Ztráta JAK1 způsobuje vrozenou imunitní nedostatečnost

Signální dráha Janus kinázy – signální převodníky a aktivátory transkripce (JAK-STAT) je kritická při ladění imunitních reakcí a její dysregulace je úzce spojena s rakovinou a imunitními poruchami. Narušení signální dráhy interleukinu (IL)-15/STAT5 v důsledku ztráty IL-15 receptorových řetězců, JAK3 nebo STAT5, vede k imunitním nedostatkům s abnormalitami buněk přirozených zabíječů (NK). JAK1 spolu s JAK3 přenáší signály downstream od IL-15, ale přesný příspěvek JAK1 k biologii NK buněk je třeba ještě objasnit. Pro studium důsledků deficitu JAK1 v NK buňkách jsme vytvořili myši s podmíněnou delecí JAK1 v NKp46+ buňkách (Jak1fl/flNcr1Cre). Ukazujeme zde, že delece JAK1 vlastnící NK buňce významně snížila počet NK buněk v kostní dřeni a narušila jejich vývoj. V souladu jsme pozorovali téměř úplnou ztrátu NK buněk ve slezině, krvi a játrech, což dokazuje zásadní roli JAK1 v periferních NK buňkách. V souladu, Jak1fl/+Ncr1Cre myši vykazovaly významně zhoršený dohled nad nádory zprostředkovaný NK buňkami. Naše data naznačují, že JAK2 není schopen kompenzovat ztrátu JAK1 v NK buňkách. Důležité je, že podmíněná delece JAK2 v NKp46+ buňkách neměla žádný účinek na periferní NK buňky, což ukazuje, že JAK2 vlastní NK buňce je pro přežití NK buněk nepostradatelný. V souhrnu jsme identifikovali, že ztráta JAK1 v NK buňkách řídí vrozenou imunitní nedostatečnost, zatímco nedostatek JAK2 ponechává počty NK buněk a dozrávání nezměněné. Navrhujeme tedy, že na rozdíl od v současnosti používaných inhibitorů JAK1/JAK2 by použití JAK2-specifických inhibitorů bylo pro pacienty výhodné tím, že by NK buňky zůstaly nedotčené.

Klíčová slova: JAK-STAT, přirozené zabíječské buňky, JAK1, JAK2, sledování nádorů

Výhody cistanche tubulosa-Antitumor

ÚVOD

Přirozené zabíječe (NK) jsou vrozené lymfocyty, které rozpoznávají a zabíjejí virově infikované nebo transformované buňky (1). Deficit NK buněk je vzácný, ale stále více oceňovaný podtyp primární imunodeficience (PID). Klasický nedostatek NK buněk je charakterizován absencí NK buněk v periferní krvi a má za následek zvýšenou náchylnost k virovým infekcím (2). Signální dráha Janus kinázy (JAK) – přenašeč signálu a aktivátor transkripce (STAT) působí po proudu více cytokinů, růstových faktorů a hormonů, čímž kriticky reguluje imunitní reakce (3, 4). Po navázání specifického ligandu na jeho příbuzný receptor vedou konformační změny k oligomerizaci receptoru a aktivaci JAK asociovaných s receptorem. JAK se auto- a trans-fosforylují navzájem a fosforylují receptorové řetězce, čímž poskytují dokovací místa pro molekuly STAT. STAT pak podstoupí fosforylaci zprostředkovanou JAK, dimerizují a translokují se do jádra, kde regulují transkripci cílových genů (5). JAK3 a STAT5 jsou klíčovými hráči při přenosu signálu downstream od cytokinů, které využívají c receptor (6). „Loss-of-function“ (LOF) mutace v genech kódujících JAK3 (7) nebo STAT5B (8) vedou k PID s abnormalitou NK buněk, což podtrhuje důležitost dráhy pro vrozené lymfocyty. Imunodeficience těchto pacientů byla vysvětlena zhoršenou odpovědí IL-7 a IL{19}} (6). Důležité je, že JAK1 má dominantní roli nad JAK3 při aktivaci STAT5 downstream od cytokinových receptorů obsahujících c (9). Je atraktivní spekulovat, že LOF mutace JAK1 by také mohly vést k PID. K dnešnímu dni byl identifikován pouze jeden pacient s mutacemi zárodečné linie JAK1, kde byl JAK1 redukován, ale ne chyběl, a skutečně se u něj projevila imunosuprese (10). U myší vede úplná ztráta JAK1 k perinatální letalitě a novorozené myši vykazují silnou redukci thymocytů a B buněk (11). Tato pozorování byla potvrzena u dospělých myší: indukovatelná delece JAK1 vede k narušení homeostázy hematopoetických kmenových buněk (HSC) a výrazně snižuje frekvence B buněk a podskupiny B220+CD11c+NK1.{37}} NK buňky (12). Dosud však žádná studie přímo neanalyzovala účinek ztráty JAK1 na konvenční NK buňky.

Cistanche deserticola ma- Udržování jater

První poznatky o příspěvku JAK1 k biologii NK buněk pocházejí ze studií využívajících inhibitory JAK – schválené léky pro léčbu rakoviny a autoimunitních onemocnění (13). Jak myši, tak pacienti léčení inhibitorem JAK1/JAK2 Ruxolitinibem vykazovali snížený počet NK buněk, zhoršené zrání a funkci (14, 15). Protože se JAK2 také účastní řízení diferenciace NK buněk (14, 16), zbývá objasnit, která z těchto dvou kináz je zodpovědná za pozorované účinky léčby ruxolitinibem. Pomocí myší s knockoutem Jak1 nebo Jak2 v buňkách NKp46+ zde ukazujeme, že JAK2 je pro přežití NK buněk postradatelný. Na rozdíl od toho delece JAK1 ve zralých NK buňkách vede k deficitu NK buněk a ztráta jedné alely Jak1 je dostatečná k narušení kontroly růstu nádoru. Identifikovali jsme tedy JAK1 jako klíčový faktor pro zralé NK buňky a vytvořili myší model klasického deficitu NK buněk.

