In vivo podávání střevních bakteriálních konsorcií replikuje urolithinové metabotypy A a B v modelu potkanů ​​neprodukujících urolitinⅠ

Po desetiletí byla konzumace ellagitanninů (ET) a kyseliny ellagové (EA) spojována s četnými biologickými účinky, včetně antioxidačních, protirakovinných, protizánětlivých, antibakteriálních a anti-HIV replikačních aktivit.1 Nicméně absorpce a biologická dostupnost ET a EA jsou velmi špatné. Předchozí studie na lidech zjistily, že vylučování EA a EA-O-glukuronidu močí je méně než 1 % příjmu.2,3Nicméně, zatímco absorpce ET a EA je nízká, jsou dále metabolizovány střevní mikroflórou na urolitiny (Uros), které jsou odpovědné, alespoň částečně, za příznivé účinky potravin bohatých na ET a (nebo) EA.1,4

Klikněte na projímadlo

Nejprve je EA uvolňována hydrolýzou esterových vazeb ET enzymem známým jako ellagitanáza.5 EA podléhá další degradaci za vzniku derivátů 6H-dibenzo[b,d]pyran-6-onu zvaného Uros. Tato kaskáda reakcí začíná štěpením laktonového kruhu enzymem laktonázou, což vede ke vzniku kyseliny luteové, která je následně dekarboxylována na pentahydroxy-Uro (Uro-M5). Následná dehydroxylace ji převádí na tetrahydroxy-Uros (Uro-D, Uro-E a Uro-M6) a trihydroxy-Uros (Uro-C, UroM7 a Uro-G), aby se nakonec získaly dihydroxy-Uros (Uro-A a isoUro-A) a monohydroxy-Uro (Uro-B), přičemž posledně jmenovaný je obecně detekován kdy se vyrábí i isoUro-A.1

Široká variabilita metabolických profilů Uro detekovaná u lidí po konzumaci potravin bohatých na ET ukazuje na interindividuální rozdíly v mikrobiotě tlustého střeva zodpovědné za degradaci ET.6–8 Mnoho možných interakcí mezi střevními bakteriemi a hostitelským organismem by mohlo vysvětlit různé metabolické osudy dietních (poly )fenoly.6,9 Tato obousměrná interakce mezi střevní mikroflórou a (poly)fenoly podnítila vědeckou komunitu k seskupení populace na základě jejichmetabolický fenotyp (kovový typ), aby se vysvětlily rozdíly v účincích polyfenolů.10,11 Přesněji řečeno, podle metabolismu ET a EA lze jednotlivce stratifikovat do urometabotypů (UM) spojených se složením a funkčností střevního mikrobiomu.7,8,12

U západní a východní populace byly popsány tři lidské UM (UM-A, UM-B a UM-0) související se třemi různými profily produkce Uro.13–15 V tomto ohledu jedinci s metabotypem A (UM-A) produkují několik intermediárních Uros, ale pouze urolitin A (Uro-A), hlavní absorbovaný Uro v tomto UM, na konci mikrobiální katabolické dráhy. Jedinci s metabotypem B (UM-B) produkují některé přechodné Uros a tři konečné Uros, tj. urolitin B (Uro-B), urolitin A (IsoUro-A) a Uro-A, což jsou hlavní absorbované Uros v UM-B. Meziprodukty Uros by tedy mohly působit primárně ve střevě, zatímco ty konečné by mohly mít lokální a systémové účinky.6 Naproti tomu jedinci s typem kovu 0 (UM{14}}) nemohou produkovat tyto konečné Uros (pouze dosud byl detekován prekurzor Urolitin-M5, který se neabsorbuje ve střevě).

