ISG15-závislá aktivace senzoru MDA5 je antagonizována SARS-CoV-2 proteázou podobnou papainu, aby se vyhnula vrozené imunitě hostitele
Nov 08, 2023
Aktivace receptorů podobných RIG-I, genu I indukovatelného retinovou kyselinou (RIG-I) a proteinu 5 asociovaného s diferenciací melanomu (MDA5) vytváří antivirový stav upregulací genů stimulovaných interferonem (IFN) (ISG). Mezi nimi je ISG15, jehož mechanické role ve vrozené imunitě stále zůstávají záhadné. V této studii uvádíme, že konjugace ISG15 je nezbytná pro antivirové odpovědi IFN zprostředkované senzorem virové RNA MDA5. ISGylace kaspázových aktivačních a náborových domén MDA5 podporuje jeho oligomerizaci a tím spouští aktivaci vrozené imunity proti řadě virů, včetně koronavirů, flavivirů a pikornavirů. ISG15-závislá aktivace MDA5 je antagonizována přímou de-ISGylací zprostředkovanou papainu podobnou proteázou SARS-CoV-2, nedávno se objevil koronavirus, který způsobil pandemii COVID{18}} . Naše práce demonstruje klíčovou roli ISG15 v MDA5-zprostředkované antivirové odpovědi a také identifikuje klíčový imunitní únikový mechanismus SARS-CoV-2, který může být zaměřen na vývoj nových antivirotik a vakcín proti bojovat proti COVID-19.
cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém
Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche Enhance Immunity
【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Virové narušení hostitelské imunitní homeostázy je monitorováno vrozeným imunitním systémem, který se opírá o receptory, které snímají molekulární vzorce spojené s nebezpečím nebo patogeny (PAMP)1–3. Receptory podobné RIG-I (RLR) RIG-I a MDA5 jsou klíčové pro detekci virů průzkumem cytoplazmy na virové nebo z hostitele odvozené imunostimulační RNA4. Vazba RNA na C-terminální doménu (CTD) a helikázu RIG-I a MDA5 vede k jejich signálně aktivované konformaci, která umožňuje nábor několika enzymů5. Tyto enzymy modifikují RLR na více doménách a místech a posttranslační modifikace (PTM) jsou zvláště dobře studovány pro domény aktivace a náboru kaspázy (CARD), signalizační moduly. Proteinová fosfatáza 1 (PP1) / defosforyluje RIG-I a MDA5 KARTY6. V případě RIG-I defosforylace podporuje Lys{22}}spojenou polyubikvitinaci CARD pomocí TRIM25 (tripartitní motiv obsahující 25) a dalších E3 ligáz7,8, které stabilizují oligomerní formu RIG-I, a tím umožňují mitochondriální antivirotiku -vazba signálního proteinu (MAVS). Ve srovnání s kroky RIG-I jsou jednotlivé kroky aktivace MDA5 a zahrnuté kritické PTM méně dobře pochopeny. Aktivace RLR indukuje produkci IFN typu I a III, které naopak propagují antivirovou signalizaci upregulací ISG9,10. Mezi nimi je ISG15, protein podobný ubikvitinu, který může být kovalentně konjugován s lysinovými zbytky cílových proteinů, proces PTM nazývaný ISGylace11. Ačkoli bylo široce uznáváno, že konjugace ISG15 působí antivirově12, mechanismy ISGylace hostitelského proteinu, které by mohly vysvětlit širokou antivirovou restrikční aktivitu ISG15, nejsou v současné době známy. Původce probíhající pandemie COVID{40}}, těžký akutní respirační syndrom coronavirus 2 (SCoV2), patří do čeledi Coronaviridae, která obsahuje několik dalších lidských patogenů. Koronaviry mají výjimečnou schopnost potlačit antivirové reakce zprostředkované IFN a nízká produkce IFN u pacientů infikovaných SCoV2- koreluje se závažným onemocněním13. Mezi koronavirové antagonisty IFN patří proteáza podobná papainu (PLpro), která má deubikvitinační a de-ISGylační aktivity14,15. V této studii identifikujeme zásadní roli ISGylace při aktivaci MDA5. Dále ukazujeme, že SCoV2 PLpro interaguje s MDA5 a antagonizuje aktivaci MDA5 závislou na ISG{53}} prostřednictvím aktivní de-ISGylace, čímž odhalujeme, že SCoV2 se již vyvinul, aby unikl imunitnímu dohledu pomocí MDA5.
Výsledek
MDA5, ale ne RIG-I, signalizace vyžaduje ISG15.
Abychom identifikovali PTM karet MDA5 CARD, které mohou regulovat aktivaci MDA5, podrobili jsme afinitně purifikovanou MDA5–2CARD fúzovanou s glutathion-S-transferázou (GST–MDA5–2CARD) nebo samotnou GST kapalinovou chromatografii spojenou s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC –MS/MS) a zjistili, že konkrétně GST–MDA5–2CARD kopurifikovaný s ISG15, který se jevil jako dva pásy, které migrovaly pomaleji (o ~15 a 30 kDa) než nemodifikované GST–MDA5–2CARD (Extended Data Obr. 1a). Imunoblotting (IB) potvrdil, že GST–MDA5–2CARD je modifikován ISG15 (rozšířená data, obr. 1b). Dále jsme určili relevanci ISG15 pro MDA5-indukovanou signalizaci. Zatímco exprese FLAG–MDA5 v myších embryonálních fibroblastech divokého typu (MEF) indukovala IFN- messenger RNA a protein, stejně jako transkripty Ccl5 způsobem závislým na dávce, exprese FLAG–MDA5 v Isg15–/– MEF vedla k ablaci exprese virového genu a proteinu (obr. 1a a rozšířená data obr. 1c). Podobně se indukce antivirového genu silně snížila v ISG15 knockout (KO) HeLa (lidských) buňkách ve srovnání s kontrolními buňkami WT (obr. 1b a rozšířená data obr. 1d), což vylučuje druhově specifický účinek. Naproti tomu FLAG-RIG-I indukoval srovnatelná množství secernovaného IFN- proteinu a také Ifnb1 a Ccl5 transkriptů v Isg15-/- a WT MEF (obr. 1a a rozšířená data obr. 1c). Transkripty IFNB1 a CCL5 a také produkce proteinu IFN- pomocí FLAG-RIG-I byly podobné nebo mírně zvýšené u buněk ISG15 KO HeLa ve srovnání s buňkami WT (obr. 1b a rozšířená data obr. 1d), což je v souladu s předchozími zprávami, že ISGylace negativně dopady signalizace RIG-I16,17
Obr. 1|ISGylace je vyžadována pro signalizaci MDA5, nikoli však RIG-I. a,b, ELISA IFN- ze supernatantů MEF (WT nebo Isg15−/−) (a) a HeLa buněk (WT nebo ISG15 KO) (b) přechodně transfekovaných rostoucími množstvími FLAG-značených MDA5 nebo RIG-I pro 40 h. Celobuněčné lyzáty (WCL) byly sondovány pomocí IB s anti-ISG15, anti-FLAG a anti-aktinem (kontrola plnění). c, ELISA IFN- ze supernatantů WT nebo Isg15−/− MEF, které byly falešně stimulovány nebo transfekovány EMCV RNA (0.1 nebo 0.4 µg ml−1), HMW-poly (I: C) (0,5 µg ml-1 ) nebo RABVLe (1 pmol ml-1 ), nebo infikovaných SeV (10 hemaglutinačních jednotek (HAU) ml-1 ) po dobu 24 h. d, analýza RT–qPCR Ifnb1, Ccl5 a Tnf mRNA ve WT a Isg15−/− MEF stimulovaných jako v c. e, IRF3 fosforylace ve WCL NHLF, které byly transfekovány uvedenými siRNA po dobu 30 hodin a poté simulovaně stimulovány nebo transfekovány EMCV RNA (0,4 µg ml-1) nebo RABVLe (1 pmol ml-1) po dobu 6 hodin, hodnoceno IB s anti-pSer{43}}IRF3 a anti-IRF3. f, ELISA IFN- ze supernatantů NHLF, které byly transfekovány uvedenými siRNA po dobu 30 hodin a poté simulovaně stimulovány nebo transfekovány EMCV RNA (0,4 µg ml-1) nebo RABVLe (1 pmol ml-1) nebo infikovány SeV (10 HAU ml-1) po dobu 16 hodin. g, ELISA IFN- ze supernatantů PBMC, které byly transdukovány po dobu 40 hodin s uvedenými lentivirovými částicemi shRNA a poté infikovány mutEMCV (MOI=10) nebo SeV (200 HAU ml-1) po dobu 8 hodin. h, analýza RT–qPCR mRNA IFNA2 a IL-6 v PBMC, které byly transdukovány a infikovány jako v g. Data představují alespoň dva nezávislé experimenty s podobnými výsledky (průměr ± sd z n= 3 biologických replikátů v a–daf a průměr n= 2 biologických replikací v g ah). *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test). ND, not detected; NS, not significant.