MATERIÁLY A METODY

Myši a buněčné linie

Jak1fl/fl (C57BL/6N-Jak1tm1c(EUCOMM)Hmgu/H; laskavě poskytl Dr. Alexander Dohnal (CCRI, Vídeň, Rakousko). Alela Jak1tm1c mutantu byla vytvořena z myší s Jak1tm1a knockout první alelou (popsáno od International Mouse Phenotyping Consortium https://www.mousephenotype.org) excizí lacZ-neo kazety pomocí Flp-rekombinace.

Podmíněný potenciál Jak1fl/fl myší byl aktivován Cre-rekombinací a excizí loxP-lemovaného exonu 3 Jak1. Tkáňově specifická rekombinace byla indukována křížením Jak1fl/fl nebo Jak2fl/fl [Jak2tm1Kuw; (17)] s B6NTg(Ncr1Cre); (18) myši. Myši Stat5fl/fl (19) a Stat5fl/flNcr1Cre (18) byly popsány dříve. Myši Jak1fl/fl, Ncr1Cre, Stat5fl/fl, Stat5fl/flNcr1Cre byly na pozadí C57B6/N a Jak2fl/fl byly na smíšeném pozadí. Experimentální zvířata byla věkově shodná (8–12 týdnů) a chována ve specifických podmínkách bez patogenů na Univerzitě veterinárního lékařství ve Vídni podle pokynů Federace asociací pro vědu o laboratorních zvířatech (FELASA) (2014). Pokusy na zvířatech byly schváleny Výborem pro etiku a dobré životní podmínky zvířat Univerzity veterinárního lékařství ve Vídni a národním úřadem (rakouským federálním ministerstvem pro vědu a výzkum) podle §§ 26 a násl. zákona o experimentech na zvířatech, Tierversuchsgesetz 2012—TVG 2012, v rámci licencí BMWF-68.205/0218-II/3b/2012 a BMBWF-68.205/0174-V/3b /2018 a byly vedeny podle pokynů FELASA a ARRIVE. V celém dokumentu se Jak1WT vztahuje na sdružená data z myší Jak1fl/+ a Jak1fl/fl. Myší lymfomové buněčné linie RMA-Rael [laskavě poskytnuté prof. A. Cerwenkou; (20)] a YAC-1 byly kultivovány v kompletním médiu RPMI1640 (Sigma) obsahujícím 10 % FCS (Bio & Sell), 100 U/ml penicilinu, 100 mg/ml streptomycinu (Sigma) a 50 uM {{58 }}merkaptoethanol (Sigma).

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

In vivo nádorový model

Myším Jak1fl/+ a Jak1fl/+Ncr1Cre bylo subkutánně injikováno 106 buněk RMA-Rael do obou boků a růst nádoru byl monitorován každý druhý den. Deset dní po injekci byly myši usmrceny a byla stanovena hmotnost nádoru. Pro průtokovou cytometrickou analýzu NK buněk infiltrujících nádor byly nádory nařezány na kousky o velikosti přibližně 5 mm2 a suspenze jednotlivých buněk byla získána pomocí gentleMACSTM Octo Dissociator (Miltenyi Biotec) s štěpícím pufrem obsahujícím kolagenázu D (1 mg/ml; Sigma Aldrich) a DNAsa I (20 mg/ml; Roche).

Izolace, expanze a stimulace NK buněk

NK buňky byly izolovány ze slezinných jednobuněčných suspenzí pomocí DX5- značených kuliček MACS podle pokynů výrobce (Miltenyi Biotec). NK buňky byly expandovány v kompletním médiu RPMI1640 doplněném 5,000U/ml rhIL-2 (Proleukin, Novartis) po dobu 7 dnů. Počet buněk CD3-NK1.1+ byl hodnocen průtokovou cytometrií ve dnech 0, 3, 5 a 7. V den 7 byly buňky lyžovány pro analýzu Western blot. Pro analýzu pSTAT5 bylo 106 splenocytů stimulováno 50 ng/ml rmIL-15 (PeproTech) po dobu 15 minut a buňky byly fixovány ve 2% PFA s následnou permeabilizací methanolem a rehydratací.

Test cytotoxicity NK-buněk

Pro in vitro testy cytotoxicity byly DX5-MACS-tříděné NK buňky expandovány po dobu 7 dnů v IL-2, jak je popsáno výše a smíchány v uvedených poměrech efektor:cíl s karboxyfluorescein diacetát sukcinimidyl esterem (CFSE, Molecular Probes , CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit) označené cílové buňky. Po 4 hodinách inkubace při 37 °C byly buňky obarveny barvivem Sytox Blue Dead Cell Stain (Thermo Fischer) a specifická lýza cílových buněk byla hodnocena průtokovou cytometrií.