Rozdíly v Uroprofilech byly pozorovány mezi UM a podél tlustého střeva, což ukazuje na převládající produkci Uro v oblasti distálního tlustého střeva.16–19 Je pozoruhodné, že procento UM-0 u zdravých dobrovolníků ze Španělska a Číny je přibližně 10 % a mohlo by být ještě vyšší v populace USA.13–15 Bakteriální rody Gordonibacter a Ellagibacter byly identifikovány jako schopné metabolizovat EA na některé Uros.20–23Bylo však zjištěno, že některé meziprodukty (například Uro-D, Uro-E, Uro- M7 a Uro-G) a finální Uros (Uro-A a Uro-B) se neprodukují v čistých kulturách těchto bakterií, což znamená, že sadu Uros, které konfigurují UM-A i UM-B, musí doplnit další bakterie. . Nedávno byla identifikována střevní bakteriální konsorcia zapojená do metabolismu EA za vzniku metabotypů produkujících uroprodukce (UM-A a UM-B) in vitro.24

Bakteriální konsorcia obsahující rody Gordonibacter plus Enterocloster a Ellagibacter plus Enterocloster produkovala in vitro urolitiny spojené s UM-A a UM-B, v tomto pořadí. je stále neznámý. Kromě toho je bezpečnost konzumace těchto bakterií produkujících Uro jako nových probiotik stále nejistá, protože nebyly dříve testovány na zvířatech ani na lidech. V této studii byla výše uvedená bakteriální konsorcia hodnocena z hlediska jejich schopnosti kolonizovat střevo Uro-neprodukujících (UM-0-podobných) potkanů ​​a přeměnit je na Uroproducenty napodobující UM-A a UM-B, v daném pořadí. Byla také hodnocena bezpečnost těchto bakteriálních konsorcií. Kromě toho byly vyvinuty dva nové postupy založené na kvantitativní PCR v reálném čase (qPCR) pro detekci a kvantifikaci Ellagibacter a Enterocloster ve vzorcích stolice.

Materiály a metody

Chemikálie a činidla

Uros byly chemicky syntetizovány a čištěny společností VillapharmaResearch SL (Parque Tecnológico de Fuente Álamo, Murcia, Španělsko). EA byl zakoupen od Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). Fosfátový pufr fyziologický roztok (PBS) byl získán od FisherScientific (USA), zatímco methanol, ethanol a kyselina mravenčí byly od Panreac Química (Barcelona, ​​Španělsko). Rozpouštědla pro kapalinovou chromatografii-hmotnostní spektrometrii (LC-MS) byla zakoupena od JT Baker (Deventer, Nizozemsko). Během studie byla použita voda UltrapureMillipore (Bedford, MA, USA). Všechny chemikálie a činidla byly analytické čistoty.

Příprava bakteriálních konsorcií

Gordonibacter urolithinfaciens DSM 27213T, Ellagibacter isourolitinifaciens DSM 104140T a Enterocloster šroubovaný CEBASS4A9, všechny izolovány a identifikovány v naší laboratoři (CEBAS-CSIC mLilerobically kultivované, Španělsko5W), byly a -Chalgren anaerobní médium (WAM, Oxoid) zkumavky při 37 stupních po dobu 48 hodin v anaerobní komoře Concept 400 (BakerRuskin Technologies Ltd, Bridgend, South Wales, UK) a resuspendované v PBS doplněném 10 % glycerolu a 0,05 % L-cystein hydrochloridu (PanReac Química, Barcelona, ​​Španělsko). Po anaerobní inkubaci byla připravena konsorcia.24,25 Stručně řečeno, „bakteriální konsorcium A“ obsahovalo G. kmeny urolithinfaciens a E. bolteae; "bakteriální konsorcium B" obsahovalo kultury E. isourolitinifaciens a E. bolteae; a "kontrolní koktejl" obsahoval sterilní PBS s 10 % glycerolu a 0,05 % L-cystein hydrochloridu. Před podáním byly všechny koktejly rozděleny do 3,5 ml alikvotů a udržovány při -80 stupních.

