Jak zabránit a omezit tvorbu ledvinových kamenů?

další informace:ali.ma@wecistanche.com

Část Ⅰ Ⅱ: Fosfatidylserinová everze regulovaná fosfolipidovou skramblázou aktivovanou signalizací TGF‑ 1/Smad v rané fázi tvorby ledvinových kamenů

Xiu Guo Gan1 · Hai Tao Xu1 · Zhi Hao Wang

další informace:ali.ma@wecistanche.com

Úvod

Urolitiáza je jedním z nejčastějších onemocnění postihujících člověka a je spojena s četnými urologickými komplikacemi [1]. Šťavelan vápenatý (CaOx) údajně poškozuje kultivované renální tubulární buňky, po kterých se buněčná membrána fosfatidylserin (PS) překlopí z vnitřní vrstvy do vnější vrstvy in vitro a hraje důležitou roli vledvinový kámenformace [2]. Podobné nálezy byly hlášeny různými studiemi [3-6]prováděnými na buněčné úrovni. Mechanismus externalizace PS v buňkách renálních tubulů způsobený poškozením zprostředkovaným CaOx však zůstává nejasný. Předchozí studie ukázaly, že vysoká koncentrace oxalátu vápenatého vede k nadprodukci reaktivních forem kyslíku (ROS)[7], což následně přispívá k externalizaci PS v buňkách renálních tubulů, což vede k nukleaci a růstu krystalů CaOx [8]. ROS a peroxidace lipidů silně aktivují fosfolipidovou scramblázu (PLSCR)[9], zatímco expozice lapačům ROS, jako je glutathion, koenzym Q10 nebo idebenon (syntetický homolog koenzymu Q10), snižuje aktivaci PLSCR u polycystických ledvin [10]. . PLSCR, který je ukotven k buněčné membráně[11], funguje jako jeden ze tří fosfolipidových překlápěcích enzymů schopných katalyzovat rychlý obousměrný pohyb PS na obou stranách membrány podél koncentračního gradientu [12]. Za fyziologických podmínek je buněčná membrána v asymetrickém stavu a PLSCR nemá na membránu žádný vliv [13]. Po poškození eukaryotických buněk se však aktivuje PLSCR a přesune PS z vnitřní do vnější vrstvy [14,15]. Navíc nadměrná exprese PLSCR v K1 ovariálních buňkách čínského křečka údajně stimuluje externalizaci PS, čímž se zvyšuje vnější pohyb PS na buněčný povrch během apoptózy [16]. Proto jsme předpokládali, že PLSCR se také podílí na externalizaci PS v buněčné membráně renálního tubulu prostřednictvím aktivace ROS.

K potenciálnímu molekulárnímu mechanismu produkce ROS indukované oxaláty dochází prostřednictvím indukce signalizace TGF- 1/Smad, která může hrát roli v produkci ROS [17,18]. Signalizace TGF- 1/Smad se údajně podílí na mnoha onemocněních ledvin, jako je glomerulonefritida, renální intersticiální fibróza a nefrolitiáza[19]. Navíc mononukleární buňky ošetřené TGF- 1 vykazují PSexternalizaci v buněčné membráně tím, že způsobují překlápění PS z vnitřní do vnější vrstvy [20]. Nicméně, pokud je nám známo, vztah mezi TGF- 1/Smad signalizací a PSeverzí v buněčných membránách renálních tubulů zůstává neznámý. Předpokládali jsme, že TGF{10}} se podílí na everzi PS v buněčných membránách renálních tubulů aktivací PLSCR v raném stádiu potkanaledvinový kámenvznik zprostředkovaný ROS.

Zkoumali jsme proto, zda signalizace TGF{0}}/Smad stimuluje externalizaci PS prostřednictvím aktivace ROS a zda TGF aktivuje PLSCR v buněčné membráně renálních tubulů během raného stádialedvinový kámenvývoj in vitro a in vivo, čímž se položil teoretický základ pro etiologiiledvinový kámenformace.

