Glukóza má antimelanogenní účinek nepřímou inaktivací tyrosinázy v melanocytech a ekvivalentu lidské kůže

Abstraktní:

Cukry jsou v organismech všudypřítomné a jsou to známé kosmetické přísady pro hydrataci pokožky s minimálními vedlejšími účinky. Glukóza, jednoduchý cukr používaný jako zdroj energie živými buňkami, se často používá v produktech péče o pleť. Několik zpráv prokázalo, že cukr a sloučeniny příbuzné s cukrem mají antimelanogenní účinky na melanocyty. Nicméně základní molekulární mechanismus, kterým glukóza inhibuje syntézu melaninu, není znám, i když se glukóza používá jako bělící i zvlhčující složka v kosmetice. Zde jsme zjistili, že glukóza významně snížila obsah melaninu v buňkách B16 stimulovaných melanocyty stimulujícím hormonem (MSH) a tmavě pigmentovaných normálních lidských melanocytech bez známek cytotoxicity.

Kromě toho místní léčba glukózy prokázala svou bělící účinnost prostřednictvím fotografie, barvení Fontana-Masson (F&M) a multifotonové mikroskopie na pigmentovaném 3D modelu lidské kůže MelanoDerm. Glukóza však nezměnila genovou expresi nebo hladiny proteinů hlavních melanogenních proteinů v melanocytech. Zatímco glukóza silně snižovala aktivitu intracelulární tyrosinázy v melanocytech, nesnižovala aktivitu tyrosinázy hub v bezbuněčném experimentálním systému. Glukóza však byla metabolizována na kyselinu mléčnou, která může silně potlačit aktivitu tyrosinázy. Došli jsme tedy k závěru, že glukóza nepřímo inhibuje aktivitu tyrosinázy prostřednictvím přeměny na kyselinu mléčnou, což vysvětluje její antimelanogenní účinky v melanocytech.

Bělící tyrosináza je klíčovým enzymem při syntéze melaninu. Celkové glykosidy Cistanche deserticola – sloučenina izolovaná z přírodní čínské bylinné medicíny Cistanche deserticola může významně snížit aktivitu tyrosinázy. Účinek je kompetitivní reverzibilní inhibice, která může účinně inhibovat pigmentaci kůže, skvělý bělící efekt krásy. Experimentální data ukázala, že: když koncentrace celkových glykosidů Cistanche deserticola byla v rozmezí 0.5-3.0 mg·mL-1, měla inhibiční účinek účinek na aktivitu tyrosinázy a dobrý vztah mezi dávkou a účinkem byl nalezen v rozmezí 0.5-2.0 mg·mL-1.

Kliknutím zjistíte, co je cistanche

klíčová slova:

melanogeneze; cukr; glukóza; tyrosináza; ekvivalent lidské kůže

1. Úvod

Melanogeneze je proces produkce melaninu a je nezbytný pro ochranu kůže. Melanin absorbuje ultrafialové (UV) světlo a chrání pokožku před škodlivými účinky UV záření a volnými radikály [1]. Protože však nadměrná produkce melaninu způsobuje hyperpigmentaci, jako jsou pihy a lentigo, které mohou být považovány za neestetické, bylo mnoho výzkumů věnováno hledání účinných depigmentačních přísad pro kosmetiku nebo léky [2–4].

Cukr je silný zvlhčující prostředek pro zvlhčení pokožky a používá se jako kosmetická přísada pro zvlhčení pokožky s minimálními vedlejšími účinky. Cukry a látky příbuzné cukrům navíc ovlivňují melanogenezi [5,6]. Glykosylaci tyrosinázy, klíčového enzymu podílejícího se na syntéze melaninu, lze změnit, inhibovat jeho katalytickou aktivitu a urychlit jeho degradaci [7]. Role cukrů v melanogenezi byla zdůrazněna studiemi zkoumajícími vliv glykosylace na pigmentační fenotyp melanocytů a role cukerných zbytků na katalytickou aktivitu tyrosinázy [5–7]. Některé studie uvádějí, že deriváty cukru mohou inhibovat zrání tyrosinázy a ovlivnit její glykosylaci. Například N-acetylglukosamin (NAG), aminohexóza produkovaná fyziologicky přidáním aminoskupiny ke glukóze, narušuje glykosylaci tyrosinázy, což má za následek depigmentační účinky v kůži morčete a lidské kůži [8].

Kromě toho nedávné studie ukázaly, že sloučeniny příbuzné s cukrem inhibují expresi nebo aktivaci tyrosinázy a také mění její glykosylaci. Hodnotili jsme například bělící účinnost kyseliny galakturonové (GA), cukerné kyseliny, která je oxidovanou formou galaktózy a hlavní složkou pektinu. Kyselina galakturonová má bělící účinek prostřednictvím regulace aktivity a exprese tyrosinázy v buňkách myšího melanomu B16 a ekvivalentu lidské kůže [9]. V jiné zprávě nový typ cyklického oligosacharidu, známý jako cyklická nitrosylnigeróza (CNN), ukázal slabý, ale významný přímý inhibiční účinek na enzymatickou aktivitu tyrosinázy, což naznačuje jeden možný mechanismus hypopigmentace [10]. Podobně jako u zrání tyrosinázy správnou glykosylací by exprese nebo aktivita CNN mohla být cílem antimelanogenních látek [11]. Četné antimelanogenní látky však mají závažné vedlejší účinky, jako je vitiligo [12,13]. Existuje proto velký zájem o bezpečnější depigmentační sloučeniny.