Dále jsme testovali účinek delece genu ISG15 na aktivaci endogenních MDA5 a RIG-I jejich příslušnými ligandy. Produkce IFN-, stejně jako exprese genů IFNB1, CCL5 a TNF indukovaná transfekcí RNA viru encefalomyokarditidy (EMCV) nebo vysokomolekulární (HMW)-poly(I:C), přičemž oba jsou převážně snímány MDA5, byly hluboce oslabeny u buněk Isg15−/− MEF, ISG15 KO HeLa a ISG15 KO HAP-1 ve srovnání s jejich příslušnými kontrolními buňkami (obr. 1c,d a rozšířená data obr. 1e–g). Důležité je, že ablace indukce antivirového genu pomocí EMCV RNA nebo HMW-poly(I:C) v buňkách ISG15 KO nebyla způsobena zrušenou expresí genu MDA5; naopak exprese mRNA MDA5 byla zvýšena v buňkách ISG15 KO ve srovnání s buňkami WT (rozšířená data obr. lf,g). Na rozdíl od stimulace agonisty MDA5 vedla stimulace buněk Isg15−/− MEF a ISG15 KO HeLa transfekcí vedoucí RNA viru vztekliny (RABVLe) nebo infekcí virem Sendai (SeV), což jsou stimuly RIG-I, k produkci IFN- a exprese antivirového genu srovnatelná s WT buňkami (obr. lc,d a rozšířená data obr. le). Abychom vyloučili potenciální klonální účinky, které by mohly být spojeny s buňkami s odstraněným genem ISG15, provedli jsme přechodné experimenty s umlčením genu v primárních normálních lidských plicních fibroblastech (NHLF). Umlčení ISG15, podobné knockdownu MDA5, vedlo k téměř úplné ztrátě fosforylace IFN-regulačního faktoru 3 (IRF3) – charakteristickým znakem aktivace signálu RLR – po stimulaci EMCV RNA, ale ne RABVLe vedl k produkci IFN- exprese antivirového transkriptu v NHLF transfekovaných EMCV RNA, ale ne v buňkách stimulovaných RABVLe nebo SeV (obr. lf a rozšířená data obr. lh). Umlčení ISG15 nebo MDA5 zprostředkované malou vlásenkou (sh)RNA v primárních lidských mononukleárních buňkách periferní krve (PBMC) také podstatně snížilo expresi antivirového proteinu a transkriptu po infekci rekombinantním mutantem EMCV (mutEMCV) s deficitem antagonismu MDA518,19 ve srovnání s infikované PBMC transdukované necílenou kontrolní shRNA (obr. 1g, ha rozšířená data obr. 1i). Naproti tomu deplece ISG15 nebo MDA5 neovlivnila cytokinové odpovědi v PBMC po infekci SeV (obr. 1g, ha rozšířená data obr. 1i). Tyto výsledky ukazují, že ISG15 je nezbytný pro imunitní signalizaci pomocí MDA5, ale ne RIG-I. Karty MDA5 jsou ISGylovány na Lys23 a Lys43.
cistanche výhody pro muže-posilují imunitní systém
Abychom potvrdili naši analýzu MS, která identifikovala MDA5–2CARD ISGylation, nejprve jsme testovali, zda je endogenní MDA5 také modifikován ISG15. Endogenní MDA5 byl silně ISGylován v buňkách transfekovaných HMW-poly(I:C) nebo infikovaných viry dengue (DENV) nebo Zika (ZIKV), které jsou snímány MDA5 (odkaz 5) (obr. 2a). Pozoruhodné je, že endogenní MDA5 byl také ISGylován v neinfikovaných buňkách, i když na velmi nízkých úrovních (rozšířená data, obr. 2a), což je v souladu s předchozími zjištěními, že mnoho hostitelských proteinů je také ISGylováno na nízkých úrovních za normálních (neinfikovaných) podmínek20. V buňkách ošetřených anti-IFNAR2 za účelem blokování upregulace ISG zprostředkované signalizací IFNAR vedlo umlčení ISG15 nebo MDA5 ke srovnatelnému snížení exprese genu IFNB1 po infekci mutEMCV (rozšířená data, obr. 2b), což ukazuje, že ISG15-závislá K signalizaci MDA5 dochází i v nepřítomnosti signalizace IFNAR.
t MDA5A2CARD (obsahující helikázu a CTD) je primárním místem MDA5 ISGylace se dvěma prominentními pruhy pro ISGylovanou 2CARD (obr. 2b). Rekonstituce buněk ISG15 KO HeLa buď WT ISG15, nebo nekonjugovatelným mutantem ISG15, ve kterém byly dva glyciny potřebné pro konjugaci nahrazeny alaninem (ISG15-AA)21, prokázala kovalentní konjugaci ISG15 (obr. 2c) . Mutace jednotlivých lysinových zbytků v GST–MDA5–2CARD na arginin odhalila, že jednomístná mutace Lys23 a Lys43 znatelně snížila ISGylaci (rozšířená data obr. 2c), zatímco jejich kombinovaná mutace (Lys23Arg/Lys43Arg) ISGdylaci téměř zrušila (obr. 2). ). Plná délka FLAG–MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg také vykazovala výrazně sníženou ISGylaci (obr. 2e a rozšířená data obr. 2d); reziduální ISGylace pozorovaná u FLAG–MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg je pravděpodobně způsobena dalšími minoritními místy v 2CARD a/nebo Δ2CARD. Za zmínku stojí, že mutace Lys23Arg/Lys43Arg neovlivnila MDA5–2CARD SUMOylation5 (rozšířená data obr. 2e). Kromě toho, zatímco RIG-I–2CARD byl silně ubikvitinován (což představuje kovalentní ubikvitinaci vázanou na Lys{41}7), ani MDA5–2CARD WT ani mutant Lys23Arg/Lys43Arg nevykazovaly detekovatelné úrovně ubikvitinace (rozšířená data, obr. 2f). Souhrnně tyto výsledky naznačují, že karty MDA5 CARD podléhají ISGylaci na dvou hlavních místech, Lys23 a Lys43.
K aktivaci MDA5 je vyžadována CARD ISGylation.