Zvířata, diety a experimentální design

Experimentální protokol (referenční číslo 624/2020) schválila místní vláda, bioetický výbor Španělské národní výzkumné rady (Madrid, Španělsko) a etický výbor pro experimentování na zvířatech z University of Murcia (Španělsko). Pokusy se řídily doporučeními Evropské unie týkajícími se pokusů na zvířatech (směrnice Evropského parlamentu a Rady 2010/63/EU o ochraně zvířat používaných pro vědecké účely). Krysy Wistar (n=18; 9 samic a 9 samců) o hmotnosti 240 ± 31 g byly získány z Envigo (Barcelona, ​​Španělsko). Tento potkaní model byl vybrán na základě jeho neschopnosti produkovat Uros pozorované v našich předběžných studiích, ve kterých byly testovány vzorky stolice z různých potkaních modelů. Byly vytvořeny tři skupiny (A, B a C) náhodným přiřazením 6 zvířat každé (3 samice a 3 samci potkanů ) na skupinu (obr. 1).

Každá skupina potkanů ​​byla umístěna ve dvou různých klecích, rozdělených podle pohlaví, v místnosti s řízenou teplotou (22 ± 2 stupně) s 55 ± 10% relativní vlhkostí a řízeným cyklem světlo-tma (12 h). Krysy dostávaly standardní stravu (Teklad, Barcelona, ​​Španělsko) obsahující (%/100 g čerstvé hmotnosti) 14,3 % bílkovin (kukuřičná lepková moučka), 48 % sacharidů (pšeničné krupice, mletá pšenice, mletá kukuřice) a 4 % tuku (sójový olej). ), hustota energie 2,9 kcal g-1 a 4,1 % surové vlákniny, doplněné EA práškem O čistotě vyšší nebo rovné 95 % (3,6 mg na 100 g chow). EA byl homogenně smíchán s mletým standardním krmivem, znovu peletován a lyofilizován. Strava obohacená o EA byla skladována mimo vlhkost a světlo. Dávka EA podaná dopotkanů ​​ve stravě bylo přibližně 0,72 mg na potkana za den (EA1× dieta), ekvivalentní dávka pro člověka 41 mg denně -1,26 Všechny skupiny byly krmeny dietou EA 1× a vodou z vodovodu ad libitum po celou dobu experimentu ( 5 týdnů). Protože EA detekovaná ve vzorcích stolice byla během prvního týdne nízká, bylo v následujících dnech přidáno trochu EA navíc. V týdnu 3 byla zvířatům orálně podávána žaludeční sondou další dávka 1,5 mg EA na potkana za den rozpuštěná ve vodě (celkem=EA 3x dieta), která byla podávána pouze po dobu 1 týdne. Nakonec, v týdnu 4, bylo do EA 1× diety přidáno ≈5 g vlašských ořechů na potkana a den (další zdroj EA) a byly udržovány až do konce studie, aby se vyhodnotil dopad EA obsahující potravinovou matrici na schopnost bakterií vyrábět Uros. Hmotnost, příjem potravy a vody byly měřeny každý den. Střevní bakteriální konsorcia byla podávána orálně sondou. Skupina A obdržela 500 ul bakteriálního koktejlu A, skupina B obdržela 500 ul bakteriálního koktejlu B a skupina C (kontrola) obdržela 500 ul PBS. Orální sonda byla prováděna každé 2 dny během prvních dvou týdnů a každý den během následujících 2 týdnů. V posledním týdnu (28. až 32. den) zvířata pokračovala ve stejné stravě doplněné o EA a vlašské ořechy, ale bez orálního podávání bakterií. Na konci studie byla zvířata usmrcena pomocí CO2 komory.

