Zobrazování ledvin: Od světla k mikroskopii s vysokým rozlišením
Mar 17, 2022
Kontakt: ali.ma@wecistanche.com
Maria Lucia Angelottiová1,2, Giulia Antonelli1,2 Karolína Conteová1,2a Paola Romagnani1,2
ABSTRAKTNÍ
Důležité úspěchy vledvinafyziologické a patofyziologické mechanismy lze z velké části připsat pokroku v technologii mikroskopie. Hodně z toho, co víme o architektuřeledvinaje založen na základních popisech anatomických mikroskopů pomocí světelné mikroskopie a později ultrastrukturální analýzy poskytované elektronovou mikroskopií. Tyto dvě techniky byly použity pro první klasifikační systémy onemocnění ledvin a pro jejich neustálou aktualizaci. V poslední době řada nových zobrazovacích technik přidala analýzu v dalších dimenzích času a prostoru. Konfokální mikroskopie nám umožnila sekvenčně vizualizovat optické řezy podél osy z a dostupnost specifického analytického softwaru poskytla trojrozměrné vykreslení silnějších vzorků tkáně. Multifotonová mikroskopie nám umožnila současně zkoumatledvinafunkce a struktura v reálném čase. Fluorescenční zobrazovací mikroskopie nám umožnila studovat prostorovou distribuci metabolitů. Mikroskopie s vysokým rozlišením zvýšila citlivost a rozlišení až do nanoúrovní. Pomocí kryo-elektronové mikroskopie mohli vědci vizualizovat jednotlivé biomolekuly na atomárních úrovních přímo v tkáních a porozumět jejich interakci na subcelulárních úrovních. A konečně, hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí/ionizací pomocí matrice umožnila měření stovek různých molekul současně na řezech tkání ve vysokém rozlišení. Tato recenze poskytuje přehled dostupnýchledvinazobrazovací strategie se zaměřením na možný dopad nejnovějších technologických vylepšení.
klíčová slova:imunohistochemie,ledvinabiopsie, podocyty,proximálnítrubička, kmenové buňky
Cistanche herba na onemocnění ledvin, klikněte sem a získejte vzorek
ÚVOD
TheledvinyPro splnění různých fyziologických funkcí je zapotřebí fascinující strukturní složitost. Na začátku, studiumledvinabyl omezen na makroskopická pozorování a jejich přínos k diagnostice onemocnění ledvin byl nepopiratelně omezený. Klinické projevy byly popsány, ale základní patogenetické mechanismy nebyly známy. Úspěchy v pochopení fyziologie a patofyziologie ledvin lze z velké části připsat neustálému pokroku v oblasti mikroskopie. Pokusy oledvinazobrazování začalo již dávno [1]. V roce 1666 zkoumal anatom Malpighiledvinatkáň pomocí světelného mikroskopu, který měl sílu odhadovanou na 25–30 a poprvé popsal glomerulus jako „žlázu, ve které se oddělovala moč od krve“[2]. Tento příspěvek byl ignorován až do roku 1842, kdy byly struktury nefronů odhaleny pomocí 10krát výkonnějšího světelného mikroskopu Sira Williama Bowmana. Bowman objevil periglomerulární pouzdro (později pojmenované Bowmanovo pouzdro) jako anatomicky spojené s první částí tubulu [3]. V roce 1862 Jacob Henle popsal segment tubulu ve tvaru smyčky, který přijal jeho jméno, spojující kortikální tubul a ledvinovou papilu.
