Nadměrná exprese CD73 v podocytech: nový marker poškození podocytů u onemocnění lidských ledvin

edmund.chen@wecistanche.com

Abstraktní:Dráha CD73 je důležitým protizánětlivým mechanismem u různých onemocnění. Pozorování na myších modelech naznačovala, že CD73 může mít ochrannou rolipoškození ledvin; nicméně, žádný přímý důkaz jeho role u člověkanemoc ledvinbyl dosud popsán. Zde jsme předpokládali, že poškození podocytů u člověkaonemocnění ledvinmění expresi CD73, což může usnadnit diagnostiku podocytopatií. Hodnotili jsme expresi CD73 a jednoho z jeho funkčně důležitých cílů, CC chemokinového receptoru typu 2 (CCR2), v podocytech zledvinabiopsie 39 pacientů s podocytopatií (včetně fokální segmentální glomerulosklerózy (FSGS), onemocnění s minimální změnou (MCD), membranózní glomerulonefritidy (MGN) a amyloidózy) a kontrolní skupiny. Exprese CD73 podocytů v každé ze skupin onemocnění byla významně zvýšena ve srovnání s kontrolami (p < 0.0{{10}}1–p="">< 0,0001).="" kromě="" toho="" existovala="" výrazná="" negativní="" korelace="" mezi="" expresí="" cd73="" a="" ccr2,="" jak="" potvrdila="" imunohistochemie="" a="" imunofluorescence="" (pearson="" r="−" 0,5068,="" p="0,0031;" pearson="" r="−" 0,4705,="" p="0,0313," v="" tomto="" pořadí),="" což="" naznačuje="" ochrannou="" roli="" cd73="">poranění ledvin.Nakonec identifikujeme CD73 jako nový potenciální diagnostický marker lidských podocytopatií, zejména MCD, který je notoricky známý pro nedostatek patologických znaků rozpoznatelných světelnou mikroskopií a imunohistochemií.

klíčová slova:podocyt; onemocnění s minimální změnou; CD73; CCR2;poškození ledvin;selhání ledvin

Úvod

Evoluční klíčová role adenosintrifosfátu (ATP) jako všudypřítomného intracelulárního zdroje energie byla aktualizována před více než třemi desetiletími s revoluční představou, že členové purinergního systému (ATP, adenosindi- a trifosfát (ADP a AMP, v tomto pořadí)) může také dodávat extracelulární signály ke zprostředkování buněčných interakcí [1, 2].Tento koncept vedl k pochopení, že purinergní systém se podílí na formování imunitních odpovědí prostřednictvím modulace profilu exprese receptoru, sekrece cytokinů, produkce reaktivních forem kyslíku (ROS) a intracelulární štěpení patogenem [3–7] Extracelulární ATP podléhá konverzi/defosforylaci na ADP a AMP prostřednictvím CD39 (ektonukleosidtrifosfátdifosfohydroláza 1) a nakonec je AMP degradován na adenosin pomocí CD73 (ekto{9}}nukleotidáza) [8] CD73 může být přítomen v membránově vázané nebo rozpustné formě. Membránová forma má dimerní strukturu sestávající ze dvou identických 70 kD podjednotek, které se váží na plazmatická membrána prostřednictvím spojení mezi C-terminálním serinem a glykosylfosfatidylinositolem (GPI) [9]. Za zmínku stojí, že substráty CD39 ATP a ADP se zdají být kompetitivními inhibitory CD73 [9–11]. Exprese CD73 tak představuje kritickou cestu k vyladění hladiny adenosinu v extracelulárním prostoru. CD73 není molekula specifická pro buňku nebo orgán; jeho exprese na leukocytech, endotelu, epiteliálních nebo mezenchymálních buňkách různých orgánů (ledvina, plíce, játra, tlusté střevo, mozek a srdce) a kmenové buňky byly dobře zdokumentovány [12 – 14]. Ochrannou roli adenosinu cestou syntézy oxidu dusnatého (NO) při poškození jaterní ischemií poprvé popsali Peralta et al. [15]. V souladu s těmito údaji bylo prokázáno, že jeho účinek zmírňuje akutní poškození plic, rejekci aloštěpu dýchacích cest, akutní reakci štěpu proti hostiteli a sepsi [4,16–19].