Zde jsme zkoumali antimelanogenní účinky glukózy na buňky myšího melanomu B16 a normální lidské melanocyty. Kromě toho jsme zkoumali barvu tkáně a epidermální stav pomocí barvení tkáňových řezů ekvivalentu lidské kůže. Na základě našich zjištění navrhujeme, že bělící účinek glukózy je závislý na produkci kyseliny mléčné, což vede k inaktivaci tyrosinázy.

2. Výsledky

2.1. Antimelanogenní účinnost glukózy u B16 a NHM

Ke zkoumání antimelanogenního účinku glukózy jsme použili dva typy melanocytů, buňky melanomu B16 (buněčná linie myšího melanomu) a normální lidské melanocyty (NHM). Nejprve jsme určili, zda je glukóza toxická pro buňky B16. Glukóza nevykazovala žádnou cytotoxicitu v koncentracích do 100 mM v buňkách B16, jak je znázorněno na obrázku 1A. Na základě údajů o cytotoxicitě byly buňky B16 ošetřeny různými koncentracemi glukózy po dobu 72 hodin v přítomnosti hormonu stimulujícího melanocyty (MSH), induktoru melanogeneze. Jak je znázorněno na obrázku 1B, glukóza jasně a významně snižovala intracelulární obsah melaninu způsobem závislým na dávce. Kyselina kojová (KA) byla použita jako referenční sloučenina pro antimelanogenezi, protože se často používá jako kosmetická složka zesvětlující pokožku [1,3,4]. Barva lyzátů v buňkách ošetřených glukózou byla světlejší než barva kontrolních buněk (obrázek 1C).

Kromě toho jsme potvrdili, že množství melaninu vylučovaného do kultivačního média se snížilo a barva média se rozjasnila (obrázek 1D). Dále jsme zkoumali antimelanogenní účinek glukózy na tmavě pigmentované NHM. Glukóza v koncentracích až 100 mM nebyla cytotoxická po dobu až čtyř 4 dnů (obrázek 1E). Když byl obsah melaninu stanoven po ošetření NHM glukózou po dobu 4 dnů, zjistili jsme, že obsah melaninu klesal způsobem závislým na dávce (obrázek 1F). Dohromady tyto výsledky naznačují, že glukóza potlačuje syntézu melaninu v melanocytech.

Obrázek 1. Účinek glukózy na buňky B16 a normální lidské melanocyty (NHM). (A) Vliv glukózy na životaschopnost buněk B16. (B) Intracelulární obsah melaninu v buňkách B16 stimulovaných -MSH. Intracelulární obsah melaninu byl stanoven pomocí buněčných lyzátů, jak je popsáno v části metod. (C) Barva buněčného lyzátu. (D) Obsah extracelulárního melaninu byl stanoven za použití kultivačního média obsahujícího secernovaný melanin po společném ošetření glukózou a -MSH po dobu 72 hodin. KA označuje kyselinu kojovou (100 ug/ml), která byla použita jako referenční sloučenina. Fotografie ukazuje barvy kulturních médií. (E) Vliv glukózy na životaschopnost NHM. (F) Účinky glukózy na syntézu melaninu v NHM. NHM byly ošetřeny uvedenými koncentracemi glukózy po dobu 4 dnů, promyty a lyžovány NaOH pro stanovení intracelulárního obsahu melaninu. Obsah melaninu byl odhadnut pomocí absorbance při 40}5 nm a normalizován podle celkového obsahu proteinu. Data jsou vyjádřena jako průměr ± SD z alespoň tří nezávislých měření (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001).

2.2. Bělící účinek glukózy na 3D ekvivalent lidské kůže

K další definici antimelanogenní schopnosti glukózy jsme použili pigmentovaný 3D model lidské kůže MelanoDerm. Jak je popsáno v části Materiály a metody, glukóza byla topicky aplikována na MelanoDerm po dobu 18 dnů a životaschopnost buněk byla stanovena pomocí testu CCK-8. Jak je znázorněno na obrázku 2A, nebyla po léčbě glukózou po dobu 18 dnů pozorována žádná tkáňová cytotoxicita. Změny barvy tkáně byly hodnoceny pomocí fotografie. Jak je znázorněno na obrázku 2B, tkáň ošetřená glukózou měla světlejší barvu než tkáň ošetřená fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS). Navíc barvení hematoxylinem a eosinem (H&E) odhalilo, že glukóza nevyvolala kolaps tkáně, zatímco barvení fontana-masson (F&M) ukázalo, že glukóza snížila počet hyperpigmentovaných melanocytů (jak je naznačeno šipkami) v bazální vrstvě (obrázek 2C) .