Díky zavedení světelné mikroskopie, histomorfologické klasifikaciledvinanemocíbylo možné [1]. Možnost pozorovat, co se děje v nemocných ledvinách, umožnila pochopit, že patologické změny se u pacientů s podobnými klinickými projevy značně liší. První studie patologických změn v renální tkáni však byly provedeny na pitevních vzorcích, vedoucí většinou k popisu chronických onemocnění. Nedostatek informací o vývoji patologických stavů ledvin a technickém problému autolytických jevů souvisejících s používáním posmrtných tkání omezoval znalosti lidských nemocí. V roce 1951 zavedeníledvinabiopsie umožnila přímé pozorování a studium nejen chronických, ale i akutních onemocnění ledvin. Mezitím se mikroskopie postupně stala sofistikovanější s progresivně zvýšenou citlivostí a rozlišením až na úrovně nanometrů. V tomto přehledu poskytneme přehled základních objevů ledvin, které umožnil pokrok v mikroskopické technologii, se zaměřením na možnosti vyvíjející se z nejnovějšího technického vývoje.
VIZUALIZACE IMUNOPATOLOGIE LEDVINY
Imunooznačení a fluorescenční mikroskopie
Možnost získat reprezentativní fragment živé tkáně umožnila použití nových technik, které vyžadovaly maximální zachování tkáně, jako jsou imunohistochemické metody (nejprve fluorescenční, poté enzymatické). Ve skutečnosti v roce 1950 Coons vyvinul metodu značení protilátek fluorescein isokyanátem, tedy imunofluorescenci, aniž by zničil schopnost specificky reagovat s jejich tkáňovými antigeny. Od té doby byla imunofluorescence začleněna do diagnostického postupu pro hodnocení zmrazených vzorků renální biopsie. Tyto techniky poprvé umožnily pozorování intrarenálních imunoglobulinů (Ig) a depozit komplementu u pacientů postižených glomerulonefritidou, což přispělo k rozlišení různých patofyziologií, které jsou základem určitých nespecifických tkáňových lézí, například u srpkovité glomerulonefritidy [4]. Kromě toho možnost pozorovat charakteristický vzor barvení a navázání fluoresceinu na protilátky jiné než imunoglobulin G (IgG) vedly k rozpoznání depozit imunoglobulinu A (IgA) u IgA nefropatie, stejně jako depozit komplementu u postinfekční glomerulonefritidy a membranoproliferativní glomerulonefritida [4].
Konfokální mikroskopie
Fluorescenční mikroskopie prošla značným technickým zlepšením se zavedením konfokální mikroskopie na konci 80. let 20. století. Klíčovými prvky v konfokální mikroskopii jsou bodové osvětlení zaostřené a naskenované přes vzorek a proměnná konfokální apertura (pinhole) před detektorem, která umožňuje sběr světla pouze z tenké části kolem ohniskové roviny (nazývané optická sekce). Konfokální mikroskopie umožnila první in vivo studie ledvin v experimentálních modelech a pozorování příjmu a transportu fluorescenčních molekul skrz tubuly v neporušenýchledvinypo mikropunkci. To umožnilo studium tubulární funkce za fyziologických a patologických stavů [5].
The possibility to sequentially image optical sections along the z-axis and the availability of specific analysis software permitted a three-dimensional (3D) rendering of thicker tissue specimens, showing the frequent inconsistency and misrepresentations provided by 2D analyses [6, 7] (Figure 1A and a'). In addition, the introduction of genetically encoded fluorescent proteins in transgenic mice permitted the labeling of specific cells and tracing them directly within tissues without immunostaining (lineage tracing strategy) [6, 7, 8]. However, confocal microscopy still did not resolve details >200 nm, kvůli limitu difrakce viditelného světla, fotobělení a fototoxicitě.
