB5-6-5, 10,1 mg, Ve/Vt=0 0,21–0,23, TLC Rf=0,50 (RP-18 F254S, MeOH–H2O=2:1), Rf=0,45 (Kieselgel 60 F254, CHCl3– MeOH–H2O=7:3:1)).

3.4. Spektroskopická data

Sloučenina 1. Bílý prášek, teplota tání: 138–140 ◦C; [ ] 25 D plus 17,4◦ (c=0,39, MeOH); IR (okénko CaF2): 3377, 2932, 1382 cm-1; negativní QTOF/MS m/z 713,44723 [M plus COOH]- (vypočteno pro C37H64O10, 668,4499); 1H- a 13C-NMR data, viz tabulka 1.

Sloučenina 2. Bílý prášek, teplota tání: 133–136 ◦C; [ ] 25 D plus 20,2◦ (c=0,50, MeOH); IR (okénko CaF2): 3359, 2929, 1384 cm-1; negativní QTOF/MS m/z 699,48311 [M plus COOH]- (vypočteno pro C36H62O10, 654,4323);1H- a 13C-NMR data, viz tabulka 1.

3.5. Kvantitativní analýza nové sloučeniny 1 pomocí UPLC-QTOF/MS

Standardní zásobní roztok sloučeniny 1 byl připraven rozpuštěním 1,{2}} mg každého v 1 ml methanolu za vzniku koncentrace 1,5{5}} mg/ml a byl udržován při 4 ◦C. Standardní zásobní roztok (1) byl zředěn methanolem, aby se získaly kalibrační roztoky s rozsahy 0.{{10}}2–0,8 µg/ml, v daném pořadí. Jeden gram HPGL extraktu byl přesně zvážen a rozpuštěn v pevných objemech (10 ml) methanolu, filtrován přes filtrační papír 0,20 mm a chlazen na 4 ◦C . UPLC byla provedena pomocí Waters ACQUITY H-Class UPLC (Waters Corp., Milford, MA, USA) s ACQUITY BEH C18 kolonou (2,1 x 100 mm, 1,7 um). Mobilní fáze se skládala z vody (A) s 0,1 % kyseliny mravenčí (obj./obj.) a acetonitrilu (B) s 0,1 % kyseliny mravenčí (obj./obj.). Eluční gradient byl následující: 0–4 min, B 10–30 procent; 4–15 min, B 30–60 procent ; 15–16 min, B 60–100 procent ; 16–19 min, B 100–10 procent . Průtok byl 0,45 ml/min a injekční objem byl 2 ul pro každý běh.

Dále byla provedena analýza HR-MS pomocí Waters Xevo G2-S QTOF MS (Waters Corp., Milford, MA, USA) pracujícího v režimu záporných iontů. Hmotnostní spektrometry prováděly střídavé skenování s vysokou a nízkou energií známé jako režim akvizice MSE. Přesná hmotnostní měření byla získána za použití automatizovaného kalibračního dodávacího systému obsahujícího leucin enkefalin, m/z 554,262 (ESI neg. mód) jako vnitřní referenci. Optimální provozní parametry byly nastaveny tak, jak je uvedeno v tabulce 3.

3.6. Buněčná kultura

Melanocyty melanocytu jsou vysoce pigmentované, imortalizované, normální myší buněčná linie melanocytů odvozená od myší C57BL/6. Melan-a buňky použité v této studii byly získány od Dr. Dorothy Bennett (St. George's Hospital, London, UK). Buňky byly kultivovány při 37 °C v atmosféře 95 procent vzduchu, 10 procent CO2 v médiu RPMI 1640 doplněném na konečnou koncentraci 10 procenty tepelně inaktivovaným fetálním bovinním sérem, 1 procentem penicilinu/streptomycinu a 200 nM PMA. Životaschopnost buněk byla stanovena pomocí sady CCK-8 pro počítání buněk-8 (Dojindo Lab., Kumamoto, Japonsko).