Abychom dále prozkoumali změny v obsahu melaninu, porovnali jsme autofluorescenční signály melaninu v melanocytových vrstvách tkání ošetřených PBS a glukózou pomocí dvoufotonové excitační fluorescenční mikroskopie (TPEF), jak je znázorněno na obrázku 2D. Analýza těchto snímků ukázala, že objem melaninu byl snížen přibližně o 36 procent a intenzita signálu TPEF pro melanin v oblasti bohaté na melanocyty byla snížena přibližně o 38 procent v tkáních ošetřených glukózou ve srovnání s tkáněmi ošetřenými PBS.

Obrázek 2. Účinek glukózy na ekvivalent lidské kůže, MelanoDerm. (A) Životaschopnost ekvivalentů lidské kůže ošetřených glukózou. (B) Ekvivalenty lidské kůže (MelanoDerm; n=3) byly lokálně ošetřovány glukózou po dobu 18 dnů a poté vyfotografovány. Hodnota ∆L udává stupeň světlosti ve srovnání s tkání ošetřenou PBS. (C) H&E a F&M barvení tkáňových řezů. Sklíčka byla fixována v roztoku formaldehydu a zalita do parafínového vosku pro barvení (měřítko, 5{{10}} µm). Černé šipky označují pigmentované melanocyty. (D) Zobrazování melaninu (200 × 200 × 60 µm3) ekvivalentů lidské kůže bylo provedeno pomocí mikroskopie TPEF. Pseudobarevné (červené) signály indikují melanin (stupnice, 50 um). Grafy ukazují kvantifikaci objemu melaninu a signály TPEF. Data jsou vyjádřena jako průměr ± SD z alespoň tří nezávislých měření (*p < 0,05, ***p < 0,001).

2.3. Vliv glukózy na expresi melanogenních proteinů v melanocytech

Dále, abychom objasnili mechanismus depigmentace glukózy v melanocytech, hodnotili jsme její účinek na expresi melanogenních enzymů, jako je tyrosináza a Tyrp{0}} v buňkách B16 a NHM. Buňky B16 byly ošetřeny glukózou po uvedenou dobu v přítomnosti -MSH. Poté byly stanoveny proteinové hladiny tyrosinázy a Tyrp-1 testem Western blot (obrázek 3A). Hladiny exprese tyrosinázy a Tyrp-1 nebyly sníženy glukózou v žádném časovém bodě. Kromě toho hladiny transkriptu tyrosinázy nebyly ovlivněny glukózou v buňkách B16 stimulovaných -MSH (obrázek 3B). Podobně jako u buněk B16 nebyly hladiny proteinů tyrosinázy, Tyrp{12}} a MITF inhibovány glukózou (obrázek 3C) v buňkách NHM ošetřených glukózou a hladiny mRNA tyrosinázy a Tyrp{14}} také nebyly snížila, ale spíše mírně zvýšila glukózou (obrázek 3D).

Obrázek 3. Účinek glukózy na expresi melanogenních proteinů v buňkách B16 a NHM. (A, B) Buňky B16 byly ošetřeny -MSH po uvedenou dobu v přítomnosti nebo nepřítomnosti 20 mM glukózy. Poté byly provedeny testy Western blot (A) a qRT-PCR (B). (C) NHM byly ošetřeny uvedenými koncentracemi glukózy po dobu 48 hodin. Poté byl proveden test Western blot. (D) NHM byly ošetřeny po uvedenou dobu v přítomnosti 50 mM glukózy. Poté byly provedeny testy qRT-PCR. Data jsou vyjádřena jako průměr ± SD z alespoň tří nezávislých měření.

2.4. Vliv glukózy na aktivitu tyrosinázy

Abychom dále definovali mechanismus působení glukózy, testovali jsme, zda má inhibiční účinek na aktivitu houbové tyrosinázy. Jak je znázorněno na obrázku 4A, zjistili jsme, že glukóza nemá žádný inhibiční účinek na aktivitu tyrosinázy hub, což ukazuje, že glukóza přímo neovlivňuje aktivitu tyrosinázy. Dále jsme provedli test celkové intracelulární tyrosinázové aktivity s použitím glukózou ošetřených buněčných lyzátů jak z B16 buněk, tak z NHM. Je zajímavé, že intracelulární aktivita tyrosinázy byla inhibována způsobem závislým na dávce v buňkách B16 ošetřených glukózou v přítomnosti -MSH (obrázek 4B). U NHM glukóza také inhibovala intracelulární aktivitu tyrosinázy (obrázek 4C). Tato data podporují možnost, že glukóza nepřímo inaktivuje tyrosinázu v melanocytech.

Obrázek 4. Účinek glukózy na aktivitu tyrosinázy. (A) Vliv glukózy na aktivitu houbové tyrosinázy v bezbuněčném systému. (B, C) Test aktivity buněčné tyrosinázy. (B) Buňky B16 byly ošetřeny uvedenými koncentracemi glukózy po dobu 24 hodin. Poté byl proveden test aktivity buněčné tyrosinázy, jak je popsáno v části metod. (C) NHM byly ošetřeny 50 mM glukózou po uvedenou dobu. Poté byl proveden test aktivity buněčné tyrosinázy, jak je popsáno v části metod. Aktivita buněčné tyrosinázy byla normalizována celkovým obsahem proteinů. Data jsou vyjádřena jako průměr ± SD z alespoň tří nezávislých měření (*p < 0.05, **p < 0,01, ***p < 0,001).