POROZUMĚNÍ GLOMERULÁRNÍ FILTRAČNÍ BARIÉŘE: ELEKTRONOVÁ MIKROSKOPIE
První pokus o překonání limitu rozlišení světelných a fluorescenčních mikroskopů byl v roce 1931, kdy Ernst Ruska a Max Knoll vynalezli elektronový mikroskop (EM), který jako zdroj excitace místo paprsku světla používá svazek urychlených elektronů. a má vyšší rozlišovací schopnost než světelné mikroskopy (až 0,2 nm). Za tuto inovaci byla v roce 1986 Ernstu Ruska udělena Nobelova cena za fyziku. Díky zvýšené rozlišovací schopnosti se brzy ukázalo, že glomerulus není pouhý mechanický filtr, ale extrémně složitý orgán složený ze tří vrstev: endoteliálních buněk, glomerulární bazální membrány (GBM) a podocytů [9]. Transmission EM (TEM) umožnila vizualizaci glomerulárních buněk zevnitř [10] a odhalila, že endoteliální buňky měly tenká fenestrovaná buněčná těla, zatímco podocyty měly velká buněčná těla a rozšiřující se primární a sekundární procesy „nohy“ ukotvené v GBM a propojené prostřednictvím lineární spoje (mírná diafragma) (obrázek 1B). Kromě toho skenování EM (SEM), zachycující zpětně rozptýlené elektrony, umožnilo vizualizaci glomerulárních buněk z jejich vnějšího povrchu [10] a odhalilo, že výběžky nohou sousedních podocytů se prolínají a pokrývají GBM (obrázek 1C). EM zůstala silným nástrojem nejen pro pochopení normální glomerulární ultrastruktury, ale také pro porozuměníledvinafyziologie a patofyziologie [11]. Četné studie provedené na lidských vzorcích nebo na experimentálních modelech odhalily, že různé chorobné procesy jsou spojeny se souborem charakteristických vzorců ultrastrukturálních změn, což znamená další aktualizace vyvíjejícího se klasifikačního systému.ledvinanemocí. Technická schopnost vizualizovat další složitost ultrastruktury ledvin podpořila specializaci „nefro“patologů.
Nedávná technika SEM založená na vysoce citlivém detektoru umožnila studium nejhlubší části štěrbinové diafragmy a odhalila, že se vyznačovala póry s různou velikostí [12]. U potkanů byl nástup proteinurie spojen s velkými póry, což zvyšuje možnost, že ultrastrukturální změny štěrbinové bránice mohou být příčinou změn v glomerulární permselektivitě [12]. Jako další technický pokrok umožnil blokový SEM přechod z 2D do 3D pohledu na glomerulární filtrační bariéru s rozlišením dostatečným pro sledování nanostruktury nejtenčích buněčných procesů u zdravých myší, nemocných myší a běhemledvinavývoj [13, 14].
Nakonec spojení EM s rentgenovým mikroanalytickým systémem (rentgenová mikroskopie) umožnilo elementární analýzu buněk nebo částí buněk na ultrastrukturální úrovni. Rentgenová mikroskopie využívá skenovací TEM s úzkým elektronovým paprskem k excitaci vzorku. Dopad vysokoenergetických elektronů z paprsku na atomy ve vzorcích vytváří energii ve formě rentgenových fotonů. Tento rentgenový signál shromážděný energeticky disperzním polovodičovým detektorem se používá k identifikaci prvků přítomných ve vzorku s rozlišením v nejlepším případě 30 nm. VledvinaRentgenovou mikroanalýzu úspěšně použili Beck a Thurau ke studiu transepiteliálního tubulového iontového transportu [15] a intracelulární elementární koncentrace v tubulárních buňkách [16].
VIZUALIZACE RENTÁLNÍ FYZIOLOGIE POMOCÍ MULTIFOTONOVÉ MIKROSKOPIE
Multifotonová mikroskopie (MPM) poskytla další pokrokledvinavýzkum, tedy možnost současně zkoumat vztahy renálních funkcí a struktur v reálném čase [17]. Na rozdíl od konvenčních světelných mikroskopů závisí dvoufotonová excitace na současné absorpci dvou fotonů s dvojnásobnou excitační vlnovou délkou, která je nezbytná k excitaci fluoroforu při klasické jednofotonové excitaci (obrázek 1D). Použití komerčně dostupných pulzních infračervených nízkoenergetických excitačních laserů zvýšilo pronikání hluboko do tkáně a minimalizovalo fototoxicitu (obrázek 1D). To umožnilo vědcům vizualizovat dynamické buněčné procesy přímo u živých zvířat, což je funkce, kterou dříve nebylo možné dosáhnout žádnou jinou technikou. MPM umožňuje kvantifikaci základních renálních funkcí a patologických změn, jako je glomerulární permeabilita, vaskulární průtok krve, rychlost glomerulární filtrace jednoho nefronu a tubulární průtok [17] (obrázek 1E a F). Kromě toho MPM umožňuje studium intracelulárních procesů v reakci na poranění, včetně buněčné smrti a vylučování, rolování leukocytů a náboru a narušení GBM [17]. Další technická vylepšení umožnila prodloužené intravitální zobrazování v průběhu dnů až týdnů [18], které bylo v kombinaci s transgenními myšmi exprimujícími fluorescenční proteiny použito ke sledování osudu jednotlivých buněk přímo in vivo ve zdravých a poraněných ledvinách [19] a lépe porozumět mechanismům obměny a regenerace ledvinových buněk.