3.7. Melaninový test

Buňky Melan-a byly ošetřeny sloučeninami po dobu 72 hodin a poté byly buňky rozpuštěny v 1N NaOH při 60 °C po dobu 30 minut. Poté byly lyzáty měřeny při 450 nm pomocí spektrofotometru. Data byla normalizována na obsah proteinu v buněčných lyzátech. Buněčné lyzáty byly následně zpracovány pro stanovení koncentrace proteinu za použití soupravy pro stanovení proteinu BCA (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA).

3.8. Původ a údržba rodičovských ryb

Dospělé zebřičky byly získány od komerčního prodejce a 10–15 ryb bylo chováno v 5l akrylové nádrži s následujícími podmínkami: 28,5 ◦C, s cyklem světlo/tma 14/10 h. Zebřičky byly krmeny třikrát denně, šest dní v týdnu, vločkovým krmivem TetraMin doplněným o živé solné krevety (Artemia salina). Embrya byla získána z přirozeného tření, které bylo vyvoláno ráno rozsvícením světla. Odběr embryí byl dokončen do 30 minut. Všechny experimentální protokoly a postupy byly schváleny a prováděny v souladu se schválenými směrnicemi a předpisy Výboru pro etiku zvířat Chungnamské národní univerzity (CNU-00866).

3.9. Léčba sloučeninami a hodnocení na základě fenotypu

Synchronizovaná embrya byla odebrána a uspořádána pipetou (7–9 embryí na jamku v 24-jamkových destičkách obsahujících 1 ml embryonálního média). Testované sloučeniny byly rozpuštěny v 0,1% DMSO a poté přidány do embryonálního média od devíti do 72 hodin po oplodnění (hpf) (63 hodin expozice). Účinky na pigmentaci zebřiček byly pozorovány pod stereomikroskopem. Denně se provádělo občasné míchání, stejně jako výměna média, aby se zajistilo rovnoměrné rozložení sloučenin. Ve všech experimentech byla 0,2 mM 1-fenyl-2-thiomočovina (PTU) použita k vytvoření transparentní zebřičky bez zasahování do vývojového procesu [33] a byla považována za standardní pozitivní kontrolu. Hodnocení tělesné pigmentace na základě fenotypu bylo odstraněno kleštěmi, anestetizováno v roztoku trikain methansulfonátu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), upevněno ve 3% methylcelulóze na 35mm misce (SPL Lifesciences, Pocheon, Korea), a vyfotografovány pod stereomikroskopem MZ16 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Německo).

4. závěr

V této studii byl ginsenosid Rh23 (1) izolován z hydrofonních listů ženšenu Panax společně s 20-O- -D-glukopyranosyl-3,6,12,20,25- pentahydroxydamar{10}}en (2). Obecně jsme byli úspěšní v našem pokusu získat hypopigmentační účinek sloučenin z hydroponického P. ginseng. Ginsenosid Rh23 a 20-O- -D-glukopyranosyl-3,6,12,20,25-pentahydroxydamar23-en mají inhibiční účinky na biosyntézu melaninu bez cytotoxických účinků v melan-buňce. Kromě toho ginsenosid Rh23 zvýšil depigmentaci zebřičky jako alternativního zvířecího modelu. Snížení obsahu melaninu a pigmentace v těle může mít potenciál pro bělící aktivitu a necytotoxický účinek je příznivějším bodem, protože bezpečnost je primárním hlediskem pro bělící činidla v kosmetických produktech.

Na základě našich současných výsledků je tedy důležité, že nové hydrofonní sloučeniny P. ginseng lze použít jako potenciální účinné činidlo pro zesvětlení pokožky. Další studie objasní přesné mechanismy působení ginsenosidu Rh23 na regulaci syntézy melaninu a vztah mezi strukturálními charakteristikami ginsenosidu Rh23 a melanogenezí, aby se zjistilo, zda se jedná o potenciální bělicí činidlo pro kosmetický průmysl. Mezi výhody hybridní Q-TOF hmotnostní spektrometrie patří nejen kvalitní detekční schopnost a citlivost, ale také přesné měření, které usnadňuje strukturní objasnění. Může být použit pro kvalitativní a kvantitativní stanovení minoritních nebo nových sloučenin, což pomáhá zlepšit kontrolu kvality koření ženšenu.