CISTANCHE ZLEPŠÍ SELHÁNÍ LEDVIN/RENÁL

Jak bylo přesvědčivě prokázáno na několika myších modelech, CD73 se může účastnit tubulo-glomerulární interakce vledvina. Bylo prokázáno, že CD73-zprostředkovaná tvorba adenosinu odvozeného z CD73 z ATP tubulárního původu během ischemicko-reperfuzního poškození zmírňuje zánět prostřednictvím inhibice efektorové funkce neutrofilů [20]. Navíc CD73-deficientní myši vykazují autoimunitní zánět, který je doprovázen sníženým počtem podocytů a endoteliálních fenestrací [21]. Tento jev byl spojen se zvýšenými hladinami prozánětlivých cytokinů v séru, jako je tumor nekrotizující faktor (TNF)-alfa nebo chemokinový CXC motivový ligand 2 (CXCL-2). V prostředí člověkanemoc ledvin,bylo postulováno, že poškození podocytů pravděpodobně představuje směs adaptivních a destruktivních mechanismů buněčné odpovědi na patologické podněty, což nemusí nutně odrážet publikovaná pozorování z in vitro nebo zvířecích modelů. Etiologie poškození podocytů se liší od mechanického stresu (glomerulární hyperfiltrace), oxidačního stresu (jako u hypertenzní nebo diabetické nefropatie, toxického poškození, infiltrace zánětlivých buněk nebo zvířecích modelů onemocnění s minimální změnou) až po imunologický stres (tj. poškození zprostředkované imunitním komplexem a komplementem během glomerulonefritidy) [22]. Zánětlivé nastavení glomerulonefritidy může stimulovat podocyty k syntéze různých cytokinů, potenciálně prostřednictvím signalizace zprostředkované CC chemokinovým receptorem 2 (CCR2). Stále je málo známo o úloze CD73 u člověkanemoc ledvin, zejména při chronickém zánětu a poranění podocytů.

V této studii jsme předpokládali, že CD73 hraje roli v patogenezi lidských glomerulárních onemocnění a analyzovali jsme expresi CD73 v podocytech u lidí.ledvinabiopsie od pacientů s patologiemi souvisejícími s podocytopatií. Ukazujeme, že povrchová exprese CD73 na podocytech je spolehlivým markerem poškození podocytů, což podporuje zejména diagnostickou hodnotu CD73 u onemocnění s minimální změnou (MCD). Kromě toho uvádíme negativní korelaci mezi expresí CCR2 v podocytech a expresí CD73, což naznačuje, že nadměrná exprese CD73 představuje adaptivní odpověď na glomerulární lézi.

Výsledek

Klinická data a ultrastrukturální zobrazení poškození podocytůTabulka 1 uvádí klinickou prezentaci případů zahrnutých do studie týkající se věku, pohlaví, kreatininu a hodnot celkové proteinurie. Všichni pacienti s FSGS měli primární NOS (jinak nespecifikovanou) formu. Z 12 pacientů s MGN bylo 5 pozitivních na receptor fosfolipázy A2 (PLA2R) (42 procent). Ve skupině s amyloidózou měli 2 pacienti AA-amyloidózu (16,7 procenta) a 10 AL-amyloidózu (83,3 procenta); u 2 pacientů s AL-amyloidózou byl lehký řetězec kappa evidentní (20 procent) a 8 bylo pozitivních na lambda (80 procent ze skupiny s AL-amyloidózou). U všech pacientů s MCD, FSGS, MGN a amyloidózou bylo elektronovou mikroskopií jasně zjištěno poškození podocytů (obrázek 1).