S MPM byly také možné zobrazovací techniky bez označení, využívající přirozenou autofluorescenci hydrátu nikotinamidadenindinukleotidu (NADH) ke studiu redoxního stavu tubulárních buněk po poranění [20]. Kromě toho byla ke kvantifikaci ukládání kolagenu, markeru renální fibrózy, použita druhá harmonická generace z fibrilárního kolagenu [21]. Druhá harmonická generace je nelineární optický proces, při kterém dva excitační fotony se stejnou vlnovou délkou interagují s necentrosymetrickými strukturami v biologických tkáních, jako je kolagen nebo mikrotubuly, a generují nový foton s poloviční vlnovou délkou.
Nedávnou inovací intravitální mikroskopie bylo zavedení miniaturizovaného multifotonového endoskopu úspěšně používaného k zobrazení ledvin u živých myší v anestezii [22]. Tento minimálně invazivní MPM může připravit cestu pro diagnostiku in vivo v reálném čase, bez odstranění tkáně a ve velmi krátké době.
LEDVINY VE 3D: TECHNIKY ČIŠTĚNÍ TKÁNĚ A EXPANZNÍ MIKROSKOPIE
Navzdory technologickým vylepšením je jedním ze zásadních limitů pro hlubší volumetrické zobrazování zákal ledvinové tkáně, který způsobujeledvinajeden z opticky nejnáročnějších orgánů. To je důvod, proč techniky čištění tkání vyvolaly velký zájem [23]. Cílem těchto přístupů je převést neprůhlednou tkáň na průhlednou, zachovávající proteiny a případně fluorescenční markery, pro zobrazení silných řezů tkáně. Kombinace optického projasnění s nejmodernější mikroskopií poskytuje možnost morfometrické analýzy, jako je kvantifikace objemu a počtu glomerulů, v tlustých tkáních nebo dokonce v intaktní ledvině [24]. Další aplikace zahrnují analýzu jednotlivých segmentů tubulů [25], jejich funkce [26] a kvantifikaci ztráty podocytů [27].
Pro zobrazení velkých objemů tkáně a zároveň řešení jemných strukturních detailů byl nedávno představen nový technický přístup, a to expanzní mikroskopie (ExM). Cílem je fyzicky rozšířit celý orgán 4- do 5-složení při zachování celkové architektury a obsahu 3D proteomu. Pomocí expandujícího polymeru, přímo syntetizovaného ve vzorku, jsou molekuly blíže než je difrakční limit světla izotropně odděleny v prostoru na větší vzdálenosti, a proto mohou být opticky rozlišeny i běžným fluorescenčním mikroskopem. Kromě toho ExM poskytuje větší optickou průhlednost a snižuje rozptyl světla, což umožňuje vizualizovat větší objem tkáně. Pomocí tohoto přístupu lze lokalizaci více proteinů ve štěrbinové diafragmě a GBM pitvat i běžným konfokálním mikroskopem [28]. Může například odhalit vymazání procesu chodidla u proteinurických myší, a to jak ve 2D, tak ve 3D, s rozlišením nanometrů, jaké nebylo dosud dosaženo [29]. Nedávno byl ExM použit pro klinické histopatologické hodnocení vzorků zalitých v parafínu, které již byly obarveny hematoxylinem a eosinem [30]. Tato technika může vizualizovat proces mazání nohou na úrovni nanoměřítek, což bylo dříve možné pouze s EM. Pokroky v volumetrickém zobrazování umožňují 3D analýzu celého orgánu s vysokým rozlišením tak, že hlavní omezení hloubkového zobrazování nyní představuje schopnost protilátek pronikat do tkáně.