2.5. Inaktivace tyrosinázy produkcí kyseliny mléčné v melanocytech ošetřených glukózou

Glukóza se přeměňuje na buněčný metabolit laktát, což je kyselina mléčná v roztoku a o kterém se uvádí, že je účinný při léčbě pigmentových lézí [14,15]. Proto jsme předpokládali, že glukóza se v melanocytech přeměňuje na kyselinu mléčnou a že zvýšené hladiny kyseliny mléčné inhibují melanogenezi prostřednictvím inaktivace tyrosinázy. Pro vyhodnocení této hypotézy jsme nejprve hodnotili produkci kyseliny mléčné v médiu z melanocytů ošetřených glukózou. Jak se očekávalo, glukóza významně up-regulovala obsah kyseliny mléčné v médiu kultivovaném buňkami B16 (obrázek 5A). Navíc, protože je známo, že kyselina mléčná přímo inhibuje aktivitu tyrosinázy [15], hodnotili jsme, zda kyselina mléčná potlačuje aktivitu tyrosinázy hub. Jak je znázorněno na obrázku 5B, kyselina mléčná dramaticky inhibovala aktivitu houbové tyrosinázy, na rozdíl od glukózy. Tyto výsledky naznačují, že přeměna glukózy na kyselinu mléčnou má antimelanogenní účinek prostřednictvím inaktivace tyrosinázy kyselinou mléčnou.

Obrázek 5. Produkce laktátu glukózou a účinek kyseliny mléčné na aktivitu tyrosinázy. (A) Produkce laktátu v buňkách B16 ošetřených glukózou. (A) Buňky B16 byly ošetřeny uvedenými koncentracemi glukózy po dobu 3 dnů. Poté byl proveden laktátový test s použitím kultivačního média, jak je popsáno v části metod. (B) Vliv kyseliny mléčné na aktivitu houbové tyrosinázy v bezbuněčném systému. Data jsou vyjádřena jako průměr ± SD z alespoň tří nezávislých měření (*p < 0.05, **p < 0,01, ***p < 0,001) .

3. Diskuse

Cukry nebo materiály odvozené od cukru se často používají jako kosmetické přísady pro ochranu pokožky a fyziologickou kontrolu. Například rafinóza zvyšuje autofagii nezávislou na mTOR a snižuje buněčnou smrt v keratinocytech ozářených UVB, což naznačuje, že přírodní činidlo rafinóza má potenciální hodnotu při omezení fotopoškození [16]. Trehalóza a sacharóza jsou nové aktivátory autofagie v lidských keratinocytech prostřednictvím dráhy nezávislé na mTOR [17]. Tato zjištění poskytují nový pohled na cukrem zprostředkovanou regulaci autofagie v keratinocytech. V případě glukózy se ukázalo, že topická glukóza indukuje expresi klaudinu-1 a filagrinu na myším modelu atopické dermatitidy a kultivaci keratinocytů, což naznačuje, že má protizánětlivý účinek opravou kožní bariéry [18]. Glukóza navíc inhibuje proliferaci a zvyšuje diferenciaci kožních keratinocytů [19]. Proto glukóza reguluje různé aspekty epidermální fyziologie, jako jsou funkce kožní bariéry a hladiny hydratace keratinocytů.

Cukry mohou působit jako depigmentační činidla prostřednictvím několika různých mechanismů, které zahrnují tyrosinázu. Některá činidla například inhibují zrání tyrosinázy, zatímco jiná vyvolávají inhibici exprese nebo aktivity genu tyrosinázy [5,8–10]. Nicméně jen málo studií zkoumalo mechanismy, které jsou základem depigmentačních účinků glukózy.

Abychom určili účinek glukózy na melanogenezi, dříve jsme se zaměřili na jaterní X receptory (LXR), což jsou ligandem aktivované jaderné receptory, které hrají klíčovou roli v metabolismu lipidů a homeostáze cholesterolu [20]. Zjistili jsme, že aktivace X receptoru v játrech inhibuje melanogenezi prostřednictvím urychlení degradace transkripčního faktoru asociovaného s mikroftalmií (MITF) zprostředkované extracelulárním signálem kinázou (ERK) [21].

Kromě toho je glukóza endogenním ligandem LXR [22]. Předpokládali jsme tedy, že glukóza má antimelanogenní účinky v důsledku aktivace dráhy závislé na LXR. Jak je však ukázáno na obrázku 3C, glukóza nezměnila hladiny exprese tyrosinázy nebo MITF, ačkoli aktivace LXR snížila hladiny exprese těchto proteinů v melanocytech. Proto jsme došli k závěru, že glukóza má depigmentační účinky na melanocyty nezávisle na aktivaci LXR.