Obrázek 1. Ultrastrukturální snímek primárního a sekundárního poškození podocytů. ( a ) Rozprostření těla podocytu na bazální membráně glomerulů (šipka) s retrakcí výběžků nohy v případě MCD. ( b ) Rozsáhlé odstranění procesu podocytů na noze (šipka) a cytoplazmatická vakuolizace (hvězda) u pacienta s primární FSGS. ( c ) Smazání procesu chodidla (šipka), vakuolizace a výrazné organely (dvojitá šipka) s epimembranózním elektron-densním materiálem (hvězda) u primární membranózní glomerulonefritidy. ( d ) Subepiteliální akumulace amyloidních fibril (dvouhlavá šipka) s následným oddělením podocytů (jako známka nevratného poškození podocytů) u pacienta s AL-amyloidózou (lambda). Všechny elektronové mikrofotografie jsou prezentovány při 4000násobném zvětšení. Vložky – odpovídající mikrofotografie ze světelné mikroskopie (40 × /0,65 NA; velikost sloupce stupnice: 50 µm v (a, c, d) a 100 µm v (b); barvení PAS).

Povrchová exprese CD73 je spojena s poškozením podocytů u onemocnění lidských ledvin

Abychom prozkoumali, zda podocyty exprimují CD73 ve fyziologickém prostředí, a abychom vyhodnotili vzorec různých nastavení onemocnění CD73 souvisejících s poškozením podocytů, provedli jsme imunohistochemickou analýzu exprese CD73. Ultrastrukturální analýza potvrdila poškození podocytů jako nepravidelnost cytoskeletu s minimálně vymazaným výběžkem chodidla (obrázek 1). V naší negativní kontrolní skupině bez podocytové léze nebyla detekována žádná významná podocytová exprese CD73 navzdory pozitivitě vnitřní kontroly (peritubulární kapiláry), která se typicky barví pozitivně (obrázek 2). Na druhou stranu skupiny s poškozením podocytů (MCD, FSGS, MGN a amyloidóza) vykazovaly statisticky vysoce významnou upregulaci CD73 podocytů (p < 0.{{1{{20}}}}="" 001);="" významný="" nárůst="" byl="" konzistentní="" i="" při="" srovnání="" jednotlivých="" subjektů="" s="" negativními="" kontrolami="" (p="" alespoň="">< 0,001).="" je="" zajímavé,="" že="" rozsah="" upregulace="" cd73="" měl="" tendenci="" být="" nižší="" ve="" skupině="" mcd,="" i="" když="" významně="" nižší="" pouze="" ve="" srovnání="" se="" vzorky="" mgn="" (p="0,0043)" (obrázek="" 2).="" ve="" skupinách="" s="" poškozením="" podocytů="" nebyla="" žádná="" korelace="" mezi="" semikvantitativním="" skóre="" cd73="" a="" proteinurií="" na="" binární="" (nefrotické/nenefrotické)="" nebo="" kvantitativní="" (g/24="" h)="" úrovni="" (spearman="" r="−" 0,0807,="" p="0" 0,6302="" a="" spearman="" r="−" 0,076,="" p="0,6497," v="" tomto="" pořadí;="" obrázek="" 3a).="" celkově="" nebyla="" žádná="" korelace="" mezi="" skóre="" cd73="" a="" hladinou="" kreatininu="" (spearman="" r="0.0722," p="0.6259;" obrázek="" 3b).="" navíc="" jsme="" nedokázali="" detekovat="" významnou="" korelaci="" mezi="" expresí="" cd73="" a="" hypertenzí="" (spearman="" r="−" 0,03024,="" p="0,8384)" nebo="" diabetes="" mellitus="" (spearman="" r="−" 0,1784,="" p="" {{45="">