Průtoková cytometrie

Suspenze jednotlivých buněk byly připraveny ze sleziny, kostní dřeně nebo jater. Játra byla perfundována přes portální žílu 5–10 ml sterilního PBS. Separace lymfocytů byla provedena pomocí 37,5 % osobních (GE Healthcare). Pro analýzu krve byly erytrocyty lyžovány pomocí BD FACS Lysing Solution podle protokolu výrobce (BD Bioscience). Protilátky (klony) zacílené na následující proteiny byly zakoupeny od eBioscience: CD3 (17A2), CD3e (145-2C11), CD11b (M1/70), CD16/CD32 (93), CD19 (eBio1D3) CD27 (LG. 7F9), CD49b (DX5), CD122 (5H4), CD226 (10E5), Gr-1 (RB6-8C5), KLRG1 (2F1), Ly49A (A1), Ly49G2 (eBio4D11), NKG2A /C/E (20d5), NKG2D (CX5), NKp46 (29A1.4), NK1.1 (PK136) a Ter119 (TER-119). Protilátky CD49a (Ha31/8) a pSTAT5 [47/Stat5(pY694)] byly zakoupeny od BD Pharminogen a pan-Rael (186107) byly zakoupeny od R&D Systems. Celkový počet buněk byl hodnocen průtokovou cytometrií s použitím počítacích kuliček Count Bright Beads (Invitrogen). Experimenty s průtokovou cytometrií byly prováděny na BD FACSCanto II (BD Bioscience) nebo Cytoflex (Beckman Coulter) a analyzovány pomocí softwaru BD FACSDiva V8.0 (BD Bioscience), CytExpert (Beckman Coulter) nebo FlowJo V10 (FlowJo, LLC).

OBRÁZEK ​​1|Ztráta JAK1 v NKp46+ buňkách vede k téměř úplné absenci periferních NK buněk. (A) Frekvence (levý panel) a celkový počet (pravý panel) Lin−(CD3−CD19−Ly-6G−Ter119−) CD122+ NK buněk v kostní dřeni byly hodnoceny průtokem cytometrie. (B) Lin−CD122+ buňky kostní dřeně byly dále rozděleny na NK prekurzory (NKP: NKp46−NK1.1−), nezralé NK buňky (iNKs: NKp46−NK1.1+) a zralé NK buňky (mNK: NKp46+NK1.1+). (C) Frekvence CD3−NKp46+ NK buněk ve slezině byla hodnocena průtokovou cytometrií a jsou uvedeny reprezentativní grafy. (D, E) Frekvence (levý panel) a celkový počet (pravý panel) CD3−NKp46+ NK buněk v (D) slezině a (E) krvi byly hodnoceny průtokovou cytometrií. (F) Frekvence konvenčních NK buněk (CD3−NK1.1+NKp46+CD49b+, levý panel) a ILC1 buněk (CD3−NK1.1+NKp46+CD49a+ , pravý panel) byl analyzován v játrech myší Jak1WT, Jak1fl/+Ncr1Cre a Jak1fl/flNcr1Cre průtokovou cytometrií. (A, B,D–F) Sloupcové grafy představují průměr ± SEM 1–2 nezávislých experimentů; n=3–11. *p < 0.05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

OBRÁZEK ​​2|Zbývající Jak1fl/flNcr1Cre NK buňky vykazují nezralý fenotyp. (A, B) Slezinné CD3−NKp46+ NK buňky byly analyzovány na expresi CD27 a CD11b průtokovou cytometrií. (A) Je zobrazena frekvence buněk v každém stadiu zrání: DN (CD27 −CD11b−), CD27 (CD{{10}}}CD11b−), DP (CD27+CD11b+), CD11b (CD27−CD11b+). Celkový počet buněk v každé fázi zrání je znázorněn na obrázku S1C. (B) Jsou uvedeny reprezentativní grafy. (C) Buňky pSTAT5(Y694)+ byly analyzovány v populaci CD3−NKp46+NK1.1+ ex vivo po 15 minutách stimulace IL-15 průtokovou cytometrií. (D) Slezinné CD3−NKp{{30}} NK buňky byly analyzovány na expresi uvedených aktivačních a inhibičních receptorů průtokovou cytometrií. Je ukázáno procento NK buněk pozitivních pro každý receptor. Údaje o střední intenzitě fluorescence jsou uvedeny na obrázku S1D. (A–D) Sloupcové grafy a čísla na grafech představují průměr ± SEM ze 2 nezávislých experimentů; n=5–8. **p < 0,01, ***p < 0,001.

Western Blot

Buněčná lýza, SDS-PAGE a Western bloty byly provedeny tak, jak bylo popsáno dříve (21). Detekce chemiluminiscence byla provedena pomocí substrátu Clarity Western ECL (BioRad) a ChemiDocT XRS+ Molecular Imager (BioRad) a analyzována softwarem Image Lab (BioRad). Byly použity následující protilátky: anti--aktin (C4, sc{5}}) od Santa Cruz jako kontrola načítání, anti-JAK2 (D2E12; #3230), antiPerforin (#3693) a anti-JAK1 (#3332 ) od společnosti Cell Signaling Technology.

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche Enhance Immunity

【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Statistická analýza

Nespárované t-testy nebo jednocestné ANOVA s Tukey post-testy byly provedeny pomocí GraphPad Prism verze 5.00 (GraphPad Software). Hladina významnosti je uvedena pro každý experiment (∗p < 0.05; ∗∗p < 0,01; ∗∗∗p < 0,001).