Klikněte na Cistanche DHT pro onemocnění ledvin

Materiály a metody

Krysí model raného stádia tvorby ledvinových kamenů CaOx

Šedesát čistých 3-měsíčních samců krys Wistar o hmotnosti 200±20 g poskytlo Experimental Animal Center of Harbin Medical University a chovali je při pokojové teplotě (22 stupňů ±2 stupně) a 50-70procentní vlhkosti. Po 3 dnech adaptivního chovu byli náhodně rozděleni do tří skupin (20 potkanů/skupina) – kontrolní,ledvinový kámen, aledvinový kámenplus SB431542 (inhibitor signální dráhy TGF- 1/Smad).

Ledvinový kámentvorba je iniciována jako časná patologická změna po poškození renálních tubulárních buněk [21,22]. Ke studiu tohoto procesu zranění, krysí model raného stádialedvinový kámenbyla vytvořena formace, protože standardizovaný přístup dosud nebyl hlášen. K pozorování časných změn po poškození renálních tubulárních buněk jsme použili metodu popsanou Liet al. [23]. Stručně řečeno, potkanům v kontrolní skupině byly podávány 2 ml destilované vody denně orální sondou, zatímco potkanům vledvinový kámenskupině byly podávány 2 ml 1% roztoku ethylenglykolu a 1% roztoku NHCl denně orální sondou. Krysy vledvinový kámenplus SB431542 skupině bylo intraperitoneálně injikováno ko-rozpouštědlo SB431542 (5 mg/kg, S1067; Selleckchem, Shanghai, Čína) každých 7 dní [24]. Jídlo a voda byly poskytovány ad libitum. V den 14 byly krysy usmrceny předávkováním anestetikem (pentobarbital sodný, 200 mg/kg, intraperitoneální injekcí) a byly jim vyříznuty ledviny. Levé ledviny byly okamžitě konzervovány v kapalném dusíku pro následnou detekci proteinu. Pravé ledviny byly fixovány a poté dehydratovány a zality parafínovým voskem. Všechny studie na zvířatech byly provedeny podle příručky National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Experimentální postupy byly schváleny Etickou komisí pro experiment na zvířatech První přidružené nemocnice Harbin Medical University (číslo schválení: 2020005, Harbin, Čína).

Tvorba krystalů v renální tkáni

Vzorky tkáně byly obarveny metodou Pizzolato [23] a krystaly CaOx byly pozorovány pod optickým mikroskopem s polarizovaným světlem (Sinico Optical Instrument Co., Shenzhen, Čína). Pizzolato-pozitivní oblasti byly měřeny a vyjádřeny jako permillový věk celkové plochy tkáně příčných řezů pomocí ImageJ 1.49v (National Institutes of Health, USA).

Detekce PS v membráně renálních tubulárních buněk in vivo průtokovou cytometrií

Expozice PS renálních epiteliálních buněk byla hodnocena pomocí fluorescein isothiokyanátem (FITC) značeného Annexin V barvícího testu, jak bylo popsáno dříve [2]. Buňky byly pozorovány (v každé skupině) pod konfokálním laserovým mikroskopem (Olympus, Tokio, Japonsko). Množství externalizace PS bylo stanoveno jako procento buněk pozitivních na Annexin V. Fluorescence annexinu V vzorků byla měřena pomocí průtokového cytometru (488 nm excitace/530 nm emise; Beckman Coulter, Brea, CA, USA).

Měření hladin TGF- 1 a Smad7 v membráně renálních tubulárních buněk metodou Western blot