Postupy odběru vzorků

Vzorky stolice byly odebrány během studie pro Uro analýzu pomocí UPLC-ESI-QTOF-MS/MS a střevní mikroflóra pomocí sekvenování 16S rRNAgenu a qPCR. Krev byla extrahována v různých časových bodech (základní stav, 28. den a konec studie) pro hematologické a biochemické analýzy séra. Vzorky krve byly odebrány z ocasní žíly (≈500 µl) a odebírány do zkumavek obsahujících heparin na začátku a 28. a 32. den (obr. 1). Separace plazmy byla provedena okamžitě centrifugací při 3000 g po dobu 10 minut při 4 stupních a zmrazená při - 80 stupňů až do dalšího stanovení sérobiochemických proměnných. Játra, ledviny a slezina byly odebrány, zváženy a vyšetřeny, aby se zjistily jakékoli morfologické rozdíly při usmrcení.

Návrh a optimalizace primerů a sond pro kvantifikaci Ellagibacter a Enterocloster pomocí qPCR

Sekvence 16S rRNA genů Ellagibacter isourolitinifaciens DSM 104140T a E. bolted CEBAS S4A9 byly získány z databáze GenBank (databáze EMBL). Sekvence byly porovnány s fylogeneticky blízkou bakteriální generací pomocí softwaru Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA 11) a kontrolovány na oblasti konzervovaných a variabilních sekvencí pro navržení primerů a sondy pro detekci a kvantifikaci Ellagibacter a Enterocloster (tabulka 1). Sonda primersand byla navržena a ověřena pomocí nástrojů Primer Questand Oligo Analyzer (Integrated DNATechnologies, Inc., Belgie). Sonda TaqMan byla označena na 5′ a 3′ koncích 6-karboxyfluoresceinovou skupinou (6FAM) a blackberry quencher (BBQ), v tomto pořadí. qPCR byla provedena za použití detekčního systému ABI 7500. Konečné koncentrace každého primeru a sondy byly 300 a 375 nM pro Ellagibacter a 200 a 500 nM pro Enterocloster. Pro amplifikaci DNA Ellagibacter a byl proveden konvenční protokol qPCREnterocloster, resp. Náběhový profil pro Ellagibacteramplifikaci byl 1 cyklus při 95 stupních po dobu 5 minut, následovalo 45 cyklů 95 stupňů po dobu 15 s, 50 stupňů po dobu 40 s a 72 stupňů po dobu 31 s. Nakonec byl přidán 1 cyklus při 72 stupních po dobu 5 minut . Profil rampingu pro amplifikaci Enterocloster byl 1 cyklus při 95 stupních po dobu 5 minut, následovalo 40 cyklů 95 stupňů po 15 s, 65 stupňů po 40 s a 72 stupňů po 31 s. Nakonec byl přidán 1 cyklus při 72 stupních po dobu 5 minut.

Extrakce fekální DNA a střevní mikrobiální analýzy

Extrakce DNA ze vzorků stolice byla provedena pomocí soupravy pro purifikaci tkáňové DNA NucleoSpin® (Macherey-Nagel, Německo) podle pokynů výrobce s určitými úpravami. DNA byla kvantifikována fluorimetrií (Qubit3.{2}} – ThermoFisher Scientific™, UK) a čistota byla měřena z poměru absorbance při vlnové délce 260/280 nm (A260/A280) (NanoDrop-ThermoFisher Scientific™, UK ). Složení střevní mikroflóry bylo stanoveno sekvenováním variabilních oblastí V3 a V4 genu 16S rRNA podle protokolů Illumina (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) s délkou čtení 2 × 300 bp běhu s párovým koncem (MiSeqReagent Kit v3 , Illumina Inc.). Metagenomické sekvenování bylo provedeno na platformě MiSeq-Illumina (FISABIO sequencingservice, Španělsko). Zpracování dat, odstranění chimérické sekvence, zarovnání sekvencí a shlukování sekvencí genu 16S rRNA byly provedeny tak, jak je popsáno jinde, aby se získala taxonomická klasifikace.8,27 Amplifikace DNA Gordonibacter byla dosažena v systému ABI 7500 qPCR, jak bylo popsáno dříve.19,28 The Enterocloster- Ellagiba specifické primery a sondy navržené v této studii byly použity podle protokolu qPCR popsaného výše. Pro kvantifikaci byly použity standardní křivky genomové DNA Gordonibacter, Enterocloster a Ellagibacter. Všechny vzorky stolice byly analyzovány trojmo.