STUDIUM METABOLICKÉHO PROFILU: FREKVENČNÍ DOMÉNA FLUORESCENČNÍ ZOBRAZOVACÍ MIKROSKOPIE
Theledvinaje metabolický orgán s vysokým obsahem mitochondrií. Redukovaná forma NADH a další metabolity jsou přirozeně fluorescenční a tato autofluorescence může být použita jako index redoxního stavu [20]. Emisní spektra těchto endogenních fluoroforů se však překrývají a jejich oddělená identifikace byla nemožná. Bylo však zjištěno, že životnost fluorescence (tj. časový pokles fluorescence) je významně odlišná. Fluorescenční zobrazovací mikroskopie (FLIM) tedy umožňuje studium metabolických profilů [31]. V poslední době se pomocí kombinace MPM a FLIM stalo možné charakterizovat buněčně specifické metabolické podpisy a sledovat metabolické změny in vivo běhemledvinanemoc [32]. Očekává se, že FLIM poskytne další informaceledvinametabolismus in vivo ve zdraví a nemoci.
PUSHING ROZLIŠENÍ ZA LIMITY: ZOBRAZENÍ LEDVINY V SUPER ROZLIŠENÍ
Standardní světelná mikroskopie čelí limitu optického rozlišení nad 200 nm. Nové technologie, označované jako zobrazování s vysokým rozlišením, nyní umožňují fluorescenční mikroskopii zobrazovat za její difrakční mez jako výchozí bod éry nanoskopie [33]. Tyto přístupy kombinují nanoskopické rozlišení s výhodami vícebarevného fluorescenčního značení. Jako uznání potenciálního dopadu těchto inovací byla Nobelova cena za chemii za rok 2014 udělena Ericu Betzigovi, Stefanu Hellovi a Williamu Moernerovi „za vývoj super-rozlišené fluorescenční mikroskopie. Různé strategie zobrazování s vysokým rozlišením lze použít k řešení různých biologických otázek. Tyto přístupy lze seskupit do dvou hlavních kategorií v závislosti na tom, zda je super-rozlišení využíváno na úrovni jednotlivých molekul nebo v souborech [33].
Techniky založené na souboru
Techniky založené na souborech porušují limit difrakce časovou a prostorovou modulací excitačního světelného paprsku. Mezi nimi zobrazování s úbytkem emise stimulované vysokým rozlišením (STED) využívá dva lasery, excitační laser a superponovaný červeně posunutý úbytkový laser (laser STED), ve tvaru prstence, k potlačení fluorescenční emise z fluoroforů umístěných mimo. střed buzení. Tohoto potlačení je dosaženo prostřednictvím stimulované emise a umožňuje shromažďovat pouze signál pocházející z ohniska s rozměrem pod difrakčním limitem (obrázek 2A). K zobrazení štěrbinové clony v opticky čistém stavu bylo použito zobrazení STEDledvinatkání (obrázek 2B–c') a umožnila lokalizaci prostorové distribuce podocinu a nefrinu v nanometrovém měřítku až do hloubky alespoň 30 lm [34]. Navíc možnost pozorovat a kvantifikovat vymazání procesu chodidla v experimentálním modelu může učinit zobrazení STED užitečným pro studie glomerulární filtrační bariéry [34].