Po získání vzorků zmrazené tkáně byl protein extrahován pomocí přirozené membránové proteinové extrakční soupravy ProteoExtract (M-PEK) (MERCK Co., Kenilworth, NJ, USA) a koncentrace proteinu byla stanovena pomocí Bio-Rad proteinového testu. kit (Hercules, CA, USA) podle pokynů výrobce. Následně byly 40ug proteinu naneseny na 8% SDS-polyakrylamidový gel (stohovací gel 100 V, rozlišovací gel 200 V) po dobu 1 hodiny při konstantním proudu elektrody 300 mA. Proteiny v gelu byly přeneseny na nitrocelulózovou membránu (Kexing Co., Peking, Čína), blokovány po dobu 1 hodiny při 37 stupních v 5% sušeném odstředěném mléce a inkubovány přes noc při 4 °C s ovčím anti-krysím TGF 1 ( ab208466; Abcam, Cambridge, Spojené království) a Smad7 (66 478; Proteintech, Wuhan, Čína) protilátky [25]. Byla přidána králičí anti-ovčí sekundární protilátka značená křenovou peroxidázou (1:400; Nakasugi Jinqiao Co., Peking, Čína) a inkubována při 37 stupních po dobu 1 hodiny. Signál byl detekován pomocí zesíleného chemiluminiscenčního činidla (Abcam). Pozitivní pásy byly analyzovány pomocí softwaru Gel-Pro 4.0 pro analýzu optické hustoty gelu a byla měřena kumulativní optická hustota (hodnota IOD), přičemž hodnota R představovala relativní obsah proteinu takto: R=referenční hodnota IOD PLSCR (cílová)/referenční hodnota IOD GAPDH (referenční protein).

Buněčná kultura a interference RNA

Ledvinová epiteliální buněčná linie (MDCK buňky, CCL34, pasáže 53-90; ATCC, Manassas, VA, USA) byla pěstována v Dulbeccově modifikovaném Eagle médiu doplněném antibiotiky (10{{1{14} }}} U/ml penicilinu, 100 mg/ml streptomycinu; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) a 10% fetální bovinní sérum (Life Technologies Co.) při 37 stupních v 5% CO, atmosféře a subkultivováno s 0,25% trypsin a 1 mM kyselina ethylendiamintetraoctová (Life Technologies Co., CA, USA). Buňky byly ošetřeny CaOx (0,5 mM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) po dobu 2 hodin a 0,5 mM CaOx a 100 ug/ml neutralizační anti-TGF- 1 protilátky (R&D Systems, Minneapolis , MN, USA) po dobu 2 hodin. Všechny experimenty byly provedeny trojmo.

K určení role PLSCRin PS everze byly renální tubulární epiteliální buňky transfekovány PLSCR siRNA [26]. siRNA byla navržena a syntetizována Anhui General Biological System (Anhui, Čína; viz tabulka 1). LipofectamineTM 2000 (Sunshine Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) byl použit k transfekci podle pokynů výrobce . Po 24 hodinách transfekce byly buňky štěpeny trypsinem, centrifugovány při 1000 x g po dobu 5 minut, dvakrát promyty PBS a znovu centrifugovány. Supernatant byl odstraněn a peleta byla suspendována v PBS za vzniku jednobuněčné suspenze o hustotě 1 x 10 stupňů buněk/ml. Pozitivní míra exprese FAM(karboxyfluoresceinu) byla 93 procent ± 5 procent, jak bylo stanoveno průtokovou cytometrií. K dalšímu posouzení vztahu mezi TGF 1 a PLSCR byly buňky ošetřeny 0,5 mM CaOx nebo 10 ng/ml TGF- 1 po dobu 2 hodin a následně transfekovány PLSCR siRNA.

Měření hladiny PLSCR v renálních tubulárních buněčných membránách metodou western blotting

Protein byl extrahován za použití soupravy pro extrakci přirozeného membránového proteinu ProteoExtract (Chemical Book Co., Peking, Čína) a koncentrace proteinu byla stanovena pomocí soupravy pro stanovení proteinů Bio-Rad (Noble-Ryder Co., Peking, Čína). Následně bylo 40 ug proteinu naneseno na 8% SDS-polyakrylamidový gel (stack gel 100 V, rozlišovací gel 200 V) po dobu 1 hodiny při konstantním proudu 300 mA. Proteiny v gelu byly přeneseny na nitrocelulózovou membránu (Kexing Co., Shenzhen, Čína) a blokovány 5% odstředěným mlékem po dobu 1 hodiny při 37 °C a inkubovány přes noc při 4 stupních s ovčí anti-krysí PLSCR monoklonální protilátkou (1:200, PAB781HuO1; Abcam, Guangzhou, Čína). Poté byla přidána králičí anti-ovčí sekundární protilátka značená křenovou peroxidázou (1:400) a směs byla inkubována při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny. Po promytí membrány byl signál detekován pomocí zesíleného chemiluminiscenčního činidla (Abcam, Guang-zhou, Čína). Pozitivní pásy byly analyzovány pomocí softwaru pro analýzu optické hustoty Gel-Pro 4.0gel a byla měřena hodnota IOD, přičemž hodnota R představovala relativní obsah proteinu, jak je popsáno výše.