Glukóza je hlavním substrátem pro výrobu energie a je hydrolyzována sériovými reakcemi několika enzymů, známými jako glykolýza. Četné studie ukázaly, že glykolýza má pouze jeden konečný produkt, kyselinu mléčnou, ať už za aerobních nebo anaerobních podmínek. Za aerobních podmínek (O2) je laktát využíván jako substrát mitochondriální laktátdehydrogenázy (MLD). LDH jej přeměňují na pyruvát, který vstupuje do cyklu trikarboxylové kyseliny (TCA). Za anaerobních podmínek (N2) se laktát hromadí v cytosolu. Proto dráha glykolýzy začíná glukózou jako jejím substrátem a končí produkcí laktátu jako jejího hlavního konečného produktu [23]. Kromě toho David a spol. měřili frakci glukózy, která byla přeměněna na kyselinu mléčnou nebo pyruvát v normálních lidských melanocytech [24]. Většina metabolitů glukózy byla spíše kyselina mléčná než pyruvát.

Kyselina mléčná je alfa hydroxy kyselina (AHA); tyto kyseliny jsou široce používány v kosmetických přípravcích jako povrchové peelingové prostředky [25]. Kromě toho kyselina mléčná potlačuje tvorbu melaninu přímou inhibicí aktivity tyrosinázy, což je účinek nezávislý na její kyselé povaze, což znamená, že účinky kyseliny mléčné na pigmentové léze jsou způsobeny nejen urychlením přeměny epidermálních buněk, ale také přímou inhibicí tvorby melaninu v melanocyty [15]. Usoudili jsme tedy, že glukóza může uplatnit svůj antimelanogenní účinek prostřednictvím produkce kyseliny mléčné, protože glukózu lze přeměnit na kyselinu mléčnou.

Jak se očekávalo, zjistili jsme, že léčba glukózou vedla k produkci kyseliny mléčné v melanocytech (obrázek 5A). Kromě toho jsme potvrdili, že kyselina mléčná silně a přímo inhibovala aktivitu tyrosinázy (obrázek 5B). Usuki a kol. také zjistili, že kyselina mléčná snižuje aktivitu intracelulární tyrosinázy v buňkách B16 a lidských HM3KO buňkách [15]. Ve zprávě nebyly hladiny mRNA a proteinů tyrosinázy a Tyrp-1 ovlivněny kyselinou mléčnou. Tyto údaje společně ukazují, že glukóza zvyšuje produkci kyseliny mléčné a že tato kyselina mléčná přímo inhibuje aktivitu tyrosinázy, aniž by ovlivnila hladiny genové exprese, což ukazuje, že glukóza má antimelanogenní účinek v melanocytech prostřednictvím nepřímé inaktivace tyrosinázy v závislosti na produkci kyseliny mléčné. K ověření role kyseliny mléčné a glukózy v depigmentaci jsou však nutné další experimenty.

Souhrnné údaje z této studie poskytují předběžné důkazy podporující užitečnost topické glukózy jako účinného bělícího i zvlhčujícího činidla, které lze bezpečně používat v kosmetice a léčivých přípravcích.

4. Materiály a metody

4.1. Materiály

D-glukóza, -MSH, kyselina kojová (KA), L-tyrosin, L-DOPA a kyselina mléčná byly zakoupeny od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Protilátky proti tyrosináze a aktinu byly zakoupeny od Abcam (Cambridge, UK). Protilátka proti Tyrp-1 byla zakoupena od Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). Protilátka proti MITF byla zakoupena od Proteintech (city, IL, USA).

4.2. Buněčná kultura a test životaschopnosti

Zakoupili jsme buňky myšího melanomu B16, Dulbeccovo modifikované Eagleovo médium (DMEM) a fetální bovinní sérum (FBS) z American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Buňky B16 byly kultivovány v DMEM obsahujícím 4500 mg/l vysoké glukózy (ATCC 30-2002) podle doporučení výrobce (ATCC) doplněném 5 % FBS a inkubovány při 37 °C ve zvlhčené atmosféře obsahující 95 % vzduchu a 10 procent CO2. Tmavě pigmentované primární NHM byly zakoupeny od Thermo Fisher Scientific (#C2025C; Waltham, MA, USA). Buňky byly kultivovány v médiu 254 (#M254500) doplněném suplementem pro růst lidských melanocytů (#S0025) a inkubovány při 37 °C v atmosféře 5 procent CO2. Pro experimenty byly použity primární NHM mezi pasážemi 4 a 7. Životaschopnost kultivovaných buněk byla hodnocena pomocí soupravy Cell Counting Kit-8 (CCK-8), jak je popsáno výrobcem (DOJINDO, Tokio, Japonsko).

4.3. Měření obsahu melaninu

Obsah melaninu byl stanoven tak, jak je popsáno v předchozích zprávách [2–4]. Stručně řečeno, buňky B16 byly ošetřeny uvedenými koncentracemi glukózy v přítomnosti -MSH (200 nM) po dobu 72 hodin. NHM byly ošetřeny uvedenými koncentracemi glukózy po dobu 4 dnů. Poté byly všechny buňky promyty fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS) a rozpuštěny v 1N NaOH při 60 °C po dobu 1 hodiny. Buněčné lyzáty byly přeneseny na 96-jamkovou destičku a absorbance byla měřena při 405 nm. Hodnoty byly normalizovány na základě koncentrací proteinu v každé jamce vzorku.