Při srovnání jejich schopnosti přenášet signál vykazovaly jednomístné mutanty MDA5–2CARD Lys23Arg a Lys43Arg ve srovnání s WT MDA5–2CARD částečně sníženou aktivaci promotoru IFN, zatímco mutant Lys23Arg/Lys43Arg měl výrazně sníženou signální aktivitu, která byla téměř stejně silná. jako u signálně defektních mutantů Ser88Glu a Ser88Asp6 (rozšířená data, obr. 2g). Naproti tomu mutant, ve kterém byl Lys68, což je lysinový zbytek, který je nejblíže k Lys43 a Lys23, substituován argininem (Lys68Arg), vykazoval srovnatelnou konjugační a signalizační schopnost ISG15 s WT 2CARD (rozšířená data obr. 2c,g). MDA5–2CARD Lys23Arg/Lys43Arg na rozdíl od WT MDA5–2CARD také nedokázal vyvolat dimerizaci IRF3 (rozšířená data obr. 2h). FLAG–MDA5 Lys23Arg, Lys43Arg nebo Lys23Arg/Lys43Arg také vykazovaly snížené nebo téměř zrušené schopnosti aktivace promotoru IFN ve srovnání s FLAG–MDA5 WT (obr. 2f). MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg vykazoval hluboký signální defekt, i když byl exprimován ve vysokých množstvích, zatímco WT MDA5 indukoval antivirové transkripty způsobem závislým na dávce (obr. 2g). Ve shodě, fosforylace STAT1, charakteristický znak signalizace IFNAR, stejně jako exprese proteinu ISG byly vysoce indukovány MDA5 WT, ale ne Lys23Arg/Lys43Arg (obr. 2h). Komplementace MDA5-genem upravených lidských astrocytů (SVGA) s MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg nebo Ser88Glu vedla k výraznému snížení IFNB1, CCL5 a ISG transkriptů ve srovnání s buňkami exprimujícími WT MDA5 (obr. 2i a rozšířená data) Obr. . Tyto výsledky ukazují, že ISGylace na Lys23 a Lys43 je nezbytná pro MDA5-zprostředkované cytokinové odpovědi.
cistanche výhody pro muže-posilují imunitní systém
Defosforylace pomocí PP1 reguluje ISGylaci MDA5.
Podobně jako RIG-I je MDA5 fosforylován v CARDs v neinfikovaných buňkách, což zabraňuje autoaktivaci; defosforylace RIG-I a MDA5 pomocí PP1/ je klíčová pro uvolnění RLR z jejich signalizací potlačených stavů6,22–24. Defosforylace RIG-I umožňuje ubikvitinaci CARD{10}}spojenou s Lys, což podporuje multimerizaci a signalizaci RIG-I5. Podrobnosti o tom, jak defosforylace CARD (na Ser88) spouští aktivaci MDA5, zůstaly nepolapitelné, a proto jsme testovali, zda defosforylace reguluje ISGylaci MDA5. Umlčení PP1 / silně snížená MDA5–2CARD ISGylace (rozšířená data, obr. 3a). Kromě toho fosfomimetické mutanty Ser88Glu a Ser88Asp měly sníženou ISGylaci, zatímco fosfo-nulový mutant Ser88Ala vykazoval silnější ISGylaci než WT MDA5–2CARD (rozšířená data obr. 3b). Naopak MDA5 WT a Lys23Arg/Lys43Arg měly srovnatelnou fosforylaci Ser88 (rozšířená data, obr. 3c). Společně tato data naznačují, že defosforylace MDA5 na Ser88 předchází CARD ISGylaci. Dále jsme použili protein V viru spalniček (MeV-V), který antagonizuje defosforylaci MDA5 Ser88 prostřednictvím PP1 / antagonismu25. Exprese MeV-V zvýšila fosforylaci Ser88 (indikující ablatovanou defosforylaci) GST–MDA5–2CARD nebo FLAG–MDA5 způsobem závislým na dávce, jak bylo uvedeno dříve25. Zvýšená fosforylace MeV-V korelovala s poklesem ISGylace (rozšířená data obr. 3d,e). Na rozdíl od WT MeV-V, mutant MeV-V, který zrušil PP1-vazbu a MDA{51}}defosforylační antagonismus (MeV-VΔtail)25, vykazoval malý účinek na MDA5–2CARD ISGylaci (rozšířená data Obr. 3f), posílení inhibice ISGylace je primárně způsobeno inhibicí PP1 a nikoli jinými antagonistickými účinky MeV-V. V proteiny z virů Nipah a Hendra (NiV-V a HeV-V) také zvýšily fosforylaci MDA5 Ser88 a odpovídajícím způsobem tlumily MDA5 ISGylaci (rozšířená data, obr. 3g,h), což naznačuje, že několik paramyxovirových V proteinů inhibuje MDA5 ISGylaci prostřednictvím manipulace. Ser88 fosforylace, ačkoli přesné mechanismy pro jednotlivé V proteiny zbývá určit. Celkově vzato tato data naznačují, že MDA5 CARD ISGylace je závislá na defosforylaci na Ser88.
ISGylace podporuje sestavení MDA5 vyššího řádu.
Aktivace RLR vyžaduje vazbu RNA, oligomerizaci RLR a jejich translokaci z cytosolu do mitochondrií pro interakci s MAVS5. Abychom objasnili mechanismus, kterým ISGylace ovlivňuje aktivitu MDA5, nejprve jsme zkoumali, zda ISGylace ovlivňuje vazbu RNA. Endogenní MDA5 purifikovaný z WT nebo Isg15−/− MEF interagoval stejně dobře s HMW-poly(I:C) in vitro (rozšířená data obr. 4a). MDA5 WT a Lys23Arg/Lys43Arg vykazovaly srovnatelnou vazbu k HMW-poly(I:C), což ukazuje, že ISGylace neovlivňuje schopnost MDA5 vázat RNA (rozšířená data obr. 4b). Když jsme monitorovali translokaci MDA5 z cytosolu do mitochondrií po stimulaci EMCV RNA, zjistili jsme, že umlčení ISG15, ale nikoli transfekce C, translokaci MDA5 zrušilo (obr. 3a). Naproti tomu translokace RIG-I po transfekci RABVLe byla účinná jak u ISG15-vyčerpaných, tak u si. C-transfekované buňky (obr. 3b). Tato data naznačovala, že ISGylace reguluje translokaci MDA5 nebo krok před ní. Protože translokace MDA5 z cytosolu do mitochondrií vyžaduje interakci s 14-3-3η26, porovnali jsme vazbu 14-3-3η WT a mutantního MDA5. Schopnost MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg vázat 14-3-3η byla podobná schopnosti WT MDA5 nebo mutantu Lys68Arg (rozšířená data obr. 4c). Avšak zatímco stimulace EMCV RNA účinně indukovala oligomerizaci MDA5 ve WT MEF, tvorba oligomerů MDA5 byla odstraněna v ISG15-deficientních MEF (obr. 3c). Knockdown ISG15 v buňkách 293T také zrušil oligomerizaci FLAG–MDA5–2CARD (obr. 3d). Naopak, koexprese komponent ISGylation strojního zařízení, Ube1L a UbcH8, silně zvýšila oligomerizaci MDA5–2CARD v si. Buňky transfekované C, ale ne v buňkách zbavených ISG15- (obr. 3d), což ukazuje, že pro tvorbu oligomeru MDA5 je nutná ISGylace. Na podporu tohoto konceptu vykazoval FLAG–MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg téměř zrušenou oligomerizaci, zatímco WT MDA5 oligomerizoval účinně (obr. 3e). Také jsme porovnali účinek mutace Lys23 Arg/Lys43Arg s účinkem mutací narušujících oligomeraci, které se lokalizují buď na rozhraní mezi monomery MDA5 a brání vazbě RNA zprostředkované filamentaci MDA5 (Ile841Arg/Glu842Arg a Asp848Ala,278Phe8 nebo na CARDs (Gly74Ala/Trp75Ala) a naruší oligomerizaci 2CARD27. Na rozdíl od WT MDA5, mutant Lys23Arg/Lys43Arg, podobný MDA5 Gly74Ala/Trp75Ala, vykazoval nedostatečnou oligomerizaci a v souladu s tím zrušil schopnost aktivovat promotor IFN (obr. 3f,g). Zavedení Lys23Arg/Lys43Arg do pozadí Ile841Arg/Glu842Arg nebo Asp848Ala/Phe849Ala, z nichž každý sám o sobě snížil oligomerizaci a signalizaci MDA5, také zrušil tvorbu oligomeru MDA5 a indukci IFN (obr. 3f,g). Protože LGP2 usnadňuje nukleaci MDA5 na dvouvláknové RNA a tím oligomerizaci MDA529,30, porovnávali jsme LGP2 vazbu MDA5 WT a Lys23Arg/Lys43Arg. MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg interagoval s LGP2 stejně účinně jako WT MDA5 (rozšířená data, obr. 4d), což posílilo návrh, že CARD ISGylace podporuje oligomerizaci MDA5 nezávisle na filamentaci zprostředkované vazbou RNA. Souhrnně tyto výsledky ukazují, že ISGylace usnadňuje oligomerizaci CARD a sestavení MDA5 vyššího řádu.