Doplňkové materiály:

1H-NMR a 13C-NMR spektra 1 jsou dostupná v doplňkových materiálech.

Poděkování:

Tato práce byla provedena s podporou „Kooperativního výzkumného programu pro zemědělský vědecký a technologický rozvoj“ (PJ01136203), Správa rozvoje venkova, Korejská republika. Děkujeme Cheol-Hee Kim (Chungnam National University) za sdílení zařízení pro zebřičky.

Příspěvky autora:

DYL a N.-IB vymysleli a navrhli experimenty; H.-GK a Y.-GL izolovaly sloučeniny; DYL objasnil struktury; I.-BJ se podílel na přípravě rostlinných materiálů; JHK provedl biologický test a pomohl s přípravou rukopisu; JWL a B.-RC provedly NMR a UPLC-QTOF/MS vzorků; G.-SK asistovala při revizi rukopisu; a DYL napsal článek a řídil výzkumný projekt. Všichni autoři přečetli a schválili konečný rukopis.

Střet zájmů:

Autoři neprohlašují žádný střet zájmů. Zakládající sponzoři nehráli při návrhu studie žádnou roli; sběr, analýzy nebo interpretace dat; psaní rukopisu; nebo rozhodnutí o zveřejnění výsledků.

Reference

1. Ben, EW; Michael, W. Léčivé rostliny světa. In Shinilbooks; Timber Press Inc.: Portland, OR, USA, 2007.

2. Park, JD; Rhee, DK; Lee, YH Biologické aktivity a chemie saponinů z Panax ginseng CA Meyer. Fytochemie 2005, 4, 159–175. [CrossRef]

3. Kwon, SJ; Chung, DK Imunitu zvyšující účinek horského ženšenu, ženšenu pěstovaného v horách a ženšenu Panax. J. Orient. Neuropsychiatrie 2004, 15, 89–101.

4. Gillis, CN Farmakologie ženšenu Panax: Spojení oxidu dusnatého? Biochem. Pharmacol. 1997, 54, 1–8. [CrossRef]

5. Kang, KS; Yamabe, N.; Kim, HY; Yokozawa, T. Vliv methanolového extraktu ze slunečního ženšenu na poškození jater u potkanů ​​vyvolané lipopolysacharidy. Fytomedicína 2007, 14, 840–845. [CrossRef] [PubMed]

6. Jiang, S.; Ren, D.; Li, J.; Yuan, G.; Li, H.; Xu, G.; Han, X.; Du, P.; An, L. Účinky sloučeniny K na hyperglykémii a inzulínovou rezistenci u potkanů ​​s diabetes mellitus 2. typu. Fioterapie 2014, 95, 58–64. [CrossRef] [PubMed]

7. Kim, HS; Lee, EH; Ko, SR; Choi, KJ; Park, JH; Im, DS Účinky ginsenosidu Rg3 a Rh2 na proliferaci buněk rakoviny prostaty. Oblouk. Pharm. Res. 2004, 27, 429–435. [CrossRef] [PubMed]

8. Nocerino, E.; Amato, M.; Izzo, AA Afrodiziakální a adaptogenní vlastnosti ženšenu. Fitoterapie 2000, 71, S1–S5. [CrossRef]

9. Keum, YS; Park, KK; Lee, JM; Chun, KS; Park, JH; Lee, SK; Kwon, HJ; Surh, YJ Antioxidační a protinádorové aktivity methanolového extraktu tepelně zpracovaného ženšenu. Cancer Lett. 2000, 150, 41–48. [CrossRef]

10. Kim, GS; Lee, SE; No, HJ; Kwon, H.; Lee, SW; Kim, SY; Kim, YB Účinky přírodních bioaktivních produktů na růst a obsah ginsenosidu v Panax ginseng kultivovaném v aeroponickém systému. J. Ginseng Res. 2012, 36, 430–441. [CrossRef] [PubMed]