VÝSLEDEK

Delece JAK1 snižuje počty NK buněk a ILC1 způsobem závislým na dávce

Bylo prokázáno, že inhibitor JAK1/JAK2 Ruxolitinib snižuje počet, zrání a funkci NK buněk (14, 15). Pro srovnání a řešení příspěvku JAK1 a JAK2 pro biologii NK buněk jsme vytvořili myši s podmíněnou delecí buď JAK1 nebo JAK2 v buňkách NKp46+. Zkřížili jsme tedy myši Ncr1Cre (18) s myšmi Jak1fl/fl nebo Jak2fl/fl [viz část Materiály a metody a (17)]. NK buňky se vyvíjejí v kostní dřeni z NK buněčných prekurzorů (NKP), které jsou definovány jako Lin−CD122+NK1.1−NKp46−. Vyvinou se v nezralé NK buňky (iNK), které se stanou NK1.{19}} zatímco pouze zralé NK buňky (mNK) jsou NK1.{21}}NKp46+ (22). Protože exprese Cre rekombinázy u myší Ncr1Cre je řízena promotorem NKp46, je delece zprostředkovaná Cre omezena na NK buňky. Pozorovali jsme významný pokles procenta a celkového počtu NK buněk kostní dřeně u Jak1fl/flNcr1Cre myší (obrázek 1A). Lin−CD122+ NK buňky u Jak1fl/flNcr1Cre myší vykazovaly obohacené procento prekurzorů NK buněk (NKP) a nezralých NK buněk, zatímco mNK byly významně sníženy v kostní dřeni v souladu s vývojovým blokem na iNK buňce stádium zabraňující progresi do stádia mNK buněk (obrázek 1B). Delece jedné alely Jak1 vedla ke střednímu počtu NK buněk kostní dřeně (obrázek 1A). V souladu s tím vývoj NK buněk vykazoval přechodný fenotyp naznačující účinek dávkování genu Jak1 na vývoj NK buněk (obrázek 1B). Blokáda ve vývoji NK buněk kostní dřeně se přenesla do drasticky sníženého počtu NK buněk na periferii. Ztráta JAK1 vedla k téměř úplnému nedostatku slezinných a krevních NK buněk (obrázky 1C–E). V souladu s účinkem dávkování genu Jak1 vykazovaly myši Jak1fl/+Ncr1Cre snížené procento NK buněk a celkový počet na 50 % ve srovnání se sourozenci divokého typu ve slezině a krvi (obrázky 1C–E). Delece JAK1 downstream efektoru a transkripčního faktoru STAT5 v NKp46+ buňkách také vede k redukci zralých NK buněk (18). Přímé srovnání myší Jak1fl/flNcr1Cre a Stat5fl/flNcr1Cre odhalilo, že delece JAK1 vyvolala ještě výraznější nedostatek NK buněk ve slezině a krvi než delece STAT5 (obrázky S1A, B). Jaterní NKp46+ vrozené lymfocyty zahrnují dvě skupiny odlišných linií (23). Konvenční NK buňky (cNK) jsou charakterizovány expresí CD49b a volně cirkulují, zatímco jaterní rezidentní vrozené lymfocyty typu 1 (ILC1) jsou charakterizovány expresí CD49a a jsou omezeny na játra (24). Podobně jako u sleziny a krve byly jaterní cNK a ILC1 rezidentní v tkáni téměř úplně odstraněny po ztrátě JAK1 (obrázek 1F). Opět delece jedné alely Jak1 vedla ke střednímu množství vrozených lymfocytů jater (obrázek 1F). V souhrnu nás tato zjištění vedla k závěru, že exprese JAK1 v NKp46+ buňkách je nepostradatelná pro vývoj a udržení NK buněk v periferních orgánech způsobem závislým na dávce.

JAK1 je rozhodující pro zrání NK buněk

Na periferii podstupují NK buňky kroky zrání, které jsou charakterizovány sekvenční expresí povrchových markerů CD27 a CD11b (22). Jedna alela Jak1 byla dostatečná k řízení zrání NK buněk, protože jsme nezjistili žádné rozdíly v procentech buněk v každém stadiu zrání mezi buňkami Jak1WT a Jak1fl/+Ncr1Cre (obrázky 2A, B). Zbývající NK buňky Jak1fl/flNcr1Cre vykazovaly nárůst nezralé populace (CD27+CD11b−) a pokles zralé populace CD27−CD11b+ (obrázky 2A, B a obrázek S1C). Tento výsledek naznačuje, že zbývající buňky mohly právě ztratit JAK1 a nedostaly dostatečnou IL-15 signalizaci k úplnému dozrání. Zbývající Jak1fl/flNcr1Cre NK buňky skutečně vykazovaly sníženou fosforylaci STAT5 ex vivo po krátkodobé stimulaci IL-15 (obrázek 2C). Aktivita NK buněk je řízena rovnováhou mezi aktivačními a inhibičními receptory. Delece ani jedné ani obou alel Jak1 neměla vliv na procento NK buněk exprimujících následující aktivační a inhibiční receptory: KLRG1, NKG2D, NKG2A/C/E a Ly49A (obrázek 2D). Nejvýraznějším rozdílem byl mírný pokles Ly49G2+ NK buněk a nárůst DNAM-1+ NK buněk u Jak1fl/flNcr1Cre myší (obrázek 2D). Podobně nebyly detekovány žádné velké rozdíly v hladině exprese (MFI) každého receptoru, kromě zvýšení MFI DNAM1 a Ly49G2 (obrázek S1D). Kromě své role jako aktivačního receptoru představuje exprese DNAM- 1 vývojový krok; Buňky DNAM-1+ dávají vzniknout buňkám DNAM-1− (25). Usoudili jsme, že změny v DNAM-1+ odrážejí blok zrání NK buněk Jak1fl/flNcr1Cre.

OBRÁZEK ​​3|JAK2 je postradatelný pro přežití a zrání NK buněk. (A) Frekvence (levý panel) a celkový počet (pravý panel) CD3 −NKp46+ NK buněk ve slezinách myší Jak2WT a Jak2fl/flNcr1Cre byly hodnoceny průtokovou cytometrií. (B) Slezinné CD3−NKp46+ NK buňky byly analyzovány na expresi CD27 a CD11b průtokovou cytometrií. Frekvence buněk v každé fázi zrání je uvedena: DN (CD27−CD11b−), CD27 (CD27+CD11b−), DP (CD27+CD11b+), CD11b (CD27−CD11b+). (C) Exprese JAK2 a -aktinu byla analyzována Western blotem v NK buňkách po 6 dnech expanze v IL-2. Skenování celých skvrn jsou k dispozici v doplňkovém materiálu. (A,B) Sloupcové grafy představují průměr ± SEM ze 2–3 nezávislých experimentů; n=5–12.