Obr. 2|Aktivace MDA5 vyžaduje ISGylaci na Lys23 a Lys43. endogenní MDA5 ISGylace u NHLF, které byly falešně ošetřeny, transfekovány HMW-poly(I:C) (0,1 µg ml-1 ) po dobu 40 hodin (vlevo) nebo infikované DENV nebo ZIKV (MOI {{ 10}} pro každou) po dobu 48 h (vpravo), stanoveno pomocí IP s anti-MDA5 (nebo izotypovou kontrolou IgG) a IB s anti-ISG15. b, ISGylace FLAG-značených MDA5–2CARD a MDA5Δ2CARD v přechodně transfekovaných buňkách HEK293T, které také exprimovaly V5–ISG15, HA–Ube1L a FLAG–UbcH8, hodnocené pomocí FLAG PD a IB s anti-V5 40 hodin po transfekci. c, Endogenní MDA5 ISGylace v ISG15 KO HeLa buňkách stabilně rekonstituovaných vektorem, WT ISG15 nebo ISG15-AA a kotransfekovaných s HA–Ube1L a FLAG–UbcH8 po léčbě IFN- (1,{39}} U ml−1 ) po dobu 24 h, stanoveno IP s anti-MDA5 a IB s anti-ISG15. d, ISGylace GST–MDA5–2CARD WT a Lys23Arg/ Lys43Arg v buňkách HEK293T, které byly kotransfekovány s V5–ISG15, HA–Ube1L a FLAG–UbcH8 po dobu 24 hodin, stanoveno pomocí GST PD a IB s anti-V5. e, ISGylace FLAG–MDA5 WT a Lys23Arg/Lys43Arg v buňkách HEK293T, které byly kotransfekovány s V5–ISG15, HA–Ube1L a FLAG–UbcH8, stanoveno pomocí FLAG PD a IB s anti-V5. f, reportérová aktivita IFN-luciferázy v buňkách HEK293T, které byly transfekovány po dobu 40 hodin vektorem, FLAG–MDA5 WT nebo mutanty. Hodnoty luciferázy jsou prezentovány jako násobek indukce vzhledem k hodnotám pro buňky transfekované vektorem, nastavené na 1. WCL byly sondovány pomocí IB s anti-FLAG a anti-aktinem. g, analýza RT–qPCR mRNA IFNB1 a CCL5 v buňkách HEK293T, které byly přechodně transfekovány buď vektorem, nebo zvyšujícím se množstvím FLAG–MDA5 WT nebo Lys23Arg/Lys43Arg. h, fosforylace STAT1 a množství proteinu ISG (IFIT1 a -2}) ve WCL buněk HEK293T, které byly přechodně transfekovány vektorem nebo FLAG–MDA5 WT nebo Lys23Arg/Lys43Arg, stanoveným IB. I, RT–qPCR analýza indikovaných antivirových genů v MDA5 KO SVGA, které byly přechodně rekonstituovány buď prázdným vektorem, nebo MDA5 WT, Lys23Arg/Lys43Arg nebo Ser88Glu značenými FLAG. Data představují alespoň dva nezávislé experimenty s podobnými výsledky (průměr ± sd z n= 3 biologických replikací v f, g a i). *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).
Obr. 3|CARD ISGylation podporuje tvorbu sestav MDA5 vyššího řádu. a,b, Cytosol-mitochondriální frakcionace WCL z NHLF, které byly transfekovány po dobu 30 h necílenou kontrolní siRNA (si.C) nebo ISG15-specifickou siRNA (si.ISG15) a poté simulovaně ošetřena nebo transfekována EMCV RNA (0,4 µg ml-1) (a) nebo RABVLe (1 pmol ml-1) (b) po dobu 16 hodin. IB byla provedena s anti-MDA5 (a), anti-RIG-I (b), anti-ISG15 a anti-aktinem (a a b). -Tubulin a MAVS sloužily jako markery čistoty pro cytosolickou a mitochondriální frakci, v daném pořadí (a a b). c, Endogenní oligomerizace MDA5 ve WT a Isg15−/− MEF, které byly transfekovány EMCV RNA (0,5 µg ml−1 ) po dobu 16 hodin a hodnoceny pomocí SDD–AGE a IB s anti-MDA5. WCL byly dále analyzovány pomocí SDS-PAGE a sondovány pomocí IB s anti-MDA5 a anti-aktinem. d, Oligomerizace FLAG–MDA5–2CARD v buňkách HEK293T, které byly transfekovány uvedenými siRNA, buď s nebo bez HA–Ube1L a FLAG–UbcH8 po dobu 48 hodin, stanoveno pomocí NativePAGE a IB s anti-FLAG. WCL byly dále analyzovány pomocí SDS-PAGE a sondovány pomocí IB s anti-FLAG, anti-HA, anti-ISG15 a anti-aktinem. e, Oligomerizace FLAG–MDA5 WT a Lys23Arg/Lys43Arg v přechodně transfekovaných buňkách MDA5 KO HEK293, hodnocená pomocí SDD–AGE a IB s anti-FLAG. WCL byly dále analyzovány pomocí SDS-PAGE a IB s anti-FLAG a anti-aktinem. f, Oligomerizace MDA5 WT a mutantů značených FLAG v přechodně transfekovaných buňkách MDA5 KO HEK293, hodnocená pomocí NativePAGE a IB s anti-MDA5. WCL byly dále analyzovány pomocí SDS-PAGE a sondovány pomocí IB s anti-MDA5 a anti-aktinem. g, IFN-luciferázová reportérová aktivita v MDA5 KO HEK293 buňkách, které byly transfekovány po dobu 24 hodin buď prázdným vektorem, nebo FLAG-značeným MDA5 WT nebo mutanty. Luciferázová aktivita je prezentována jako násobek indukce vzhledem k hodnotám pro buňky transfekované vektorem, nastavené na 1. Data představují alespoň dva nezávislé experimenty s podobnými výsledky (průměr ± sd z n= 3 biologických replikátů vg). ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).
Signalizace MDA5 závislá na ISGylaci omezuje replikaci viru.
Dále jsme hodnotili, zda je ISGylace MDA5 nutná pro jeho schopnost omezit replikaci viru. FLAG–MDA5 WT, ale ne Lys23Arg/Lys43Arg, silně (~2log) inhibovaly replikaci EMCV (obr. 4a). Podobně buňky MDA5 KO HEK293 rekonstituované pomocí WT MDA5, ale ne buňky doplněné mutantem Lys23Arg/ Lys43Arg, účinně omezovaly replikaci DENV (obr. 4b). Také jsme rekonstituovali SVGA astrocytů MDA5 KO, fyziologicky relevantní typ buněk pro infekci ZIKV, buď s vektorem, nebo s MDA5 WT nebo Lys23Arg/Lys43Arg, a poté jsme hodnotili replikaci ZIKV v průběhu 40-h časového průběhu. Replikace ZIKV byla zeslabena ~100-násobně v buňkách rekonstituovaných pomocí WT MDA5 ve srovnání s buňkami exprimujícími vektor. Na rozdíl od toho buňky komplementované s MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg neomezovaly ZIKV, podobně jako buňky exprimující MDA5 Ser88Glu (obr. 4c). WT MDA5, ale ne Lys23Arg/Lys43Arg, také omezil replikaci SCoV2, i když v menší míře než u ostatních testovaných virů (obr. 4d).