11. Choi, SY; Cho, CW; Lee, YM; Kim, SS; Lee, SH; Kim, KT Srovnání obsahu ginsenosidu a fenolických složek v hydroponicky pěstovaných listech, plodech a kořenech ženšenu. J. Ginseng Res. 2012, 36, 425–429. [CrossRef] [PubMed]

12. Matsuda, H.; Nakamura, S.; Kubo, M. Studie kutikulových drog z přírodních zdrojů. II. Inhibiční účinky rostlin Prunus na biosyntézu melaninu. Biol. Pharm. Býk. 1994, 17, 1417–1420. [CrossRef] [PubMed]

13. Duncan, CL; Foster, EM Účinek dusitanu sodného, ​​chloridu sodného a dusičnanu sodného na klíčení a růst anaerobních spor. Appl. Microbiol. 1968, 16, 406–411. [PubMed]

14. Shimizu, K.; Yasutake, S.; Kondo, R. Vyniká nový stilben s inhibiční aktivitou tyrosinázy z Chlorophora. Chem. Pharm. Býk. 2003, 51, 318–319. [CrossRef] [PubMed]

15. Park, SH; Kim, DS; Kim, WG; Ryoo, IJ; Lee, DH; Huh, CH; Youn, SW; Yoo, ID; Park, KC Terrin: Nový inhibitor melanogeneze a jeho mechanismus. Buňka. Mol. Život 2004, 61, 2878–2885. [CrossRef] [PubMed]

16. Kong, YH; Jo, YO; Cho, CW; Syn, DW; Park, SJ; Rho, JH; Choi, SY Inhibiční účinky kyseliny skořicové na biosyntézu melaninu v kůži. Biol. Pharm. Býk. 2008, 31, 946–948. [CrossRef] [PubMed]

17. Hwang, EY; Choi, SY Kvantitativní analýza fenolických sloučenin v různých částech Panax ginseng CA Meyer a jeho inhibiční účinek na biosyntézu melaninu. Korejský J. Med. Crop Sci. 2006, 14, 148–152.

18. Im, SJ; Kim, KN; Yun, YG; Lee, JC; Mun, YJ; Kim, JH; Woo, WH Účinek radix ginseng a radix trichosanthis na melanogenezi. Biol. Pharm. Býk. 2003, 26, 849–853. [CrossRef] [PubMed]

19. Hwang, EY; Kong, YH; Lee, YC; Kim, YC; Yoo, KM; Jo, YO Srovnání obsahu fenolických sloučenin mezi bílým a červeným ženšenem a jejich inhibiční účinek na biosyntézu melaninu. J. Ginseng Res. 2006, 30, 82–87.

20. Zhang, YC; Pi, ZF; Liu, CM; Song, FR; Liu, ZQ; Liu, SY Analýza nízkopolárních ginsenosidů v pařeném ženšenu Panax při vysoké teplotě pomocí HPLC-ESI-MS/MS. Chem. Res. Brada. Univ. 2012, 28, 31–36.

21. Xie, YY; Luo, D.; Cheng, YJ; Ma, JF; Wang, YM; Liang, QL; Luo, GA Chemické transformace vyvolané napařováním a holistické hodnocení kvality červeného ženšenu získaného z Panax ginseng pomocí vícesložkového kvantifikačního otisku založeného na HPLC-ESI-MS/MSn. J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 8213–8224. [CrossRef] [PubMed]

22. Liu, GY; Li, XW; Wang, NB; Zhou, HY; Wei, W.; Gui, MY; Yang, B.; Jin, YR Tři nové triterpenové saponiny dammaranového typu z listů ženšenu Panax CA Meyer. J. Asian Nat. Prod. Res. 2010, 12, 865–873. [CrossRef] [PubMed]

23. Xing, Q.; Liang, T.; Shen, G.; Wang, X.; Jin, Y.; Liang, X. Komplexní HILIC x RPLC s detekcí hmotnostní spektrometrií pro analýzu saponinů v Panax notoginseng. Analytik 2012, 137, 2239–2249. [CrossRef] [PubMed]