Upregulace CD73 odvozeného z podocytů u lidského glomerulárního onemocnění negativně koreluje s expresí receptoru CCR2 a nekoreluje s expresí nefrinu a podocinuS ohledem na publikovaná data o downregulaci exprese makrofágů CCR2 po nadměrné expresi CD73 v modelu kmenových buněk jsme předpokládali, že upregulace CD73 během poškození podocytů nepřímo koreluje s expresí prozánětlivého CCR2 a provedli jsme imunohistochemickou analýzu CCR2. V kontrolní skupině nemohla být detekována žádná nebo pouze mírná exprese CCR2, bez významné nesrovnalosti ve srovnání se signaturou CD73 ve stejných vzorcích. Naproti tomu u většiny vzorků z biopsií poškození podocytů bylo možné pozorovat většinou významnou upregulaci povrchového CCR2 (přesto různé intenzity) a byla obecně upregulována ve srovnání s kontrolní skupinou (p=0.0206; doplňkový obrázek S1). Skupiny onemocnění se v tomto ohledu od sebe významně nelišily.

Dále jsme analyzovali potenciální korelaci mezi intenzitami exprese CD73 a CCR2. Při porovnání skóre CD73 a CCR2 z kohorty biopsie poranění podocytů bylo možné pozorovat výraznou negativní korelaci (Spearman r=− 0.4821, p=0.{18} }052), (obrázek 4). Je třeba poznamenat, že glomeruly s CD73-pozitivními podocyty měly tendenci vykazovat sníženou expresi CCR2 nejen v podocytech, ale také v okolních buňkách, jako jsou parietální epiteliální buňky (obrázek 4). Inverzní korelace byla potvrzena vyhodnocením imunofluorescenčního společného barvení na CD73/CCR2 v poškozených podocytech konfokální mikroskopií (Spearman r=− 0,4478, p=0,0282), (obrázek 5). Abychom se zabývali případnou asociací mezi pozitivitou CD73 a (ztrátou) exprese proteinu specifického pro podocyty, provedli jsme další imunofluo rescenční barvení na nefrin a podocin a hodnotili jsme jejich expresní profil v kontrolních, MCD a FSGS skupinách (obrázek 6a) a také společné barvení. s CD73 ve vzorcích s lézí podocytů (obrázek 6b–e). Nepodařilo se nám detekovat významnou korelaci mezi průměrnou intenzitou fluorescence exprese podocinu nebo nefrinu na jedné straně a průměrnou expresí CD73 na straně druhé (n=39, Spearman r=0.212, p {{33} }.1948 pro podocin a n=60, Spearman r=0.01906, p=0.8851 pro nefrin).

Diskuse

Poprvé zde popisujeme expresi CD73 na povrchu poraněných podocytů u člověkanemoc ledvin. Analýzaledvinovébiopsie od pacientů s výrazným poškozením podocytů, jako u MCD, FSGS, MGN a amyloidózy, uvádíme významnou upregulaci exprese podocytů CD73 v každé z těchto skupin ve srovnání s kontrolouledviny,nezávisle na etiologii poškození podocytů. Kromě toho uvádíme inverzní korelaci mezi expresí CD73 a CCR2 podocyty skupin s poškozením podocytů. Bylo prokázáno, že zesílený podocytově specifický CCR2 zprostředkovává diabetespoškození ledvinu myší [23]. Navíc bylo popsáno, že blokáda CCR2 u myšího modelu FSGS indukovaného Adriamycinem snižuje proteinurii a glomerulární poškození [24]. Nedávná studie od Lee et al. – rovněž s použitím myšího modelu – naznačuje, že deplece CCR2 by mohla zlepšit albuminurii vyvolanou obezitou prostřednictvím blokády oxidačního stresu a akumulace lipidů [25]. V systému in vitro využívajícím mezenchymální kmenové buňky (MSC) z myší perikardiální tkáně se skutečně ukázalo, že CD73-nadměrně exprimující MSC diktují reparační procesy prostřednictvím protizánětlivé aktivity, mimo jiné také v důsledku inhibice CCR73- {9}}pozitivní infiltrace makrofágy [13]. Ve světle našich výsledků a publikovaných údajů je tedy lákavé předpokládat, že exprese CD73 podocyty může působit protektivněporanění ledvinmožná prostřednictvím cest, které zeslabují CCR2. Signalizace CCR2 úzce souvisí s adhezí a aktivací makrofágů [26, 27]. Protože makrofágy mohou ovlivňovat patogenezi související s podocytopatiíonemocnění ledvin(jako primární MGN, kde byla infiltrace CD68 plus, CCR2 plus makrofágy rozpoznána jako významný indikátor konečného stádiaselhání ledvin[28]), další studie asociace mezi obsahem monocytů/makrofágů, původem (infiltrující vs. rezidentní), aktivačními profily (M1 – prozánětlivý vs. M2 – alternativně aktivovaný) a expresí CD73 u člověkanemoc ledvinjsou nezbytné pro kontrolu souladu našich výsledků s předchozími údaji z myších modelů.