4.4. Test aktivity houbové tyrosinázy

Zkoumali jsme přímé účinky uvedených koncentrací glukózy na aktivitu tyrosinázy hub. Stručně, 100 ul fosfátového pufru obsahujícího glukózu bylo smícháno s houbovou tyrosinázou (10 jednotek/jamka) a smícháno s 50 ul 0,03 procenta L-tyrosinu nebo L-DOPA v destilované vodě. Poté byla směs společně inkubována při 37 °C po dobu 10 minut a absorbance byla měřena při 405 nm. Jako referenční sloučenina byla použita kyselina kojová (KA), dobře známé činidlo proti tyrosináze.

4.5. Test intracelulární tyrosinázové aktivity

Stručně řečeno, buňky B16 nebo NHM byly ošetřeny uvedenými koncentracemi glukózy po uvedenou dobu. Poté byly buňky promyty PBS a lyžovány inkubací v 50mM fosfátovém pufru (pH 6,8) obsahujícím 1 procento Tritonu X-100 a 0,1mM fenylmethylsulfonylfluoridu. Buněčné lyzáty byly poté centrifugovány při 12,{10}} rpm při 4 °C po dobu 20 minut. Byl odebrán supernatant obsahující buněčnou tyrosinázu a byl stanoven obsah proteinu pro normalizaci. Buněčný extrakt byl inkubován s L-DOPA ve fosfátovém pufru a tvorba dopacromu byla monitorována měřením absorbance při 405 nm během 30 minut.

4.6. Izolace RNA a kvantitativní reverzní transkripčně-polymerázová řetězová reakce v reálném čase (qRT-PCR)

Pro stanovení relativní exprese mRNA vybraných genů byla celková RNA izolována pomocí TRIzol (Invitrogen, CA, USA) podle pokynů výrobce a 4 ug RNA byly reverzně transkribovány do cDNA pomocí RT-premixu (Bioneer, Soul, South Korea). Kvantitativní PCR byla provedena pomocí systému ABI 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Sady primerů qRT-PCR pro tyrosinázu a Tyrp{6}} byly zakoupeny od Applied Biosystems a pro amplifikaci byly použity soupravy TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems). Exprese cílového genu byla normalizována na exprese provozního genu kódujícího podjednotku PO (RPLP0) laterálního stonku ribozomálního proteinu. Relativní kvantování bylo provedeno pomocí srovnávací metody ∆∆Ct podle pokynů výrobce.

4.7. Western blotting

Buňky byly dvakrát promyty studeným PBS a poté lyžovány v ledově chladném modifikovaném RIPA pufru (Cell Signaling Technology, MA, USA) obsahujícím inhibitory proteázy (Calbiochem, La Jolla, CA, USA). Byla stanovena celková koncentrace proteinu a proteiny byly rozděleny pomocí SDS-PAGE na gelech Bis-Tris s gradientem 4–12 procent (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), přenesených na nitrocelulózové membrány (Thermo Fisher Scientific). Po přenosu byly membrány blokovány v 5% blokovacím roztoku. Membrány byly inkubovány s primárními protilátkami při 4 ◦C po dobu 24 hodin, promyty fyziologickým roztokem pufrovaným Tris obsahujícím 0,1 procenta Tween-20 (TBST) a vystaveny sekundárním protilátkám konjugovaným s peroxidázou po dobu 1 hodiny pokojová teplota. Membrány byly třikrát opláchnuty TBST. Chemiluminiscenční signál byl vyvinut pomocí Western blotting ECL činidla (GE Healthcare, Hatfield, UK).

4.8. Trojrozměrný (3D) ekvivalent lidské kůže

Jako model tkáně lidské kůže jsme použili MelanoDerm (MEL{0}}B; MatTek Corp., Ashland, MA, USA). Tento životaschopný, rekonstituovaný, 3D ekvivalent lidské kůže byl odvozen od černých dárců a obsahuje normální melanocyty a keratinocyty. MelanoDerm byl pěstován na rozhraní vzduch-kapalina v médiu EPI-100-NMM-113 (MatTek Corp, Ashland, MA, USA). Před ošetřením glukózou byly tkáně promyty 1 ml PBS, aby se odstranily zbytkové sloučeniny. Glukóza byla rozpuštěna v PBS. Konečná koncentrace glukózy byla 2 procenta. Kontrolní vzorek byl ošetřen pouze PBS. Glukóza byla aplikována na MelanoDerm ve dnech 1, 4, 6, 8, 11, 13 a 15. Po 18 dnech byly tkáně MelanoDerm fixovány ve 4% pufrovaném formaldehydu, zality v parafínu, nařezány na tloušťku 3 um a podrobeny k barvení H&E a F&M. Životaschopnost vzorků tkáně byla hodnocena pomocí soupravy Cell Counting Kit-8 (CCK-8), jak je popsáno výrobcem (DOJINDO, Tokio, Japonsko). Pigmentace MelanoDerm byla hodnocena porovnáním změny hodnoty L*.