Tabulka 1 siRNA sekvence pro PLSCR

Měření membránové distribuce fosfatidylserinu

Množství obráceného PS buněčné membrány bylo stanoveno pomocí metody zhášení fluorescence popsané Kim et al.[27] a náš výzkumný tým [2] s nitrobenzen-2-oxa-1,3-diazolem (NBD, Šanghaj, Čína) jako fluorescenční sondou. Po označení PS ve vnější vrstvě buněčné membrány NBD byly buňky kultivovány v PBS obsahujícím 5 mM diisopropylfluorfosfát. Poté byl přidán PBS obsahující oxalát vápenatý (1,{7}} mM) a buňky byly inkubovány při 37 stupních. Stejné množství buněčné suspenze bylo vypouštěno každých 10 minut a intenzita fluorescence byla zaznamenávána pomocí RF-5000 spektrofluorometru (Shimadzu, Kyoto, Japonsko). Nastavení spektrofluorometru bylo následující: šířka štěrbiny 10 nm pro vlnovou délku emise 530 nm; a 5 nm šířka štěrbiny pro excitační vlnovou délku 470 nm. Dále byla zaznamenávána průměrná hodnota fluorescence (FT) za 50s. Průměrná snížená intenzita fluorescence (FD) byla také zaznamenána po použití roztoku dithionitu pro zhášení fluorescence NBD z vnější vrstvy buňky. Poté bylo přidáno 1 procento (w/v) Triton X-100 pro permeabilizaci buněčné membrány. Fluorescence NBD z vnitřní vrstvy buněčné membrány byla poté zhášena a byla zaznamenána intenzita fluorescence (FO). Procento NBD-PS ve vnitřních lalocích bylo později vypočteno pomocí následující rovnice: procento stáří internalizovaného NBD-PS=100×[(FD-FO)/(FT-FO)].

Procento externalizace PS bylo stanoveno podle principu použitého pro měření internalizace NBD-PS. Procento NBD-PS ve vnějších lalocích bylo také vypočteno pomocí následující rovnice: procento NBD-PS ve vnějších lalocích=100×[(FT-FD)/(FT-FO)].

Statistická analýza

Spojité proměnné jsou vyjádřeny jako průměr ± standardní odchylka. Byly použity neparametrický párový test pořadí-součet, t-test a chí-kvadrát test. Všechny analýzy byly provedeny pomocí softwaru SPSS 19.0(SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). Výsledky s P<0.05 were="" considered="" statistically="">

Výsledek

Signalizace TGF- 1/Smad stimuluje externalizaci PS in vivo

Tvorba krystalů v renální tkáni krysího modelu

Vytvořit krysí model v raném stádiuledvinový kámen2 týdny byly do žaludku krys podávány ethylenglykol a chlorid amonný a poté byl každý řez ledvin zkoumán digitálním mikroskopem. Ve vzorcích kontrolní skupiny byly 14. den pozorovány normální renální tubulární struktury bez tvorby krystalů (obr. 1A). Když ledvinová tkáň zledvinový kámenskupina byla pozorována mikroskopicky, renální tubuly se zdály rozšířené s viditelnými mikrokrystaly; v některých renálních tubulech byla pozorována příležitostná akumulace krystalů CaOx, což ukazuje na úspěšné vytvoření modelu potkanů ​​v raném stádiuledvinový kámentvorba a tvorba poškození buněk ledvinových tubulů.