V zánětlivém mikromilie, které lze pozorovat při hypoxii, ischemii-reperfuzi nebo autoimunitním poškození tkáně, uvolňuje více buněk členy purinergního signalizačního systému, převážně ve formě prozánětlivých ATP nebo ADP [29, 30]. V těchto podmínkách jsou ektonukleotidáza CD73 a její produkt adenosin důležitými faktory regulace imunitní odpovědi a umlčování. Na zvířecích modelech se ukázalo, že CD73 má ochranný účinekledvinaischemické reperfuzní poškození a jeho nedostatkem indukovaná dysfunkce podocytů, vedoucí k autoimunitnímu zánětu anemoc ledvin[21, 31]. Jiné experimenty na myších in vivo využívající ischemické reperfuzní poškození odhalily důležitý protizánětlivý vliv CD73 exprimovaného buňkami proximálního tubulárního epitelu a jeho rozhodující účinek vledvinaochrana během diabetické nefropatie prostřednictvím signalizace adenosin-endoteliálního receptoru Adora2b [20,32]. Podocytopatie jsou nejčastější skupinou glomerulárních lézí vedoucích k proteinurii. MCD, prototyp „primární“ podocytopatie, je nejčastější příčinou nefrotické proteinurie u dětí ve věku > 1 rok [33, 34]. Současné hypotézy o patogenezi MCD naznačují významnou roli cytokinů a dalších imunitních mediátorů při narušení integrity podocyto-glomerulární bazální membrány [35–38]. Rozpor mezi absencí viditelných změn ve světelné mikroskopii a závažnou proteinurií je charakteristickým znakem MCD; ultrastrukturální důkaz poškození podocytů elektronovou mikroskopií je tedy podmínkou sine qua non pro dosavadní diagnózu MCD. Tento diagnostický algoritmus v tomto ohledu zdůrazňuje význam dalších diagnostických nástrojů první linie. Vyšetření exprese CD73, zejména v podmínkách omezené dostupnosti elektronové mikroskopie, by tak mohlo pomoci odlišit glomerulární (tj. podocytopatické) a extraglomerulární (např. tubulární nebo paraproteinemické) zdroje proteinurie. Srovnání imunohistochemie a imunofluorescence v naší studii by hovořilo ve prospěch druhé jmenované.