4.9. Dvoufotonové excitační fluorescenční zobrazování (TPEF).

Pro vizualizaci distribuce melaninu v 3D ekvivalentu lidské kůže jsme provedli zobrazení TPEF, jak je popsáno v našich předchozích zprávách [3,4]. Stručně, každý přípravek MelanoDerm byl fixován ve 4% formalínu po dobu 24 hodin při 4 °C a poté promyt PBS/0,1% BSA (bovinní sérový albumin, Merck, Branchburg, NJ, USA). Obrázky TPEF byly získány z bazální vrstvy pro měření intracelulárního melaninu ve vrstvě melanocytů. Relativní intenzity signálu TPEF pro melanin v měřeném objemu byly kvantifikovány pomocí softwaru Image-Pro Premier 3D (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA).

4.10. L-laktátový test

Buňky B16 byly nasazeny v množství 1.0 × 105 buněk na jamku do 12-jamkové destičky. Po ošetření glukózou po dobu 3 dnů byly hladiny extracelulárního laktátu kvantifikovány pomocí L-laktátové kolorimetrické testovací soupravy (Abcam, ab65331, Cambridge, UK) podle protokolu výrobce.

4.11. Statistická analýza

Data jsou vyjádřena jako průměr ± SD (standardní odchylky) a statistická významnost byla stanovena Studentovým t-testem. P-hodnota < 0,05 byla považována za statisticky významnou.

Příspěvky autora:

Konceptualizace, H.-JK, JL a CSL; Správa dat, SHL; Vyšetřování, SHL; Metodika, SHL, I.-HB a E.-SL; supervize, JL a CSL; Psaní – původní návrh, SHL a CSL; Psaní – recenze a úpravy, JL Všichni autoři si přečetli publikovanou verzi rukopisu a souhlasili s ní.

Financování:

Tento výzkum byl financován z Programu základního vědeckého výzkumu prostřednictvím Korejské národní výzkumné nadace (NRF) financovaného ministerstvem školství (číslo grantu: 2018R1D1A1B07049402).

Střet zájmů:

Autoři neprohlašují žádný střet zájmů.

Zkratky

-MSH -hormon stimulující melanocyty

Tyrp-1 protein související s tyrosinázou 1

Transkripční faktor spojený s mikroftalmií MITF

NHM normální lidské melanocyty

TPEF dvoufotonová excitační fluorescence

LXR jaterní X receptor

AHA alfa hydroxy kyseliny

H&E hematoxylin a eosin

F&M Fontana-Masson

Reference

1. Swallwell, H.; Latimer, J.; Haywood, RM; Birch-Machin, MA Zkoumání role melaninu v UVA/UVB a peroxidem vodíku indukované buněčné a mitochondriální produkci ROS a poškození mitochondriální DNA v lidských melanomových buňkách. Volný Radic. Biol. Med. 2012, 52, 626–634. [CrossRef]

2. Lee, CS; Jang, WH; Park, M.; Jung, K.; Baek, HS; Joo, YH; Park, YH; Lim, KM Nový adamantyl benzylbenzamidový derivát, AP736, potlačuje melanogenezi prostřednictvím inhibice cAMP-PKA-CREB-aktivovaného transkripčního faktoru asociovaného s mikroftalmií a exprese tyrosinázy. Exp. Dermatol. 2013, 22, 762–764. [CrossRef] [PubMed]

3. Lee, JH; Lee, ES; Bae, IH; Hwang, JA; Kim, SH; Kim, DY; Park, NH; Rho, HS; Kim, YJ; Oh, SG; a kol. Antimelanogenní účinnost Melasolvu (3,4,5-trimethoxycinnamát thymolesteru) v melanocytech a trojrozměrném ekvivalentu lidské kůže. Skin Pharmacol. Physiol. 2017, 30, 190–196. [CrossRef] [PubMed]

4. Bae, 1H; Lee, ES; Yoo, JW; Lee, SH; Ko, JY; Kim, YJ; Lee, TR; Kim, DY; Lee, CS Mannosylerythritolové lipidy inhibují melanogenezi prostřednictvím potlačení signalizace ERK-CREB-MITF-tyrosinázy v normálních lidských melanocytech a trojrozměrném ekvivalentu lidské kůže. Exp. Dermatol. 2019, 28, 738–741. [CrossRef] [PubMed]

5. Bin, BH; Kim, ST; Bhin, J.; Lee, TR; Cho, EG Vývoj antimelanogenních látek na bázi cukru. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 583. [CrossRef]

6. Kumari, S.; Tien Guan Thng, S.; Kumar Verma, N.; Gautam, HK inhibitory melanogeneze. Acta. Derm. Venereol. 2018, 98, 924–931. [CrossRef]

7. Ando, ​​H.; Kondoh, H.; Ichihashi, M.; Sluch, VJ Přístupy k identifikaci inhibitorů biosyntézy melaninu prostřednictvím kontroly kvality tyrosinázy. J. Invest Dermatol. 2007, 127, 751–761. [CrossRef]

8. Hwang, JS; Lee, HY; Lim, TY; Kim, MY; Yoon, TJ Narušení glykosylace tyrosinázy N-acetylglukosaminem a jeho depigmentační účinky v kůži morčete a lidské kůži. J. Dermatol. Sci. 2011, 63, 199–201. [CrossRef]