Mikroskopie STED vyžaduje specifické protokoly pro přípravu vzorků, speciální fluorofory a technické školení. Z tohoto důvodu byla v posledních několika letech věnována větší pozornost jiné technice s vysokým rozlišením, strukturované iluminační mikroskopii (SIM), která může rozšířit difrakční limit o faktor dva jak laterálně, tak axiálně. SIM používá širokoúhlé nastavení mikroskopu s jemným pruhovaným vzorem osvětlení, který umožňuje zachycení vysokofrekvenčních informací (odpovídajících jemným detailům ve vzorku) při nižších prostorových frekvencích. Pořízením více snímků se vzory osvětlení různých fází a orientací lze rekonstruovat snímek s vysokým rozlišením (obrázek 3A). SIM je kompatibilní se standardními fluorofory, nevyžaduje specifickou přípravu vzorku a umožňuje 3D vizualizaci. Vzhledem ke všem těmto výhodám byly provedeny různé studie k vyhodnocení možnosti použití SIM jako rychlého diagnostického nástroje [35], například s potenciálně kratší dobou obratu než EM. Nedávno byly 3D SIM a automatizované zpracování obrazu použity jako rychlý diagnostický nástroj pro odstranění procesu chodidla pomocí rutinních parafínových řezů z biopsií pacientů s onemocněním s minimálními změnami [36] (obrázek 3B a C). Tato schopnost úspěšně identifikovat změny u nemocí, o nichž je známo, že vykazují patologii v nanoměřítku, potvrdila SIM jako slibný nástroj pro rutinní diagnostiku.
Zobrazovací metody založené na lokalizaci jedné molekuly
Tyto techniky spoléhají na možnost cyklicky zapínat a vypínat jednotlivé fluorescenční molekuly, které jsou příliš blízko na to, aby mohly být rozlišeny. V těchto přístupech mohou být molekuly v oblasti omezené difrakcí aktivovány v různých časových bodech, takže mohou být individuálně zobrazeny a následně lokalizovány s nanometrovou přesností pomocí výpočetního nalezení jejich center (obrázek 3D). Mezi těmito přístupy byla poprvé představena stochastická optická rekonstrukční mikroskopie (STORM).ledvinavýzkum v roce 2013 se studií, která odhalila složitou molekulární organizaci GBM s nanometrovou přesností, včetně orientace molekul uvnitř [37]. Na myším modelu vzácného vrozeného nefrotického syndromu STORM odhalil integraci a správnou orientaci lamininu 521 v GBM po intravenózní injekci, čímž otevřel cestu pro pokročilé terapeutické možnosti pro pacienty [38]. Jiná studie popsala organizaci aktinového cytoskeletu v podocytech v rozlišení v molekulárním měřítku [39] (obrázek 3E–I). Novým zjištěním je, že podocyty obsahují kontraktilní aktinové svazky spojené s nekontraktilními aktinovými svazky v chodidlových výběžcích. V modelech poranění podocytů se aktinová struktura v chodidlech rozebrala, což vedlo ke kolapsu kontraktilní struktury v hlavním těle [39].
VIZUALIZACE 3D STRUKTURY ZÁKLADNÍCH BIOMOLEKUL NA ATOMOVÉ ÚROVNI: KRYO-ELEKTRONOVÁ MIKROSKOPIE
Až donedávna byla možnost studia struktury základních biomolekul omezena na elektronovou mikroskopii s rozlišením několika nanometrů. Technické překážky, jako je poškození vzorku intenzivním elektronovým paprskem, nízký kontrast obrazu a pohyby molekul po interakci s elektrony nebo potíže se zachováním vody v biologických vzorcích ve vakuu aplikovaném uvnitř EM komory, což znemožňuje rozlišení molekul pod touto velikostí . Chlazení vzorku může snížit odpařování vody a poškození způsobené elektrony [40]. Z této myšlenky bylo v 50. letech minulého století zavedeno kryo-EM. Před několika lety uvedení nového jednoelektronového počítacího detektoru konečně posunulo rozlišení za předchozí meze. V roce 2017 byla Nobelova cena za chemii udělena Jacquesu Dubochetovi, Joachimu Frankovi a Richardu Hendersonovi za „vývoj kryo-elektronové mikroskopie pro stanovení struktury biomolekul v roztoku s vysokým rozlišením“. Tyto pokroky nyní umožňují strukturní stanovení biomolekul v roztoku [41].
vledvinavýzkumu byly struktury základních proteinů určeny na atomární úrovni [42, 43]. Mezi nimi struktura lidského polycystinu-2, jehož mutace jsou zodpovědné za autozomálně dominantní polycystickéledvinaonemocnění [44] a struktura kanonických 6 iontových kanálů přechodného receptorového potenciálu, jejichž mutace způsobují FSGS u lidí [43], byly stanoveny s rozlišením několika angstromů [44].