Obr. 4|ISGylace je nutná pro virovou restrikci pomocí MDA5. Titry EMCV v supernatantu buněk HEK293T, které byly transfekovány po dobu 40 hodin buď vektorem, nebo FLAG–MDA5 WT nebo Lys23Arg/Lys43Arg, a poté infikovány EMCV (MOI=0.001) po dobu 24 h, stanoveno testem TCID50. b, Procento buněk MDA5 KO HEK293 infikovaných DENV, které byly po dobu 24 hodin transfekovány buď vektorem, nebo FLAG–MDA5 WT nebo Lys23Arg/Lys43Arg, a poté 48 hodin falešně ošetřeny nebo infikovány DENV (MOI=5) , hodnoceno pomocí FACS s použitím anti-flaviviru E (4G2). SSC, boční rozptyl. c, titry ZIKV v supernatantu MDA5 KO SVGA, které byly po dobu 30 hodin transfekovány vektorem nebo FLAG-značeným MDA5 WT, Lys23Arg/Lys43Arg nebo Ser88Glu a poté infikovány ZIKV (MOI=0.1) po uvedenou dobu stanoveno plakovým testem. pfu, jednotky tvořící plak; hpi, hodiny po infekci. d, titry SCoV2 v supernatantu buněk HEK293T–hACE2, které byly transfekovány po dobu 24 hodin buď prázdným vektorem, nebo FLAG-MDA5 WT nebo Lys23Arg/Lys43Arg, a poté infikovány SCoV2 (MOI=0.5) po dobu 24 hodin h, stanoveno plakovým testem. e, Schéma experimentálního přístupu k „oddělení“ role ISG15 v MDA5-zprostředkované indukci IFN od jeho role při tlumení signalizace IFNAR. Sup., supernatant. f, NHLF 'dárcovské' buňky byly transfekovány po dobu 40 hodin s uvedenými siRNA a poté infikovány mutEMCV (MOI=0.1) po dobu 16 hodin. Buněčné supernatanty byly UV-inaktivovány a přeneseny na Vero 'příjemce' buňky. Po 24 hodinách byly buňky infikovány ZIKV (MOI=0.002–2) po dobu 72 hodin a ZIKV-pozitivní buňky byly stanoveny imunobarvením anti-flavivirem E (4G2) a substrátem TrueBlue peroxidázy. g, RIG-I KO HEK293 'dárcovské' buňky byly transfekovány si. C nebo si.ISG15 společně s vektorem nebo FLAG–MDA5 WT nebo Lys23Arg/Lys43Arg po dobu 24 hodin, po které následovala infekce EMCV (MOI=0.001) po dobu 16 hodin. UV-inaktivované buněčné supernatanty byly přeneseny na „příjemce“ buňky Vero po dobu 24 hodin, poté následovala infekce EMCV (MOI=0.001–0,1) po dobu 40 hodin. EMCV-indukované cytopatické účinky byly vizualizovány barvením Coomassie Blue. Data představují alespoň dva nezávislé experimenty s podobnými výsledky (průměr ± sd z n= 3 biologických replikátů v a–d). *P< 0.05, **P< 0.01 (two-tailed, unpaired Student's t-test).
Dále jsme určili účinek umlčení ISG15 na schopnost MDA5 inhibovat replikaci viru. Ačkoli MDA5 Lys23Arg/ Lys43Arg nedokázal potlačit replikaci EMCV bez ohledu na umlčení ISG15, WT MDA5 účinně omezil replikaci EMCV v si. C-transfekované buňky a neočekávaně také v ISG15-depletovaných buňkách (rozšířená data, obr. 5a). Při zkoumání základního mechanismu těchto neočekávaných výsledků jsme zjistili, že buňky infikované EMCV, které exprimovaly WT MDA5, měly výrazně zvýšené hladiny exprese proteinu ISG, když byl ISG15 umlčen ve srovnání s infikovanými buňkami transfekovanými WT MDA5 a si. C (Rozšířená data Obr. 5b). Podobně byla pozorována zvýšená exprese ISG transkriptu a proteinu v ISG15-deficientních buňkách, které byly transfekovány EMCV RNA nebo infikovány mutEMCV, navzdory zrušení indukce IFN- (rozšířená data, obr. 5c, d). Naproti tomu knockdown MDA5 zrušil expresi IFN- i ISG proteinu, jak se očekávalo (rozšířená data, obr. 5d). Všimli jsme si, že množství proteinu USP18, deubikvitinačního enzymu, který negativně reguluje signalizaci IFNAR31, bylo po infekci EMCV značně sníženo v buňkách s deplecí ISG{23}} ve srovnání s infikovanými buňkami, které byly transfekovány si. C nebo MDA5-specifická siRNA (rozšířená data obr. 5b,d), což je v souladu s uváděnou úlohou ISG15 při prevenci degradace USP1832. Tyto údaje společně naznačují, že v experimentálních nastaveních cílení genu ISG{29}} (tj. umlčení nebo KO) je antivirový účinek ISGylace MDA5 maskován aberantní upregulací ISG v důsledku ablace inhibičního účinku ISG15 na signalizaci IFNAR.
Obr. 5|SCoV2 PLpro se váže na MDA5–2CARD a de-ISGyluje. a Stuha znázornění krystalové struktury komplexu SCoV2 PLpro: ISG15 (Protein Data Bank, přírůstkové číslo 6YVA). Jsou uvedeny klíčové zbytky, které zprostředkovávají interakci místa 1 (Asn156 a Arg166/Glu167) nebo interakci místa 2 (Phe69) v PLpro, stejně jako jeho katalyticky aktivní místo (Cys111). b, ISGylace GST–MDA5–2CARD v buňkách HEK293T, které byly kotransfekovány po dobu 20 hodin vektorem nebo V5-značeným SCoV2 PLpro WT nebo mutanty, spolu s FLAG–ISG15, HA–Ube1L a FLAG–UbcH8, stanoveno GST PD a IB s anti-FLAG a anti-GST. WCL byly sondovány pomocí IB s anti-V5, anti-HA, anti-FLAG a anti-aktinem. c, Vazba HA-značeného MDA5 nebo RIG-I na V5-značený SCoV2– PLpro nebo FLAG-značený MeV-V (pozitivní kontrola) v přechodně transfekovaných buňkách HEK293T, stanoveno pomocí HA PD a IB s anti-V5 nebo anti-FLAG a anti-HA. WCL byly sondovány IB s anti-V5 a anti-FLAG. d, Oligomerizace FLAG–MDA5–2CARD v buňkách HEK293T, které byly kotransfekovány vektorem nebo V5-značeným SCoV2 PLpro WT nebo Cys111Ala po dobu 24 hodin, hodnoceno pomocí NativePAGE a IB s anti-FLAG. WCL byly dále analyzovány pomocí SDS–PAGE a sondovány pomocí IB s anti-FLAG, anti-V5 a anti-aktinem. e, ISGylace GST–MDA5–2CARD v buňkách HEK293T, které také exprimovaly FLAG–ISG15, HA–Ube1L a FLAG–UbcH8 a byly kotransfekovány po dobu 40 hodin vektorem nebo uvedeným V5-značeným koronavirovým PLpro proteiny, stanovené pomocí GST PD a IB s anti-FLAG, anti-V5 a anti-GST. Data představují alespoň dva nezávislé experimenty s podobnými výsledky.