Extrakce, detekce a kvantifikace urolitinů ve vzorcích stolice

Vzorky stolice ({{0}},2–0,5 g) byly extrahovány v poměru 1:10 roztokem MeOH/H2O (8{{ 20}}/20), okyselené 0,1% HCl a homogenizované vortexováním po dobu 2 minut a třepáním při 1500 otáčkách za minutu při pokojové teplotě po dobu 10 minut v blokovém ohřívači. Suspenze byla centrifugována při 14 000g při 4 stupních po dobu 10 minut a supernatant byl zfiltrován přes 0,22 um PVDF membránový filtr (Millipore Corp., Bedford, MA) a zředěn 3x MeOH (0,1% kyselina mravenčí ) před injekcí v systému UPLC-ESI-QTOF-MS. Systém UPLC (Agilent 1290Infinity) spojený se čtyřpólovým LC/MS systémem (6550 Accurate-Mass) (6550 Accurate-Mass) spojený se čtyřpólovým systémem doby letu (QTOF) (Agilent Technologies, Waldbronn, Německo) byl použit k analýze fekálních metabolitů pomocí gradientové eluční metody, jak bylo popsáno dříve. 0,29,30 Krátce, separace byla provedena na Poroshell 120 EC-C18 koloně s reverzní fází za použití vody a acetonitrilu, oba okyselené 0,1% kyselinou mravenčí, jako mobilní fáze. Průtok byl 0,4 ml min-1 a vstřikovaný objem byl 5 ul. Pro zpracování dat byl použit software MassHunter Qualitative Analysis (verze B.10, Agilent Technologies, Waldbronn, Německo). Všechny metabolity byly identifikovány přímým srovnáním se standardy a potvrzeny jejich molekulovou hmotností. Kalibrační křivky byly získány pro EA a různé Uros s dobrou linearitou (R2 > 0,99).

Hematologie a klinická chemie

Hematologické proměnné byly stanoveny v heparinizované krvi pomocí automatického hematologického analyzátoru se specifickým softwarem pro vzorky krve krys (AVDIA 120, Siemens, Mnichov, Německo). Analyzovanými proměnnými byly průměrný korpuskulární objem (MCV), průměrný korpuskulární hemoglobin (MCH), průměrná koncentrace korpuskulárního hemoglobinu (MCHC), distribuce erytrocytů (RDW), průměrný objem destiček (MPV), krevní destičkový krit (PCT), šířka distribuce destiček (PDW) , střední složka krevních destiček (MPC), střední hmotnost krevních destiček (MPM), počet krevních destiček (PLT), obsah hemoglobinu v retikulocytech (CHr) a průměrný korpuskulární objem retikulocytů (MCVr). Biochemické proměnné plazmy, vápník (Ca) a fosfor (P) byly analyzovány pomocí chemického a toxikologického analyzátoru Olympus AU400 (Beckman Coulter, Kalifornie, USA). Biochemickými proměnnými byly celkové proteiny (PROT), albumin (ALBU), globulin (GLOB), kreatinin (CREA), glukóza (GLUC), cholesterol (CHOL), triglyceridy (TRIGL), alkalická fosfatáza (ALP), gama-glutamyltranspeptidáza ( GGT), aspartátaminotransferáza (AST) a alaninaminotransferáza (ALT). Nakonec byly analyzovány hladiny tyroxinu (T4) s použitím systému IMMULITE® 1000 immunoassay (Siemens).