POROZUMĚNÍ MOLEKULÁRNÍMU ZÁKLADU NEMOC LEDVIN: INTEGRAČNÍ MIKROSKOPIE LEDVIN
V posledních několika letech jsme zaznamenali zvýšený zájem o přístupy bez značení schopné specificky a současně mapovat celé spektrum molekul ve tkáních [45]. Mezi nimi, matricová laserová desorpční/ionizační zobrazovací hmotnostní spektrometrie (MALDI-IMS) umožňuje měření stovek různých molekul současně přímo na tkáňových řezech s vysokým rozlišením. V experimentu MALDI-IMS je tenký tkáňový řez, zmrazený nebo zalitý v parafínu, potažen matricí, která absorbuje laserovou energii a podporuje ionizaci tkáňových analytů. Analýza v hmotnostním spektrometru generuje spektrum pro každou souřadnici x/y. Po měření MALDI lze stejný tkáňový řez obarvit tradičními histochemickými a imunohistochemickými postupy pro integraci molekulárního vzoru s histologickými detaily. Ve výzkumu ledvin se MALDI-IMS používá ke studiu léků, metabolitů, lipidů, peptidů a proteinů v normálních a nemocných tkáních [45].
Jednou z nejčastějších aplikací MALDI-IMS je identifikace molekulárních markerů pro klasifikaci renálního karcinomu [46] a stanovení skutečné hranice mezi rakovinnou a normální tkání na molekulární i histologické úrovni [47]. MALDI-IMS byl také úspěšně použit ke studiu renální toxicity léků k zajištění včasné detekce toxických látekledvinamechanismy poškození zprostředkované farmaceutickými kandidáty [48]. Kromě toho se MALDI-IMS používá ke studiu lipidů a jejich role v renálních patologiích, jako je diabetická nefropatie [49], akutní poškození ledvin [50] a polycystickéledvinaonemocnění [51] a také odhalit endogenní metabolické profily pro hlubší pochopení mechanismů souvisejících s onemocněním [52]. Byla také dokončena identifikace molekulárních profilů pro možné biomarkery, které by mohly být novými potenciálními diagnostickými a prognostickými biomarkery [53, 54].
ZÁVĚRY A BUDOUCÍ PERSPEKTIVY
Neustálé zlepšování zobrazovacích technik postupně vyřešilo mnoho kritických technických překážekledvinavýzkum a umožnily dynamické zobrazení struktury a funkce normálních a nemocných ledvin. Příchod nových mikroskopických technologií skutečně umožnil zásadní vědecké objevy a následně změnil náš pohled na fyziologii a patofyziologii ledvin, které lze nyní vizualizovat ve 3D a dokonce natáčet na videa, kde čas představuje čtvrtou dimenzi. Díky nedávné technologické inovaci mikroskopie s vysokým rozlišením a pokroku v molekulárních zobrazovacích technikách mohou nyní vědci vizualizovat jednotlivé biomolekuly přímo v tkáních a určit, jak interagují na buněčné a subcelulární úrovni.
Možnost aplikovat tyto nástroje na patologickéledvinavzorky, zaměřené na molekulární a subcelulární detaily v klinických biopsiích, by měly pomoci s reklasifikací onemocnění. Jestli a kdy to bude mít dopad na diagnostiku onemocnění ledvin nebo dokonce na management pacienta, není v současné době jasné.