Dále jsme použili test virové ochrany, který experimentálně odděluje MDA5 signalizaci ve virem infikovaných buňkách od downstream signalizace IFNAR ve stejných buňkách (obr. 4e). Supernatanty z „dárcovských“ buněk infikovaných mutEMCV, které byly buď si. C transfekované nebo zbavené buď ISG15 nebo MDA5, byly inaktivovány ultrafialovým zářením (UV) a poté přeneseny do neinfikovaných „příjemců“ buněk. „Primované“ buňky příjemce byly poté infikovány ZIKV, aby se přímo monitoroval antivirový účinek MDA5-zprostředkované produkce IFN dárcovskými buňkami. Zatímco supernatanty ze si. C-transfekované 'dárcovské' buňky silně inhibovaly replikaci ZIKV a supernatanty z knockdown buněk ISG15 nebo MDA5 minimálně omezovaly infekci ZIKV (obr. 4f). Podobně supernatanty kultury z EMCV-infikovaných dárcovských buněk transfekovaných WT MDA5 spolu s si. C vedlo k větší ochraně recipientních buněk před virovou expozicí než u buněk exprimujících WT MDA5 a zbavených ISG15 (obr. 4g). Souhrnně tato data ukazují, že ISGylace je důležitá pro omezení řady RNA virů zprostředkované MDA{16}}.
Obr. 6|SCoV2 PLpro inhibuje ISG15-zprostředkovanou MDA5 signalizaci prostřednictvím své de-ISGylázové aktivity. a, RT–qPCR analýza transkriptů IFNB1, IFNL1, ISG15, MDA5 a RIG-I v NHLF, které byly transfekovány uvedenými siRNA po dobu 40 h a poté transfekovány falešnou RNA nebo SCoV2 RNA (0,4 µg ml −1) po dobu 24 hodin. b, Vazba SCoV2 Nsp3 na endogenní MDA5 v buňkách A549–hACE2, které byly infikovány SCoV2 (MOI=0.5) po dobu 24 hodin, stanoveno pomocí IP s anti-MDA5 (nebo kontrolou izotypu IgG) a následně IB s anti-Nsp3 a anti-MDA5. WCL byly sondovány pomocí IB s anti-Nsp3 a anti-aktinem. c, Endogenní MDA5 ISGylace v buňkách A549–hACE2, které byly falešně infikovány nebo infikovány SCoV2 (MOI=0.5) po dobu 40 hodin v přítomnosti inhibitoru PLpro (GRL-0617; 50 µM) nebo vehikula kontrola (dimethylsulfoxid), určená IP s anti-MDA5 (nebo izotypová kontrola IgG), následovaná IB s anti-ISG15 a anti-MDA5. Hojnost proteinů IFIT1, RSAD2, ISG15 a aktinu ve WCL byla sondována pomocí IB. Účinná replikace viru byla ověřena IB s anti-Nsp3 a anti-Spike (S). d, analýza RT–qPCR transkriptů IFNB1, CCL5 a IFIT1 a EMCV genomové RNA (gRNA) v buňkách HeLa, které byly přechodně transfekovány po dobu 24 hodin vektorem nebo V5–SCoV2 PLpro WT nebo mutanty a poté infikovány mutEMCV (MOI=0.5) po dobu 12 hodin. e, titry EMCV v supernatantu buněk RIG-I KO HEK293, které byly přechodně transfekovány po dobu 24 hodin vektorem nebo FLAG-MDA5, spolu s V5-značeným SCoV2 PLpro WT, Cys111Ala nebo Arg166Ser/Glu167Arg a poté infikovány s EMCV (MOI=0.001) po dobu 16 hodin, stanoveno testem plaků. f, Množství proteinů uvedených ISG ve WCL z experimentu v e, stanovené pomocí IB s uvedenými protilátkami. Data představují alespoň dva nezávislé experimenty s podobnými výsledky (průměr ± sd z n= 3 biologických replikací v a, d, ae). *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).
SCoV2 PLpro se zaměřuje na MDA5 pro de-ISGylaci.
Koronaviry jako SARS-CoV (SCoV), MERS-CoV a nedávno vzniklý SCoV2 kódují PLpro, který zprostředkovává štěpení virových polyproteinů33. Kromě toho má PLpro deubikvitinační a de-ISGylační aktivity. Nedávno se ukázalo, že SCoV2 PLpro moduluje antivirové odpovědi primárně prostřednictvím své de-ISGylázové aktivity15. Protože je známo, že MDA5 je hlavním senzorem pro detekci koronavirů34,35, a protože naše data ukázala, že pro restrikci virů zprostředkovanou MDA{10}} je nutná ISGylace, zkoumali jsme, zda SCoV2 PLpro enzymaticky odstraňuje ISGylaci MDA5, aby antagonizovala vrozenou imunitu. SCoV2 PLpro WT, ale ne jeho katalyticky neaktivní mutant (PLpro Cys111Ala)15, zrušil ISGylaci GST–MDA5–2CARD a FLAG–MDA5 (obr. 5a,ba rozšířená data obr. 6a). Mutanty PLpro Asn156Glu a Arg166Ser/Glu167Arg, které jsou okrajově a vážně narušeny ve vazbě ISG15 na rozhraní 'místo 1', resp.14, 36, mírně nebo neovlivnily ISGylaci. Naproti tomu PLpro Phe69Ala, ve kterém je rozhraní „místa 2“, které přednostně určuje vazbu na ubikvitin, ale ne na ISG15, narušeno14,36, snížilo ISGylaci MDA5 stejně silně jako WT PLpro (obr. 5a,b a rozšířená data, obr. 6a ). SCoV2 PLpro však nepotlačil ubikvitinaci RIG-I–2CARD (rozšířená data, obr. 6b). Zjistili jsme, že PLpro interagoval specificky s MDA5, ale ne s RIG-I, stejně jako MeV-V, který se váže na MDA5 a sloužil jako kontrola37 (obr. 5c). Nízká množství PLpro inhibovala signalizaci MDA5, ale ne RIG-I, zatímco vyšší množství PLpro potlačovala antivirovou signalizaci oběma RLR (rozšířená data obr. 6c). To posiluje MDA5 jako přímý cíl PLpro. De-ISGylace IRF3 pravděpodobně odpovídá za inhibiční účinek, který mají vyšší dávky PLpro na signalizaci RLR15,38. Při zkoumání účinku PLpro na oligomerizaci MDA5–2CARD PLpro WT, ale nikoli Cys111Ala, účinně blokoval oligomerizaci MDA5–2CARD (obr. 5d), což ukazuje, že SCoV2 PLpro inhibuje svou enzymatickou aktivitou tvorbu oligomeru MDA5 závislou na ISGylaci. Enzymy PLpro příbuzných -koronavirů, SCoV, MERS–CoV a viru myší hepatitidy (MHV) a také -koronaviru HCoV-NL63 (NL63) se také vázaly na MDA5–2CARD ISGylaci a účinně ji snižovaly (obr. 5e) , což naznačuje, že antagonismus MDA5 prostřednictvím PLpro může být mezi koronaviry široce konzervován.
rostlina cistanche zvyšující imunitní systém
SCoV2 PLpro antagonizuje ISG15-závislou signalizaci MDA5.
Dále jsme určili relevanci ISG{0}}závislé signalizace MDA5 pro indukci antivirových cytokinů vyvolanou SCoV2. Protože je známo, že infekce SCoV2 minimálně indukuje IFN typu I díky účinným virovým antagonismům39, izolovali jsme celkovou RNA z buněk infikovaných SCoV2- a poté jsme ji znovu transfekovali do buněk, abychom stimulovali vrozenou imunitní signalizaci. SCoV2 RNA, ale ne RNA z falešně ošetřených buněk, silně indukovala IFN transkripty; tato indukce však byla výrazně snížena, když byly ISG15 nebo MDA5 umlčeny (obr. 6a). Knockdown RIG-I neměl nepříznivý vliv na virovou genovou expresi vyvolanou SCoV2 RNA, což naznačuje, že SCoV2 RNA-PAMP jsou primárně snímány osou ISG15-MDA5 (obr. 6a).