OBRÁZEK ​​4|Ztráta jedné alely Jak1 zhoršuje aktivitu NK buněk. (A) NK buňky byly MACS purifikovány ze sleziny a kultivovány v IL-2 po dobu 7 dnů. Počty žijících buněk CD3−NK1.1+NKp46+ byly hodnoceny každé 2–3 dny. Zobrazené symboly a chybové úsečky znamenají ± SEM 2–4 biologických replikátů. (B) Exprese JAK1, Perforinu a -aktinu byla analyzována v expandovaných NK buňkách ze dvou nezávislých experimentů pomocí Western blotu. Skenování celých skvrn jsou k dispozici v doplňkovém materiálu. (C) Expandované NK buňky z Jak1WT a Jak1fl/+Ncr1Cr myší byly smíchány s CFSE-barvenými YAC{{20}} (levý panel) nebo RMA-Rae1 (pravý panel) cílovými buňkami v uvedených efektorových cílových poměrech . Specifická lýza byla hodnocena průtokovou cytometrií. Pro YAC-1 je zobrazen reprezentativní graf jednoho ze dvou nezávislých experimentů. Symboly a chybové úsečky představují průměr ± SEM ze 2 technických replikátů. Pro RMA-Rae1 je uveden průměr ze dvou nezávislých experimentů. Zobrazené symboly a chybové úsečky znamenají ± SEM 2–3 biologických replikátů. *p < 0.05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

JAK2 je nepostradatelný pro přežití a zrání NK buněk

Dosud jsme ukázali, že delece JAK1 vnitřní NK buňky vede k deficitu NK buněk. Abychom objasnili, zda JAK2 ovlivňuje přežití a zrání NK buněk, analyzovali jsme NK buňky sleziny u myší Jak2fl/flNcr1Cre a jejich sourozenců divokého typu. Nepodařilo se nám detekovat žádný dopad delece JAK2 na frekvenci nebo celkový počet buněk CD3−NKp46+ ve slezině (obrázek 3A). Kromě toho myši Jak2fl/flNcr1Cre vykazovaly normální zrání NK buněk, protože podobná procenta CD27-CD11b+ buněk byla detekována v obou genotypech (obrázek 3B). Protože delece proteinu JAK2 v NK buňkách byla velmi účinná (obrázek 3C), tato data jednoznačně definují, že na rozdíl od JAK1 je JAK2 vlastní NK buňce pro přežití a zrání NK buněk nepostradatelný.

cistanche výhody pro muže-posilují imunitní systém

Ztráta jedné alely Jak1 narušuje funkčnost NK buněk

Abychom získali další informace o tom, jak JAK1 reguluje funkčnost NK buněk, analyzovali jsme růst MACS-purifikovaných slezinných NK buněk z Jak1WT, Jak1fl/+Ncr1Cre a Jak1fl/flNcr1Cre. JAK1-deficientní NK buňky neexpandovaly, což ukazuje, že i při velmi vysoké dávce IL-2 jiné JAK nemohou kompenzovat ztrátu JAK1 (obrázek 4A). Ztráta jedné alely Jak1 vedla k malému deficitu růstu (obrázek 4A). Analýza Western blot potvrdila sníženou expresi proteinu JAK1 v expandovaných buňkách Jak1fl/+Ncr1Cre NK, která byla souběžná se sníženými hladinami perforinu (obrázek 4B). V řadě Jak1fl/+Ncr1Cre NK buňky vykazovaly zhoršenou cytotoxickou aktivitu proti cílovým buněčným liniím YAC-1 a RMA-Rae1 (obrázek 4C). Tyto výsledky dokazují, že JAK1 je nejen nepostradatelný pro udržení NK buněk na periferii, ale také přispívá k jejich cytotoxické aktivitě.

Deplece NK buněk vyvolaná ztrátou jedné alely Jak1 zhoršuje sledování nádorů

NK buňky jsou klíčové pro včasné rozpoznání a eliminaci transformovaných buněk. Abychom zjistili, zda redukce NK buněk a jejich narušená funkčnost u Jak1fl/+Ncr1Cre myší vede ke zvýšené náchylnosti k růstu nádoru a není kompenzována jinými prostředky, použili jsme buňky lymfomu RMA-Rae1. Tato buněčná linie je nástrojem pro studium sledování nádorů závislých na NK buňkách robustním a účinným způsobem (20). Subkutánně jsme transplantovali buňky lymfomu RMA-Rae1 do obou boků myší Jak1fl/+ a Jak1fl/+Ncr1Cre. Chybějící jedna alela Jak1 narušila schopnost NK buněk kontrolovat růst nádoru, jak je ilustrováno zvýšenou velikostí nádoru (obrázek 5A) a hmotností nádoru v Jak1fl/+Ncr1Cre (obrázek 5B). V řadě tyto nádory vykazovaly významně sníženou infiltraci NK buňkami (obrázky 5C, D). Nepodařilo se nám detekovat žádný rozdíl ve frekvenci NK buněk infiltrujících nádor NKG2D+ (obrázek 5E), které jsou klíčové pro rozpoznání nádorů RMA-Rae1. V souhrnu naše výsledky ukazují, že snížený počet NK buněk v kombinaci se zhoršenou funkčností NK buněk u Jak1fl/+Ncr1Cre myší jsou dostatečné k tomu, aby významně narušily kontrolu růstu nádoru in vivo.