CISTANCHE ZLEPŠÍ ONEMOCNĚNÍ LEDVIN/RENÁL

Několik publikací přesvědčivě dokumentovalo aberantní distribuci a ztrátu proteinů specifických pro podocyty v různýchnemoc ledvinnastavení, která zahrnují poškození podocytů a proteinurii, jak bylo nedávno přezkoumáno [39]. V naší studii jsme ve skupině s poškozením podocytů nedokázali detekovat významnou korelaci mezi intenzitou fluorescence podocin/nefrin a intenzitou exprese CD73. Specifická omezení však vylučují patofyziologickou interpretaci statistických dat podocin/nefrin vs. CD73. Nejprve jsme pro hodnocení intenzity fluorescence vybrali podocyty pomocí technických zvětšovacích a rozlišovacích kapacit konfokální mikroskopie. Ačkoli tyto podmínky snadno umožňují detekci tělísek podocytů, hlavní procesy a zejména výběžky nohou zůstávají nezřetelné, a proto pravděpodobně nejsou označeny/analyzovány. Zadruhé, korelace mezi expresí CD73 a proteiny specifickými pro podocyty v celých glomerulech nemůže být ospravedlněna: ačkoli hodnocení podocinu a nefrinu na této úrovni by bylo legitimní (protože je rozumné předpokládat, že žádné jiné glomerulární buňky neexprimují tyto proteiny), nelze to nárokovaný pro CD73, který je částečně exprimován alespoň endoteliálními buňkami. Za třetí, hodnocení samotné průměrné intenzity fluorescence jako nezávislého markeru poškození podocytů je sporné, protože nepokrývá patologický, granulární distribuční vzorec podocinu a nefrinu v glomerulu, který jsme mohli jasně pozorovat na obrázku 6. Proto se zdráháme připsat absenci korelace CD73-podocinu a CD73-nefrinu v naší analýze odlišným molekulárním drahám těchto markerů. K prozkoumání případné interference mezi těmito signálními kaskádami jsou nutné další studie na podocytech in vitro a na zvířatech.

Celkově vzato, když uznáváme malou velikost vzorku jako hlavní omezení naší studie, demonstrujeme zde konzistentní nadměrnou expresi CD73 poškozenými podocyty a navrhujeme CD73 jako nový diagnostický marker podocytopatie. U onemocnění s minimální změnou mohou naše výsledky pomoci identifikovat poškozené podocyty a vést k méně časově a finančně náročnému diagnostickému procesu. Naše výsledky jsou navíc v souladu s publikovanými údaji z experimentálních přístupů na myších a naznačují ochrannou interakci mezi CD73 a CCR2 u lidí.nemoc ledvin. K řešení mechanismů signalizace CD73 u člověka jsou nutné další multicentrické studie s většími kohortami pacientůledvinaonemocnění a jeho prognostický význam. Podobně by bylo zapotřebí většího počtu kohort pro stanovení potenciální korelace mezi závažností onemocnění a expresí CD73.

Materiály a metody

Studijní kohortaCelkem 49 biopsií zahrnutých do této studie od 49 různých pacientů bylo diagnostikováno mezi 1. lednem 2018 a 31. prosincem 2019 ve Fakultní nemocnici Mannheim, University of Heidelberg. Dalšími selekčními kritérii byla reprezentativní biopsie s možností provedení trojité diagnostiky s imunohistochemií a EM, adekvátní klinické informace, jasná diagnóza a dostatek materiálu pro tuto studii. Všichni pacienti byli dospělí a běloši. Výzkum zahrnoval 39 biopsií od pacientů s poškozením podocytů různé etiologie (7 biopsií od pacientů s primární fokální segmentální glomerulosklerózou – FSGS; 8 od pacientů s minimální změnou – MCD; 12 od pacientů s membranózní glomerulonefritidou – MGN; 12 od pacientů s amyloidózou). Negativní kontroly bylyledvinabiopsie od 10 pacientů bez léze podocytů a bez proteinurie (6 pacientů s mírnou nefrosklerózou, 2 pacienti s intersticiální nefritidou a 2 pacienti bez patologických změn). Všechny výše uvedené biopsie byly zahrnuty do analýzy exprese CD73 podocytů; pro CCR2, po vyloučení parafinových řezů s nedostatečným počtem nesklerotických glomerulů (<5), we="" performed="" analysis="" of="" surface="" expression="" and="" of="" correlation="" with="" cd73="" signature="" in="" 6="" samples="" from="" fsgs,="" 8="" from="" mcd,="" 10="" from="" mgn="" and="" 8="" from="" the="" amyloidosis="" group.="" in="" the="" ccr2="" analysis,="" the="" control="" group="" consisted="" of="" 6="" biopsies.="" relevant="" clinical="" data="" were="" collected="" from="" electronic="" medical="" records="" (table="" 1).="" informed="" consent="" was="" waived="" because="" of="" the="" retrospective="" nature="" of="" the="" study,="" because="" of="" the="" fact="" that="" anonymous="" clinical="" data="" were="" used="" for="" analysis="" and="" because="" the="" study="" was="" performed="" on="" already="" existing="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" after="" completing="" the="" diagnostic="" process,="" as="" approved="" by="" the="" ethic="" committee="" of="" the="" university="" medical="" centre="" mannheim,="" university="" of="" heidelberg="" (reference="" number:="">