Zjistili jsme, že SCoV2 nestrukturální protein 3 (Nsp3), ve kterém leží PLpro, snadno interagoval s endogenním MDA5 během autentické infekce SCoV2 (obr. 6b). Endogenní MDA5 ISGylace byla nedetekovatelná v buňkách infikovaných SCoV2-, ačkoli virus spustil expresi ISG15; nicméně v infikovaných buňkách ošetřených specifickým inhibitorem PLpro15 byly MDA5 ISGylace a downstream ISG indukce silně zesíleny (obr. 6c), což podporuje návrh, že PLpro účinně potlačuje MDA5 ISGylaci a signalizaci během živé infekce SCoV2. Dále jsme zkoumali účinek WT a mutantního PLpro na aktivaci endogenního MDA5 během mutEMCV infekce. V souladu s jejich účinkem na MDA5 ISGylaci (obr. 5b a rozšířená data obr. 6a), SCoV2 PLpro WT a Phe69Ala zabránily indukci antivirového transkriptu, zatímco MDA5 Arg166Ser/Glu167Arg, podobně jako mutant Cys111Ala, neovlivnil expresi antivirového genu (obr. 6d). V souladu s tím byla replikace mutEMCV zesílena v buňkách exprimujících PLpro WT nebo Phe69Ala, ale ne v buňkách exprimujících PLpro Cys111Ala nebo Arg166Ser/Glu167Arg (obr. 6d). Podobně WT PLpro, nikoli však mutant Arg166Ser/Glu167Arg nebo Cys111Ala, blokoval EMCV restrikci pomocí FLAG–MDA5 (obr. 6e); účinek na replikaci viru koreloval s indukovanými ISG proteiny (obr. 6f). Souhrnně to prokazuje SCoV2 PLpro jako antagonistu IFN, který aktivně de-ISGyluje MDA5.
Diskuse
Je známo, že konjugace ISG15 uděluje antivirovou aktivitu mnoha virům; bylo však identifikováno pouze několik pravých substrátů12. Na druhou stranu ISG15 ve své nekonjugované formě působí provirálně posilováním inhibice IFNAR signálu zprostředkované USP18-31,32,40. Tato studie identifikuje klíčovou roli ISGylace v MDA5-zprostředkované indukci IFN. Naše práce také zdůrazňuje důležitost experimentálního designu, ve kterém je oddělení role ISG15 v aktivaci MDA5 od role při tlumení IFNAR signalizace zásadní pro odhalení silné antivirové aktivity ISG15. V infikovaném organismu je to pravděpodobně součet četných ISGylačních událostí (ovlivňujících hostitelské i virové proteiny), co určuje výsledek infekce a patogenezi, která může být závislá na kontextu12.
Výhody cistanche tubulosa- posílení imunitního systému
Naše zjištění naznačují, že ISGylace MDA5 působí analogicky k Lys63-ubikvitinaci RIG-I5: oba PTM (1) jsou regulovány PP1-indukovanou defosforylací a (2) podporují oligomerizaci CARD a vyšší RLR -objednávkové sestavy. Nicméně, zatímco ubikvitin je hojný v neinfikovaných i infikovaných buňkách, exprese ISG15 je silně zvýšena stimulací IFN. Nicméně i na bazálních úrovních je ISG15 konjugován s mnoha hostitelskými proteiny20, včetně MDA5, jak ukázala naše práce, což může být dostatečné pro počáteční aktivaci MDA5. Během virových infekcí, které jsou snímány více PRR, může být ISGylace MDA5 „priming“ mechanismem, kterým upregulace ISG15 okamžitým vrozeným senzorem (například RIG-I)41 aktivuje MDA5, aby vstoupil do režimu „nastartování“. Protože ISG15 negativně reguluje RIG-I16,17, ISGylace může vyvolat „přepínání senzorů“, kdy je aktivace MDA5 podporována při zvýšení hladin ISG15, zatímco aktivita RIG-I je utlumena. Identifikovali jsme, že SCoV2 PLpro antagonizuje MDA5 ISGylaci prostřednictvím své enzymatické aktivity po navázání na senzor; tato strategie je pravděpodobně mezi koronaviry zakonzervovaná, což vyžaduje další zkoumání. Analýza kryo-elektronové mikroskopie odhalila, že koronavirový Nsp3 je součástí komplexu pórů, který se rozprostírá ve dvoumembránových vesikulech odvozených od endoplazmatického retikula a exportuje nově syntetizovanou virovou RNA42. MDA5 se tedy může umístit v těsné blízkosti místa exportu virové RNA pro usnadnění detekce PAMP; avšak PLpro doména Nsp3 (která je na cytoplazmatické straně) blokuje MDA5 signalizaci prostřednictvím přímé de-ISGylace. Některé viry mohou také inhibovat MDA5 ISGylaci prostřednictvím dysregulace fosforylace MDA5, jak je ukázáno pro MeV-V. Stručně řečeno, naše studie odhaluje významnou roli ISGylace při aktivaci imunity zprostředkované MDA5-a také její inhibici pomocí SCoV2, čímž odhaluje potenciální molekulární cíl pro návrh terapeutik proti COVID-19.
Reference
1. Liu, G. & Gack, MU Odlišné a uspořádané funkce RNA senzorů v innate. Imunita 53, 26–42 (2020).
2. Wu, J. & Chen, ZJ Vrozené imunitní snímání a signalizace cytosolových nukleových kyselin. Annu. Rev. Immunol. 32, 461–488 (2014).
3. Chow, KT, Gale, M.Jr & Loo, YM RIG-I a další RNA senzory v antivirové imunitě. Annu. Rev. Immunol. 36, 667–694 (2018).
4. Schlee, M. Master senzory patogenních receptorů RNA-RIG-I. Imunobiologie 218, 1322–1335 (2013).
5. Rehwinkel, J. & Gack, MU RIG-I-like receptory: jejich regulace a role ve snímání RNA. Nat. Rev. Immunol. 20, 537–551 (2020).
6. Wies, E. a kol. Defosforylace RNA senzorů RIG-I a MDA5 fosfatázou PP1 je nezbytná pro vrozenou imunitní signalizaci. Imunita 38, 437–449 (2013).
7. Gack, MU a kol. Ubikvitin ligáza TRIM25 RING-finger E3 je nezbytná pro antivirovou aktivitu zprostředkovanou RIG-I. Příroda 446, 916–920 (2007).
8. Chiang, C. & Gack, MU Posttranslační kontrola intracelulárních drah snímání patogenů. Trends Immunol. 38, 39–52 (2017).
9. Lazear, HM, Scoggins, JW & Diamond, MS Sdílené a odlišné funkce interferonů typu I a typu III. Imunita 50, 907–923 (2019).
10. Schoggins, JW Geny stimulované interferonem: co všechny dělají? Annu. Virol. 6, 567–584 (2019).
11. Zhang, D. & Zhang, DE Interferonem stimulovaný gen 15 a proteinový ISGylační systém. J. Interferon Cytokine Res. 31, 119–130 (2011).
12. Perng, YC & Lenschow, DJ ISG15 v antivirové imunitě i mimo ni. Nat. Microbiol. 16, 423–439 (2018). 13. Hadjadj, J. a kol. Zhoršená aktivita interferonu typu I a zánětlivé reakce u pacientů s těžkým COVID-19. Science 369, 718–724 (2020).
14. Klemm, T. a kol. Mechanismus a inhibice proteázy podobné papainu, PLpro, SARS-CoV-2. EMBO J. 39, e106275 (2020).
15. Shin, D. a kol. Proteáza podobná papainu reguluje šíření viru SARS-CoV-2 a vrozenou imunitu. Příroda 587, 657–662 (2020).
16. Kim, MJ, Hwang, SY, Imaizumi, T. & Yoo, JY Negativní zpětnovazební regulace antivirové signalizace zprostředkované RIG-I interferonem indukovanou konjugací ISG15. J. Virol. 82, 1474–1483 (2008).
17. Du, Y. a kol. LRRC25 inhibuje signalizaci IFN typu I cílením ISG15-asociovaného RIG-I pro autofagickou degradaci. EMBO J. 37, 351–366 (2018).