OBRÁZEK ​​5|Ztráta jedné alely Jak1 zhoršuje sledování nádorů. (A, B) Myším Jak1fl/+ a Jak1fl/+Ncr1Cre bylo subkutánně injikováno 106 buněk RMA-Rae1 a po 10 dnech byla vyhodnocena hmotnost nádoru. Jsou ukázány (A) reprezentativní obrázky nádorů a (B) bodové grafy s horizontálními čarami představujícími střední hmotnosti nádorů ± SEM ze 2 nezávislých experimentů; n=6–8 (C, D) NK buňky infiltrující nádor byly analyzovány průtokovou cytometrií. (C) Jsou uvedeny reprezentativní grafy buněk CD3−NKp46+ infiltrujících nádor a jejich procento mezi buňkami Rae1−. (D) Celkový počet buněk CD3−NKp46+ infiltrujících nádor na gram nádoru a (E) procenta buněk NKG2D+ NK jsou uvedeny jako sloupcové grafy znázorňující průměr ± SEM z jednoho experimentu n=4– 5. ***p < 0,001.

DISKUSE

Dysregulace signální dráhy JAK-STAT je úzce spojena s rozvojem rakoviny a také s poruchami imunity (7). Prvním objeveným onemocněním spojeným s JAK byla těžká kombinovaná imunodeficience (SCID), která byla charakterizována abnormalitami NK buněk způsobenými mutacemi LOF JAK3 (26, 27). Zde ukazujeme, že delece JAK1 v NKp46+ buňkách vede k vrozené imunitní nedostatečnosti se ztrátou NK a ILC1 buněk v periferních orgánech, zatímco JAK2 je redundantní pro přežití a zrání NK buněk. Naše předchozí práce odhalila, že ztráta STAT5 v NK buňkách vede k závažnému snížení počtu NK buněk v periferních orgánech (18). Ztráta NK buněk u Stat5fl/flNcr1Cre myší byla zachráněna vynucenou expresí pro-přežití molekuly BCL2 (28). Tato studie definovala STAT5 jako rozhodující faktor přežití pro NK buňky. Myším s deficitem STAT5B do značné míry chybí NK buňky (29), v souladu se skutečností, že STAT5 signalizuje downstream od cytokinů, které jsou životně důležité pro biologii NK buněk, jako je IL-2 nebo IL-15 (30). IL-15 je rozhodující pro vývoj a přežití NK buněk, protože myši Il15−/− do značné míry postrádají periferní NK buňky (31). IL-15 signalizuje prostřednictvím receptorového komplexu c receptorového řetězce, IL-2R a IL-15r (32). Knockout myši každého receptorového řetězce prokázaly naprosto kritickou roli pro signály vysílané downstream od IL-15 pro vývoj NK buněk (33, 34). K dnešnímu dni byl příspěvek c-asociované JAK3 k vývoji NK buněk dobře prokázán. Myši s deficitem JAK3 vykazují podobný fenotyp SCID, jaký byl pozorován u lidských pacientů, a vývoj NK buněk je blokován ve stádiu pre-NK progenitoru (35, 36). Nyní zařazujeme dříve nedoceněnou JAK1 jako klíčovou součást osy IL-15/STAT5 v NK buňkách. Jak1fl/flNcr1Cre NK buňky vykazují vývojový blok ve stádiu iNK buněk a téměř úplnou ztrátu NK buněk v periferních orgánech.

Je zajímavé, že důsledky delece JAK1 pro NK buňky převyšují účinky STAT5-deficience. Zhoršení kombinované aktivace STAT3 a STAT5 může být základem výraznější ztráty NK buněk, protože bylo prokázáno, že STAT3 indukuje expresi klíčového genu pro přežití NK buněk Mcl1 (37, 38). Alternativně mohou mít JAK1 a STAT5 různé poločasy, které odpovídají za různé frekvence „jen eliminátorů“ – NK buněk, které právě ztratily gen, ale stále nesou protein, což může vysvětlovat rozdíly. Vliv nedostatku JAK1- na dávkování genů se odráží v počtu NK buněk, zatímco ztráta jedné alely JAK1 je pro zrání NK buněk postradatelná. To naznačuje, že aktivovaný STAT5 omezuje rychlost přežití NK buněk, ale ne zrání. Delece jedné alely Jak1 je také dostatečná k významnému zhoršení dohledu nad nádorem na základě sníženého počtu NK buněk v kombinaci se sníženou funkčností zbývajících NK buněk. V souladu s našimi údaji vede delece cílového genu STAT5 Mcl1 specifická pro NK buňky k vážnému deficitu NK buněk, který způsobuje významné zvýšení metastatické zátěže (38).

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

JAK mohou vykazovat redundantní funkce a vzájemně se kompenzovat. Downstream od interferonového receptoru JAK1 může částečně kompenzovat ztrátu aktivity kinázy JAK2 (39). Bylo také ukázáno, že JAK2 fosforyluje STAT5 downstream od IL-15 během in vitro diferenciace NK buněk (16). Na druhou stranu, konstitutivně aktivní JAK2 může pouze mírně kompenzovat ztrátu JAK1 v kmenových buňkách, což naznačuje neredundantní roli JAK1 a 2 v HSC. V souladu s tím jsme pozorovali, že v nepřítomnosti JAK1 se JAK2 nedaří kompenzovat aktivaci STAT5, a to ani při vysoké dávce IL-2 in vitro, aby umožnilo přežití NK buněk. Zbývá objasnit, zda jsou kompenzační účinky dosažitelné expresí konstitutivně aktivní formy JAK2. Ještě důležitější je, že jsme ukázali, že ztráta JAK2 v NKp46+ buňkách je pro přežití NK buněk postradatelná. NK buňky s deficitem JAK2-jsou plně zralé, což dokazuje, že JAK2 vlastní NK buňce neřídí zrání NK buněk. To také ukazuje, že zhoršené zrání NK buněk u Jak2fl/flMx1Cre myší (14) je s největší pravděpodobností způsobeno vnějšími funkcemi JAK2 NK buňkami. Dalo by se spekulovat, že konstitutivní delece JAK2 mění prostředí cytokinů.