Statistická analýza

Data jsou vyjádřena jako průměr ± standardní odchylka (SD). Statistická analýza byla provedena se softwarem SPSS verze 27.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) a rozdíly s p < 0,05 byly považovány za statisticky významné. Normalita dat byla hodnocena Shapiro–Wilkovým testem. Srovnání mezi různými léčebnými skupinami byla provedena pomocí opakované měřené analýzy rozptylu (RM ANOVA) s Tukeyho nebo Dunnettovým T3 post hoc testem v závislosti na tom, zda data sledovala normální nebo nenormální distribuci, v daném pořadí. Rozdíly mezi muži a ženami byly zkoumány pomocí párového Studentova t-testu nebo Wilcoxonova signaturního testu, když byla data normálně nebo nenormálně distribuována, v daném pořadí. K detekci rozdílných bakteriálních znaků mezi skupinami byla použita chí-kvadrátová lineární diskriminační analýza efektů (LEfSe). Pearsonova korelace byla použita k analýze možných asociací mezi proměnnými v datech s normálním rozdělením, zatímco Spearmanova korelace byla použita v datech s normálním rozdělením. Grafy dat byly provedeny pomocí Sigma Plot 14.5 (Systat Software, San Jose, CA, USA).

Přírodní bylinná medicína pro zmírnění zácpy-Cistanche

Cistanche je rod parazitických rostlin, který patří do čeledi Orobanchaceae. Tyto rostliny jsou známé pro své léčivé vlastnosti a po staletí se používají v tradiční čínské medicíně (TCM). Druhy Cistanche se vyskytují převážně v suchých a pouštních oblastech Číny, Mongolska a dalších částí Střední Asie. Rostliny cistanche jsou charakteristické svými masitými, nažloutlými stonky a jsou vysoce ceněny pro své potenciální zdravotní přínosy. V TCM se věří, že Cistanche má tonizující vlastnosti a běžně se používá k výživě ledvin, zvýšení vitality a podpoře sexuálních funkcí. Používá se také k řešení problémů se stárnutím, únavou a celkovou pohodou. Zatímco Cistanche má dlouhou historii používání v tradiční medicíně, vědecký výzkum jeho účinnosti a bezpečnosti stále probíhá a je omezený. Obsahuje však různé bioaktivní sloučeniny, jako jsou fenylethanoidní glykosidy, iridoidy, lignany a polysacharidy, které mohou přispívat k jeho léčivým účinkům.

Wecistanche'scistanche prášek, cistanche tablety, cistanche kapsle,a další produkty jsou vyvíjeny pomocípoušťcistanchejako suroviny, z nichž všechny mají dobrý vliv na zmírnění zácpy. Specifický mechanismus je následující: Předpokládá se, že Cistanche má potenciální přínos pro zmírnění zácpy na základě jeho tradičního použití a určitých sloučenin, které obsahuje. Zatímco vědecký výzkum konkrétně o účinku Cistanche na zácpu je omezený, předpokládá se, že má více mechanismů, které mohou přispět k jeho potenciálu zmírnit zácpu. Laxativní účinek:Cistanchese již dlouho používá v tradiční čínské medicíně jako lék na zácpu. Předpokládá se, že má mírný projímavý účinek, který může pomoci podpořit pohyby střev a vyvolat zácpu. Tento účinek lze přičíst různým sloučeninám nacházejícím se v Cistanche, jako jsou fenylethanoidové glykosidy a polysacharidy. Zvlhčení střev: Na základě tradičního použití se má za to, že Cistanche má zvlhčující vlastnosti, konkrétně zaměřené na střeva. Podpora hydratace a lubrikace střev může pomoci změkčit nástroje a usnadnit průchod, a tím zmírnit zácpu. Protizánětlivý účinek: Zácpa může být někdy spojena se zánětem v trávicím traktu. Cistanche obsahuje určité sloučeniny, včetně fenylethanoidních glykosidů a lignanů, o kterých se předpokládá, že mají protizánětlivé vlastnosti. Snížením zánětu ve střevech může pomoci zlepšit pravidelnost stolice a zmírnit zácpu.