Histologie, imunohistochemie, imunofluorescence a elektronová mikroskopie1 um sériové řezy byly provedeny na zalitém parafínuledvinabiopsie a barveny hematoxylinem/eosinem (H/E), kyselinou jodovou-Schiff (PAS), barvením Massonovým trichromem a také standardní rutinní imunohistochemií pro diagnostické účely. Imunohistochemické a imunofluorescenční barvení formalínem fixovaných biopsií zalitých v parafínu pro bylo prováděno ručně s použitím králičí anti-lidské CD73 monoklonální protilátky (klon D7F9A, Cell Signaling, Frankfurt nad Mohanem, Německo) a myší monoklonální anti-lidské CCR2 protilátky (klon 7A7; Abcam, Cambridge, UK), králičí polyklonální anti-lidská protilátka proti nefrinu (Abcam, Cambridge, UK) a králičí anti-lidská podocin protilátka (Sigma, Saint Louis, MO, USA), podle protokolů výrobce. Všechny biopsie byly zahrnuty do analýzy exprese CD73 podocytů pomocí imunohistochemie; pro CCR2 parafinové řezy s nedostatečným počtem nesklerotických glomerulů (<5) were="" excluded.="" to="" minimize="" the="" noise,="" antibody="" optimization="" for="" immunohistochemistry="" was="" performed="" using="" control="" (tonsil)="" tissue.="" the="" tissue="" sections="" were="" stained="" with="" dako="" real="" detection="" system="" alkaline="" phosphatase/red="" rabbit/mouse="" kit="" (agilent,="" santa="" clara,="" ca,="" usa)="" and="" avidin/biotin="" blocking="" kit="" (vector="" laboratories,="" burlingame,="" ca,="" usa).="" antigen="" retrieval="" was="" performed="" for="" 20="" min="" using="" dako="" target="" retrieval="" solution="" (equivalent="" citrate="" buffer,="" ph="" 6.0).="" primary="" antibodies="" were="" incubated="" for="" 60="" min="" in="" dako="" antibody="" diluent="" with="" 2%="" dry="" milk="" at="" 37="" ◦="" c="" and="" detected="" using="" the="" dako="" real="" link,="" biotinylated="" secondary="" antibodies="" (included="" in="" the="" kit),="" and="" dako="" real="" streptavidin="" alkaline="" phosphatase="" (ap).="" the="" reaction="" was="" visualized="" by="" a="" red="" chromogen="" (included="" in="" the="" kit).="" the="" slides="" were="" counterstained="" with="" hematoxylin,="" dehydrated,="" mounted="" using="" aquatex="" (merck,="" darmstadt,="" germany)="" and="" cover-slipped.="" for="" immunofluorescence,="" ccr2/cd73="" co-expression="" was="" evaluated="" in="" total="" of="" 22="" podocytes="" from="" all="" podocyte="" lesion="" groups.="" cd73="" was="" stained="" with="" alexa="" flour="" tm="" 488="" tyramide="" superboost="" tm="" kit,="" streptavidin="" (invitrogen,="" thermo="" fisher,="" waltham,="" ma,="" usa)="" using="" secondary="" biotinylated="" anti-mouse="" antibody="" (biotium,="" fremont,="" ca,="" usa).="" secondary="" antibodies="" for="" the="" immunofluorescence="" were="" donkey="" anti-mouse="" cf="" 594="" and="" donkey="" anti-rabbit="" cf="" 594="" (both="" from="" biotium,="" fremont,="" ca,="" usa).="" for="" electron="" microscopy,="" biopsies="" were="" post-fixed="" with="" 1%="" osmium="" tetroxide="" (roth,="" karlsruhe,="" germany),="" embedded="" in="" agar="" 100="" resin="" (agar="" scientific,="" stansted,="" uk),="" cut="" at90nm="" thickness="" andstained="" with1%="" uranylacetate(serva,="" heidelberg,="" germany).="" micro-graphs="" were="" taken="" on="" transmission="" electron="" microscope="" jem-1400="" (joel,="" freising,="">