REFERENCE

1. Abel AM, Yang C, Thakar MS, Malarkannan S. Přirozené zabíječské buňky: vývoj, zrání a klinické využití. Front Immunol. (2018) 9:1869. doi: 10.3389/fimmu.2018.01869

2. Orange JS. Nedostatek přirozených zabíječských buněk. J Allergy Clin Immunol. (2013) 132:515–25. doi: 10.1016/j.jaci.2013.07.020

3. O'Shea JJ, Plenge R. JAK a STAT signalizační molekuly v imunoregulaci a imunitně zprostředkovaných onemocněních. Imunita (2012) 36:542–50. doi: 10.1016/j.immuni.2012.03.014

4. Stark GR, Darnell JE. Cesta JAK-STAT ve dvaceti. Imunita (2012) 36:503–14. doi: 10.1016/j.immuni.2012.03.013

5. Shuai K, Liu B. Regulace signalizace JAK-STAT v imunitním systému. Nat Rev Immunol. (2003) 3:900–11. doi: 10.1038/nri1226

6. O'Shea JJ, Holland SM, Staudt LM. JAK a STAT v imunitě, imunodeficienci a rakovině. N Engl J Med. (2013) 368:161–70. doi: 10.1056/NEJMra1202117

7. Hammarén HM, Virtanen AT, Raivola J, Silvennoinen O. Regulace JAKs v cytokinové signalizaci a její rozpad při onemocnění. Cytokin (2018). doi 10.1016/j.cyto.2018.03.041. [EPUB před tiskem].

8. Lorenzini T, Dotta L, Giacomelli M, Vairo D, Badolato R. Mutace STAT jako přepínače programů: přeměna primárních imunodeficiencí na autoimunitní onemocnění. J Leukoc Biol. (2017) 101:29–38. doi: 10.1189/jlb.5RI0516-237RR

9. Haan C, Rolvering C, Raulf F, Kapp M, Drückes P, Thoma G, et al. Jak1 má dominantní roli nad Jak3 v přenosu signálu prostřednictvím cytokinových receptorů obsahujících c. Chem Biol. (2011) 18:314–23. doi: 10.1016/j.chembiol.2011

10. Eletto D, Burns SO, Angulo I, Plagnol V, Gilmour KC, Henriquez F, et al. Bialelické mutace JAK1 u imunodeficientního pacienta s mykobakteriální infekcí. Nat Commun. (2016) 7:13992. doi: 10.1038/ncomms13992

11. Rodig SJ, Meraz MA, White JM, Lampe PA, Riley JK, Arthur CD, et al. Narušení genu Jak1 demonstruje obligatorní a neredundantní role Jaků v cytokinem indukovaných biologických odpovědích. Cell (1998) 93:373-83.

12. Kleppe M, Spitzer MH, Li S, Hill CE, Dong L, Papalexi E, a kol. Jak1 Integruje snímání cytokinů k regulaci funkce hematopoetických kmenových buněk a stresové krvetvorby. Cell Stem Cell (2018) 22:277. doi: 10.1016/j.stem.2017 13. Schwartz DM, Kanno Y, Villarino A, Ward M, Gadina M, O'Shea JJ. Inhibice JAK jako terapeutická strategie pro imunitní a zánětlivá onemocnění. Nat Rev Drug Discov. (2017) 16:843–62. doi: 10.1038/nrd.2017.201

14. Bottos A, Gotthardt D, Gill JW, Gattelli A, Frei A, Tzankov A, et al. Snížený imunosurveillance NK-buněčných nádorů v důsledku inhibice JAK zvyšuje metastázy v modelech rakoviny prsu. Nat Commun. (2016) 7:12258. doi: 10.1038/ncomms12258

15. Schönberg K, Rudolph J, Vonnahme M, Parampalli Yajnanarayana S, Cornez I, Hejazi M, et al. Inhibice JAK narušuje funkci NK buněk u myeloproliferativních novotvarů. Cancer Res. (2015) 75:2187–99. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-14-3198

16. Kim WS, Kim MJ, Kim DO, Byun JE, Huy H, Song HY a kol. Supresor cytokinové signalizace 2 negativně reguluje diferenciaci NK buněk inhibicí aktivity JAK2. Sci Rep. (2017) 7:46153. doi: 10.1038/srep46153

17. Krempler A, Qi Y, Triplett AA, Zhu J, Rui H, Wagner KU. Generování podmíněné knockout alely pro gen Janus kinázy 2 (Jak2) u myší. Genesis (2004) 40:52–7. doi: 10.1002/gene.20063

18. Eckelhart E, Warsch W, Zebedin E, Simma O, Stoiber D, Kolbe T a kol. Nová myš Ncr1 -Cre odhaluje zásadní roli STAT5 pro přežití a vývoj NK-buněk. Krev (2011) 117:1565–74. doi: 10,1182/krev{10}}

19. Cui Y, Riedlinger G, Miyoshi K, Tang W, Li C, Deng C, a kol. Inaktivace Stat5 v epitelu myší mléčné žlázy během těhotenství odhaluje odlišné funkce v buněčné proliferaci, přežití a diferenciaci. Mol Cell Biol. (2004) 18:8037–47. doi: 10.1128/MCB.24.18.{10}}.2004

20. Cerwenka A, Baron JL, Lanier LL. Ektopická exprese časně indukovatelného -1 genu kyseliny retinové (RAE-1) umožňuje rejekci nádoru nesoucího MHC třídy I in vivo zprostředkovanou přirozenými zabíječskými buňkami. Proč Natl Acad Sci USA. (2001) 98:11521-6. doi: 10.1073/pnas.201238598