24. Láska, DR; Pichler, FB; Dodd, A.; Copp, BR; Greenwood, DR Technologie pro vysoce výkonnou obrazovku: Současnost a budoucnost pomocí zebrafish. Curr. Opin. Biotechnol. 2004, 15, 564–571. [CrossRef] [PubMed]

25. Uwe, S.; Stefan, S.; Pobert, G.; Petra, G.; Henner, H.; Sepand, R.; Axel, S.; Ingrid, S.; Carsten, W.; Hilda, W.; a kol. Embrya zebřičky jako alternativa k pokusům na zvířatech - Komentář k definici počátku chráněné životní fáze v předpisech o dobrých životních podmínkách zvířat. Reprod. Toxicol. 2012, 33, 128–132.

26. Chio, TY; Kim, JH; Ko, DH; Kim, CH; Hwang, JS; Ahn, S.; Kim, SY; Kim, CD; Lee, JH; Yoo, TJ Zebrafish jako nový model pro screening melanogenních regulačních sloučenin na základě fenotypu. Pigment Cell Res. 2007, 20, 120–127. [CrossRef] [PubMed]

27. Elsalini, OA; Rohr, KB Fenylthiomočovina narušuje funkci štítné žlázy u vyvíjejících se zebřiček. Dev. Genes Evol. 2003, 212, 593–598. [PubMed]

28. Lee, DY; Cha, BJ; Lee, YS; Kim, GS; No, HJ; Kim, SY; Kang, HC; Kim, JH; Baek, NI Potenciál minoritních ginsenosidů izolovaných z listů Panax ginseng jako inhibitorů melanogeneze. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 1677–1690. [CrossRef] [PubMed]

29. Li, J.; Huang, M.; Teoh, H.; Muž, RY Panax quinquefolium saponiny chrání lipoproteiny s nízkou hustotou před oxidací. Life Sci. 1999, 64, 53–62. [CrossRef]

30. Li, TSC; Mazza, G.; Cottrell, AC; Gao, L. Ginsenosidy v kořenech a listech amerického ženšenu. J. Agric. Food Chem. 1996, 44, 717–720. [CrossRef]

31. Jung, CH; Seog, HM; Choi, IW; Park, MW; Cho, HY Antioxidační vlastnosti různých rozpouštědlových extraktů z listů divokého ženšenu. LWT 2006, 39, 266–274. [CrossRef]

32. National Institute of Crop Science. Směrnice standardního pěstování ženšenu GAP; National Institute of Crop Science, Správa rozvoje venkova: Suwon, Korea, 2009.

33. Karlsson, J.; Von Hofsten, J.; Olsson, PE Generování transparentní zebrafish: Vylepšená metoda pro zlepšení detekce genové exprese během embryonálního vývoje. Mar. Biotechnol. 2001, 3, 522–527. [CrossRef] [PubMed]

Vzorová dostupnost:

Vzorky sloučenin 1 a 2 jsou k dispozici u autorů.

Dae Young Lee 1 ID , Hyoung-Geun Kim 2 , Yeong-Geun Lee 2 , Jin Hee Kim 3 , Jae Won Lee 1 ID , Bo-Ram Choi 1 , In-Bae Jang 1 , Geum-Soog Kim 1 a Nam-In baek 2,*

1 Department of Herbal Crop Research, National Institute of Horticultural and Herbal Science, RDA, Eumseong 27709, Korea; dylee0809@gmail.com (DYL); jaewon3@gmail.com (JWL); bmcbr@korea.kr (B.-RC); ikanet@korea.kr (I.-BJ); kimgs0725@korea.kr (G.-SK)

2 Ústav biotechnologie orientální medicíny, Univerzita Kyung Hee, Yongin 17104, Korea; zwang05@naver.com (H.-GK); lyg629@nate.com (Y.-GL)

3 College of Herbal Bio-industry, Daegu Haany University, Gyeongsan 38610, Korea; gonogo1@nate.com

Přijato: 28. listopadu 2017; Přijato: 26. ledna 2018; Zveřejněno: 29. ledna 2018

For more information:1950477648nn@gmail.com