FINANCOVÁNÍ
Financování poskytla Evropská rada pro výzkum v rámci programu Evropské unie pro výzkum a inovace Horizont 2020 (smlouva o grantu 648274).
REFERENCE
1. Weening JJ, Jennette JC. Historické mezníky v renální patologii. Vircows Arch 2012; 461: 3–11
2. Malpighi M. De Viscerum Structura exercitatio anatomica. Bologna1666
3. Bowman W. O stavbě a využití malpighických tělledvinas pozorováním cirkulace touto žlázou. Philos Trans R Soc A 1842;132:57–80
4. D'Agati VD, Mengel M. Vzestup renální patologie v nefrologii: struktura osvětluje funkci. jsem JledvinyDis 2013; 61: 1016–1025
5. Ohno Y, Birn H, Christensen EI. In vivo konfokální laserová skenovací mikroskopie a mikropunkce u intaktních krys. Nephron Exp Nephrol 2005; 99: e17–e25
6. Romoli S, Angelotti ML, Antonelli G. Blokáda CXCL12 přednostně regeneruje ztracené podocyty v kortikálních nefronech zacílením na vnitřní mechanismus zpětné vazby podocyt-progenitor.ledvinyInt 2018; 94:1111–1126
7. Lazzeri E, Angelotti ML, Paired A et al. Hypertrofie tubulárních buněk související s endocyklem a proliferace progenitorů obnovují renální funkce po akutnímledvinazranění. Nat Commun 2018; 9: 1344
8. LeHir M, Kriz W. Nové poznatky o strukturálních vzorcích vyskytujících se u glomerulosklerózy. Curr Opin Nephrol Hypertens 2007; 16: 184–191 9. Tisher CC. Funkční anatomieledvina. Hosp Pract 1978; 13
10. Liapis H. Elektronová mikroskopie vledvinavýzkum: vidět znamená věřit. Ultrastruct Pathol 2013; 37: 340–345
11. Silná ML, Evers P. Třetí dimenze v renální diagnostice. Rastrovací elektronová mikroskopie normálních a abnormálních ledvin. S Afr Med J 1979; 55:174–177
12. Gagliardini E, Conti S, Benigni A et al. Zobrazení porézní ultrastruktury glomerulární epiteliální filtrační štěrbiny. J Am Soc Nephrol 2010; 21:2081–2089
13. Lausecker F, Tian X, Inoue K a kol. Vinculin je nutný k udržení integrity glomerulární bariéry.ledvinyInt 2018; 93: 643–655
14. Ichimura K, Kakuta S, Kawasaki Y a kol. Morfologický proces vývoje podocytů odhalený blokovou rastrovací elektronovou mikroskopií. J Cell Sci 2017; 130: 132–142
15. Rick R, Dorge A, Beck FX a kol. Rentgenová mikroanalýza transepiteliálního iontového transportu elektronovou sondou. Ann N YAcad Sci 1986; 483: 245–259
16. Thurau K, Dorge A, Mason J et al. Intracelulární koncentrace elementů v renálních tubulárních buňkách. Analýza elektronovou mikrosondou. Klin Wochenschr 1979;57: 993–999
17. Peti-Peterdi J, Kidokoro K, Riquier-Brison A. Nové in vivo techniky vizualizaceledvinaanatomie a funkce. Kidney Int 2015; 88: 44–51
18. Schuh CD, Haenni D, Craigie E, et al. Dlouhovlnná multifotonová excitace je výhodná pro intravitálníledvinazobrazování.ledvinyInt 2016; 89: 712-719
19. Hackl MJ, Burford JL, Villanueva K a kol. Sledování osudu glomerulárních epiteliálních buněk in vivo pomocí sériového multifotonového zobrazování v nových myších modelech s fluorescenčními značkami linie. Nat Med 2013; 19: 1661–1666
20. Hall AM, Unwin RJ, Parker N a kol. Multifotonové zobrazování odhaluje rozdíly v mitochondriální funkci mezi segmenty nefronů. J Am Soc Nephrol 2009; 20: 1293–1302