CISTANCHE ZLEPŠÍ FUNKCI LEDVIN/RENÁL

Světelná mikroskopie a morfometrické analýzySnímání a analýza byla provedena pomocí skenovacího mikroskopu PreciPoint M8 s objektivem Olympus PlanCN 40 × /0.65 a softwarem MicroPoint (v.5 2016; PreciPoint, Freising , Německo). Semikvantitativní hodnocení povrchové exprese CD73 podocytů v imunohistochemickém barvení bylo hodnoceno pomocí skórovací škály 0–3 (0 – žádná exprese; 1 – fokální segmentální pozitivita (<50% podocytes="" positive="" in=""><50% glomeruli);="" 2—focal="" global="" (="">50 procent podocytů pozitivních<50% glomeruli);="" 3—diffuse="" (any="" percentage="" of="" podocytes="" positive="" in="">50 procent glomerulů). CD73 pozitivní a negativní podocyty byly analyzovány na koexpresi CCR2 pomocí semikvantitativního skórovacího systému založeného na intenzitě (0 – žádná exprese, 1 – slabá exprese, 2 – střední exprese a 3 – silná exprese, podle biopsie – interní pozitivní kontrola CCR2 – endotel a infiltrující imunitní buňky). Hodnocení bylo provedeno nezávisle dvěma patology (SP a ZP) zaslepeným způsobem.

Konfokální mikroskopieSnímky CD73 (Alexa Fluor 488), CCR2 (Alexa Fluor 594) a jader (DAPI) podocytů byly získány postupně motorizovaným konfokálním mikroskopem Olympus FV1000 vybaveným HeNe 594 nm, Argon 488 nm a UV dioda 405 nm laser a fotonásobiče (PMT) řízené softwarem FluoView s použitím objektivu 60 × /1,35 UPlanSApo. 12-Bitové obrázky s 512 × 512 pixely a velikostí pixelů 0,41 µm pro přehledy a 0,10 µm pro vysoké rozlišení byly získány při zachování všech nastavení na mikroskopu konstantní. Snímky byly dále poloautomaticky zpracovány a analyzovány pomocí in-house vyvinutého makra ImageJ (datum přístupu: 15. prosince 2020). Krátce byly snímky segmentovány pro jednotlivé podocyty, byl aplikován práh a změřena střední intenzita, statisticky analyzována a vynesena do grafu. Všechny snímky byly zpracovány s konstantním nastavením a zobrazeny se stejnou pseudobarvou rovnoměrně lineárně upravenou pro jednotlivé kanály na sloučených snímcích

Statistické analýzyStatistické analýzy byly provedeny pomocí GraphPadPrismv. 8.4.3 software (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). Všechna data jsou uvedena jako průměr ± SEM. Statistické rozdíly byly vypočteny pomocí párového nebo nepárového t-testu a také Pearsonovy korelační analýzy, jak je uvedeno.