21. Putz E, Gotthardt D, Hoermann G, Csiszar A, Wirth S, Berger A, et al. Fosforylace STAT1-S727 zprostředkovaná CDK8-omezuje cytotoxicitu NK buněk a sledování nádorů. Cell Rep. (2013) 4:437–44. doi: 10.1016/j.celrep.2013.07.012

22. Geiger TL, Sun JC. Vývoj a zrání přirozených zabíječských buněk. Curr Opin Immunol. (2016) 39:82–9. doi: 10.1016/j.coi.2016.01.007

23. Sojka DK, Plougastel-Douglas B, Yang L, Pak-Wittel M, Artyomov MN, Ivanova Y, et al. Buňky přirozeného zabíječe (NK) rezidentní v tkáni jsou buněčné linie odlišné od brzlíkových a konvenčních NK buněk sleziny. Elife (2014) 3:e01659. doi: 10.7554/eLife.01659

24. Peng H, Jiang X, Chen Y, Sojka DK, Wei H, Gao X a kol. NK buňky rezidentní v játrech poskytují adaptivní imunitu při zánětu při kontaktu s kůží. J Clin Invest. (2013) 123:1444–56. doi: 10.1172/JCI66381

25. Martinet L, Ferrari De Andrade L, Guillerey C, Lee JS, Liu J, Souza-Fonseca Guimaraes F, et al. Exprese DNAM-1 označuje alternativní program zrání NK buněk. Cell Rep. (2015) 11:85–97. doi: 10.1016/j.celrep.2015. 03.006

26. Macchi P, Villa A, Giliani S, Sacco MG, Frattini A, Porta F a kol. Mutace genu Jak-3 u pacientů s autozomální těžkou kombinovanou imunodeficiencí (SCID). Nature (1995) 377 (6544): 65–8.

27. Russell SM, Tayebi N, Nakajima H, Riedy MC, Roberts JL, Aman MJ a kol. Mutace Jak3 u pacienta s SCID: zásadní role Jak3 v lymfoidním vývoji. Science (1995) 270:797-800.

28. Gotthardt D, Putz EM, Grundschober E, Prchal-Murphy M, Straka E, Kudweis P a kol. STAT5 je klíčový regulátor v NK buňkách a působí jako molekulární přepínač od sledování nádorů k podpoře nádorů. Cancer Discov. (2016) 4:414–29. doi: 10.1158/2159-8290.CD-15-0732

29. Villarino AV, Sciumè G, Davis FP, Iwata S, Zitti B, Robinson GW a kol. Prahové hodnoty STAT5 definované podskupinou a tkání řídí homeostázu a funkci vrozených lymfoidních buněk. J Exp Med. (2017) 214:2999–3014. doi: 10.1084/jem.20150907

30. Marçais A, Viel S, Grau M, Henry T, Marvel J, Walzer T. Regulace vývoje a funkce myších NK buněk cytokiny. Front Immunol. (2013) 4:450. doi: 10.3389/fimmu.2013.00450

31. Kennedy MK, Glaccum M, Brown SN, Butz EA, Viney JL, Embers M a kol. Reverzibilní defekty v přirozených zabíječských a paměťových CD8 T buněčných liniích u myší s deficitem interleukinu 15-. J Exp Med. (2000) 191:771-80. doi: 10.1084/jem.191.5.771

32. Ikemizu S, Chirifu M, Davis SJ. Signální komplexy IL-2 a IL-15: různé, ale stejné. Nat Immunol. (2012) 13:1141–2. doi: 10.1038/ni.2472

33. Williams NS, Klem J, Puzanov IJ, Sivakumar PV, Schatzle JD, Bennett M, et al. Diferenciace přirozených zabíječských buněk: poznatky z modelů knockout a transgenních myší a systémů in vitro. Immunol Rev. (1998) 165:47-61.

34. Lodolce JP, Boone DL, Chai S, Swain RE, Dassopoulos T, Trettin S, et al. IL-15 receptor udržuje lymfoidní homeostázu tím, že podporuje navádění lymfocytů a proliferaci. Imunita (1998) 9:669–76.

35. Park SY, Saijo K, Takahashi T, Osawa M, Arase H, Hirayama N, et al. Vývojové defekty lymfoidních buněk u myší s deficitem Jak3 kinázy. Imunita (1995) 3:771–82.

36. Robinette ML, Cella M, Telliez JB, Ulland TK, Barrow AD, Capuder K a kol. Nedostatek Jak3 blokuje vývoj vrozených lymfoidních buněk. Mucosal Immunol. (2017) 1:50–60. doi: 10.1038/mi.2017.38 37. Abdulghani J, Allen JE, Dicker DT, Liu YY, Goldenberg D, Smith CD a kol. Sorafenib senzibilizuje solidní nádory k Apo2L/TRAIL a agonistickým protilátkám receptoru Apo2L/TRAIL pomocí osy Jak2-Stat3-Mcl1. PLoS ONE (2013) 8:e75414. doi: 10.1371/journal.pone.0075414

38. Sathe P, Delconte RB, Souza-Fonseca-Guimaraes F, Seillet C, Chopin M, Vandenberg CJ a kol. Vrozená imunodeficience po genetické ablaci Mcl1 v přirozených zabíječských buňkách. Nat Commun. (2014) 5:4539. doi: 10.1038/ncomms5539

39. Keil E, Finkenstädt D, Wufka C, Trilling M, Liebfried P, Strobl B a kol. Důležitá funkce skafoldu Janus kinázy 2 odkrytá novým myším modelem obsahujícím mutaci Jak2 aktivační smyčka. Krev (2014) 123:520–9. doi: 10,1182/krev{10}}