18. Hato, SV a kol. Vedoucí protein mengoviru blokuje transkripci genu interferonu-alfa/beta a inhibuje aktivaci interferonového regulačního faktoru 3. Buněčný mikrobiol. 9, 2921–2930 (2007).
19. Deddouche, S. a kol. Identifikace LGP2-asociovaného agonisty MDA5 v buňkách infikovaných pikornavirem. eLife 3, e01535 (2014).
20. Durfee, LA, Lyon, N., Seo, K. & Huibregtse, JM Te Konjugační systém ISG15 se široce zaměřuje na nově syntetizované proteiny: důsledky pro antivirovou funkci ISG15. Mol. Cell 38, 722–732 (2010).
21. Lenschow, DJ a kol. Identifikace interferonem stimulovaného genu 15 jako antivirové molekuly během infekce virem Sindbis in vivo. J. Virol. 79, 13974–13983 (2005).
22. Gack, MU, Nistal-Villan, E., Inn, KS, Garcia-Sastre, A. & Jung, JU Fosforylací zprostředkovaná negativní regulace antivirové aktivity RIG-I. J. Virol. 84, 3220–3229 (2010).
23. Nistal-Villan, E. a kol. Negativní úloha fosforylace serinu 8 RIG-I v regulaci produkce interferonu-beta. J. Biol. Chem. 285, 20252–20261 (2010).
24. Maharaj, NP, Wies, E., Stoll, A. & Gack, MU Konvenční proteinkináza C-alfa (PKC-alfa) a PKC-beta negativně regulují přenos antivirového signálu RIG-I. J. Virol. 86, 1358–1371 (2012).
25. Davis, ME a kol. Antagonismus fosfatázy PP1 proteinem viru spalniček V je nutný pro vrozený imunitní únik MDA5. Cell Host Microbe 16, 19–30 (2014).
26. Lin, JP, Fan, YK & Liu, HM Te 14-3-3eta chaperonový protein podporuje antivirovou vrozenou imunitu prostřednictvím usnadnění oligomerizace MDA5 a intracelulární redistribuce. PLoS Pathog. 15, e1007582 (2019).
27. Wu, B. a kol. Strukturní základ pro rozpoznávání dsRNA, tvorbu filamentů a aktivaci antivirového signálu pomocí MDA5. Cell 152, 276–289 (2013).
28. Yu, Q., Qu, K. & Modis, Y. Kryo-EM struktury vláken MDA5-dsRNA v různých fázích hydrolýzy ATP. Mol. Cell 72, 999–1012 (2018).
29. Bruns, AM, Leser, GP, Lamb, RA & Horvath, CM Vrozený imunitní senzor LGP2 aktivuje antivirovou signalizaci regulací interakce MDA5–RNA a sestavování filamentů. Mol. Cell 55, 771–781 (2014).
30. Uchikawa, E. a kol. Strukturální analýza vazby dsRNA k receptorům rozpoznávajícím antivirové vzorce LGP2 a MDA5. Mol. Cell 62, 586–602 (2016).
31. Malakhova, OA a kol. UBP43 je nový regulátor interferonové signalizace nezávislý na jeho izopeptidázové aktivitě ISG15. EMBO J. 25, 2358–2367 (2006).
32. Zhang, X. a kol. Lidský intracelulární ISG15 zabraňuje nadměrné amplifikaci interferonu-alfa/beta a auto-zánětu. Příroda 517, 89–93 (2015).
33. Harcourt, BH a kol. Identifikace produktů replikázy koronaviru těžkého akutního respiračního syndromu a charakterizace aktivity proteázy podobné papainu. J. Virol. 78, 13600–13612 (2004).
34. Roth-Cross, JK, Bender, SJ & Weiss, SR Virus myší hepatitidy myšího koronaviru je rozpoznán MDA5 a indukuje interferon typu I v mozkových makrofázích/mikrogliích. J. Virol. 82, 9829-9838 (2008).
35. Menachery, VD a kol. Útlum a obnova těžkého akutního respiračního syndromu mutant koronaviru postrádající aktivitu 2'-O-methyltransferázy. J. Virol. 88, 4251–4264 (2014).
36. Bekes, M. a kol. Rozpoznání diubikvitinových a deubikvitinačních aktivit proteázy podobné papainu z koronaviru SARS{1}}. Mol. Cell 62, 572–585 (2016).
37. Childs, K. a kol. mda-5, ale ne RIG-I, je běžným cílem proteinů paramyxoviru V. Virology 359, 190–200 (2007).
38. Shi, HX a kol. Pozitivní regulace aktivace interferonového regulačního faktoru 3 pomocí Herc5 prostřednictvím modifikace ISG15. Mol. Cell Biol. 30, 2424–2436 (2010).
39. Blanco-Melo, D. a kol. Nevyvážená reakce hostitelů na SARS-CoV-2 pohání rozvoj COVID-19. Cela 181, 1036–1045 (2020).
40. Speer, SD a kol. Nedostatek ISG15 a zvýšená virová rezistence u lidí, ale ne u myší. Nat. Commun. 7, 11496 (2016).
41. Errett, JS, Suthar, MS, McMillan, A., Diamond, MS & Gale, M. Jr. Základní, neredundantní role RIG-I a MDA5 při detekci a kontrole infekce virem West Nile. J. Virol. 87, 11416–11425 (2013).
42. Wolf, G. a kol. Molekulární pór překlenuje dvojitou membránu replikační organely koronaviru. Science 369, 1395–1398 (2020).
43. Major, EO a kol. Založení linie lidských fetálních gliových buněk, které podporují množení JC viru. Proč. Natl Acad. Sci. USA 82, 1257–1261 (1985).
44. Hertzog, J. a kol. Infekce brazilským izolátem viru Zika vytváří RIG-I stimulační RNA a virový protein NS5 blokuje indukci a signalizaci IFN typu I. Eur. J. Immunol. 48, 1120–1136 (2018).
45. Cerikan, B. a kol. Buněčná vnitřní adaptace vyplývající z chronické ablace klíčového regulátoru rho GTPázy. Dev. Cela 39, 28–43 (2016).
46. Chan, YK & Gack, MU Fosfomimetický mechanismus viru dengue k antagonizaci vrozené imunity. Nat. Immunol. 17, 523–530 (2016).
47. Riedl, W. a kol. Virus Zika NS3 napodobuje buněčný 14-3-3-vazebný motiv, který antagonizuje vrozenou imunitu zprostředkovanou RIG-I a MDA5-. Cell Host Microbe 26, 493–503 (2019).
48. Ulane, CM, Rodriguez, JJ, Parisien, JP & Horvath, CM Všudypřítomnost a degradace STAT3 virem příušnic potlačuje signalizaci cytokinů a onkogenů. J. Virol. 77, 6385-6393 (2003).
49. Oudshoorn, D. a kol. HERC6 je hlavní E3 ligáza pro globální konjugaci ISG15 v myších buňkách. PLoS ONE 7, e29870 (2012).
50. Kim, DK a kol. Komplexní, flexibilní sbírka oblastí kódujících SARS-CoV-2. G3 (Bethesda) 10, 3399–3402 (2020).
51. Chiang, C. a kol. Onkoprotein E6 lidského papilomaviru se zaměřuje na USP15 a TRIM25 k potlačení vrozené imunitní signalizace zprostředkované RIG-I. J. Virol. 92, e01737-17 (2018).
52. Gack, MU a kol. Role RIG-I N-terminální tandemové CARD a sestřihové varianty v TRIM25-zprostředkované transdukci antivirového signálu. Proč. Natl Acad. Sci. USA 105, 16743–16748 (2008).
53. Chiang, JJ a kol. Virové demaskování buněčných 5S rRNA pseudogenových transkriptů indukuje imunitu zprostředkovanou RIG-I. Nat. Immunol. 19, 53–62 (2018).
54. Sparrer, KMJ a kol. TRIM23 zprostředkovává virem indukovanou autofagii prostřednictvím aktivace TBK1. Nat. Microbiol. 2, 1543–1557 (2017).