9. Lee, CS; Baek, HS; Bae, IH; Choi, SJ; Kim, YJ; Lee, JH; Kim, JW Depigmentační účinnost kyseliny galakturonové prostřednictvím regulace tyrosinázy v buňkách myšího melanomu B16 a trojrozměrném ekvivalentu lidské kůže. Clin. Exp. Dermatol. 2018, 43, 708–712. [CrossRef]

10. Nakamura, S.; Kunikata, T.; Matsumoto, Y.; Hanaya, T.; Harashima, A.; Nishimoto, T.; Ushio, S. Účinky necyklodextrinového cyklického sacharidu na buňky myšího melanomu: Charakterizace nového typu hypopigmentovaného cukru. PLoS ONE 2017, 12, e0186640. [CrossRef]

11. Khan, MT Nové inhibitory tyrosinázy z přírodních zdrojů – jejich výpočetní studie. Curr. Med. Chem. 2012, 19, 2262–2272. [CrossRef] [PubMed]

12. Solano, F.; Briganti, S.; Picardo, M.; Ghanem, G. Hypopigmentingagents: Aktualizovaný přehled o biologických, chemických a klinických aspektech. Pigment. Buňka. Res. 2006, 19, 550–571. [CrossRef] [PubMed]

13. Lee, CS; Joo, YH; Baek, HS; Park, M.; Kim, JH; Shin, HJ; Park, NH; Lee, JH; Park, YH; Shin, SS; a kol. Různé účinky pěti depigmentárních sloučenin, rododendronu, malinového ketonu, monobenzonu, rucinolu a AP736 na melanogenezi a životaschopnost lidských epidermálních melanocytů. Exp. Dermatol. 2016, 25, 44–49. [CrossRef] [PubMed]

14. Mulukutla, př. Kr.; Khan, S.; Lange, A.; Hu, WS Metabolismus glukózy v savčí buněčné kultuře: Nové poznatky pro ladění historických cest. Trendy. Biotechnol. 2010, 28, 476–484. [CrossRef]

15. Usuki, A.; Ohashi, A.; Sato, H.; Ochiai, Y.; Ichihashi, M.; Funasaka, Y. Inhibiční účinek kyseliny glykolové a kyseliny mléčné na syntézu melaninu v buňkách melanomu. Exp. Dermatol. 2003, 12, 43–50. [CrossRef]

16. Lin, S.; Li, L.; Li, M.; Gu, H.; Chen, X. Raffinose zvyšuje autofagii a snižuje buněčnou smrt v keratinocytech ozářených UVB zářením. J. Photochem. Photobiol. B 2019, 201, 111653. [CrossRef]

17. Chen, X.; Li, M.; Li, L.; Xu, S.; Huang, D.; Ju, M.; Huang, J.; Chen, K.; Gu, H. Trehalóza, sacharóza a rafinóza jsou nové aktivátory autofagie v lidských keratinocytech prostřednictvím dráhy nezávislé na mTOR. Sci. Rep. 2016, 6, 28423. [CrossRef]

18. Yamada, K.; Matsushita, K.; Wang, J.; Kanekura, T. Topická glukóza indukuje expresi Claudinu-1 a filagrinu v myším modelu atopické dermatitidy a v kultuře keratinocytů, s protizánětlivými účinky opravou kožní bariéry. Acta. Derm. Venereol. 2018, 98, 19–25. [CrossRef]

19. Spravchikov, N.; Sizyakov, G.; Gartsbein, M.; Accili, D.; Tennenbaum, T.; Wertheimer, E. Účinky glukózy na kožní keratinocyty: Důsledky pro kožní komplikace diabetu. Diabetes 2001, 50, 1627–1635. [CrossRef]

20. Castrillo, A.; Tontonoz, P. Nukleární receptory v biologii makrofágů: Na křižovatce metabolismu lipidů a zánětu. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 2004, 20, 455–480. [CrossRef]

21. Lee, CS; Park, M.; Han, J.; Lee, JH; Bae, IH; Choi, H.; Syn, ED; Park, YH; Lim, KM Aktivace jaterního X receptoru inhibuje melanogenezi prostřednictvím urychlení degradace MITF zprostředkované ERK. J. Invest. Dermatol. 2013, 133, 1063–1071. [CrossRef] [PubMed]

22. Mitro, N.; Mak, PA; Vargas, L.; Godio, C.; Hampton, E.; Molteni, V.; Kreusch, A.; Saez, E. Jaderný receptor LXR je glukózový senzor. Příroda 2007, 445, 219–223. [CrossRef] [PubMed]

23. Schurr, A. Sacharid; IntechOpen: Londýn, Spojené království, 2017; s. 21–35.

24. Scott, D.; Richardson, A.; Filipp, F.; Knutzen, C.; Chiang, G.; Ronai, Z.; Osterman, A.; Smith, J. Srovnávací metabolické profilování toku melanomových buněčných linií: Za Warburgovým efektem. J. Biol. Chem. 2011, 286, 42626–42634. [CrossRef] [PubMed]

25. Tang, SC; Yang, JH Duální účinky alfa-hydroxy kyselin na kůži. Molekuly 2018, 23, 863. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com