Přítomnost PS v renální tubulární buněčné membráně

Annexin V-FITC, fluorescenční molekula, která se váže na PS na buněčném povrchu, se široce používá k detekci redistribuce PS. V naší studii buňky MDCK v normální kontrole,ledvinový kámen, aledvinový kámenplus SB431542 skupiny byly pozorovány pod konfokálním laserovým mikroskopem (obr. 1B). Míra PS-everze se v roce zvýšilaledvinový kámenskupina ve srovnání s kontrolní skupinou (P<0.05, fig.1c,="" d),="" whereas="" cells="" in="" the="">ledvinový kámenplus skupina SB431542 vykazovala nižší bazální úroveň externalizace PS než skupiny ve skupiněledvinakámenskupina (P<0.05, fig.="" 1c,="">

Měření hladin TGF- 1 a Smad7

Úroveň TGF- 1 vledvinový kámenskupina byla kvantifikována westernovým přenosem. Typický western blot je znázorněn na obr. 2A spolu s denzitometrickou analýzou hladiny TGF- 1. Hodnoty byly normalizovány k hodnotám kontroly a vyjádřeny jako poměr TGF- 1 k tubulinu. Přidání ethylenglykolu a NH Cl významně zvýšilo hladinu TGF- 1 a snížilo hladinu Smad7 ve srovnání s hladinami v kontrolních buňkách (obr. 2A); nicméně léčba SB431542 plus ethylenglykol a NH Called významně snížila hladinu TGF- 1 a zvýšila hladinu Smad7 ve srovnání s těmi v buňkách ošetřených ethylenglykolem a NH, Cl.

TGF aktivuje aktivitu PLSCR v buněčné membráně renálního tubulu in vitro

PLSCR

Úroveň PLSCR byla hodnocena westernovým přenosem. Buňky byly ošetřeny CaOx po dobu 2 hodin. Hladina PLSCR byla zanedbatelná v kontrolních buňkách, ale významně se zvýšila ve skupině CaOx (P<0.05, fig.2b).plscr="" overexpression="" was="" inhibited="" following="" treatment="" with="" the="" anti-tgf-β1="" antibody.="" after="" the="" transfection="" of="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" with="" plscr="" sirna,="" plscr="" expression="" significantly="" reduced=""><0.05,>

Zhoršený pohyb NBD-PS dovnitř

Stanovili jsme vnitřní a vnější pohyby PS v membráně renálních tubulárních epiteliálních buněk, abychom vyhodnotili aktivitu PLSCR. Pro posouzení, zda PLSCR ovlivňuje pohyb PS z vnějšího cípu do vnitřního cípu plazmatické membrány, jsme integrovali fluorescenčně značený PS (NBD-PS) do vnějšího cípu plazmatické membrány a sledovali jeho internalizaci (obr. 3). Množství NBD-PS internalizované buňkami MDCK v kontrolní a CaOx skupině bylo přibližně 46,2 procenta a 17,8 procenta, v tomto pořadí. Rychlost internalizace PS v buňkách skupiny CaOx byla tedy významně nižší než v buňkách kontrolní skupiny (P<0.01, fig.3a).="" however,="" the="" level="" of="" internalized="" nbd-ps="" in="" the="" anti-tgf-β1+caox="" group="" increased="" to="" 34.2%,="" which="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" caox="" group=""><0.01, fig.3a).="" after="" the="" transfection="" of="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" with="" plscr="" sirna,="" the="" level="" of="" internalized="" nbd-ps="" significantly=""><0.05, fig.3b,="">

Obr. 1 Tvorba krystalů a externalizace PS byly pozorovány u kontrolní skupiny, skupiny ledvinových kamenů a ledvinových kamenů plus SB431542.

(A) Tvorba krystalů v renální tkáni v den 14; šipka označuje mikrokrystalické struktury. (B) MDCK buňky byly pozorovány konfokální laserovou mikroskopií.

(C) Průtoková cytometrická grafy míry everze. (D) Everzní poměr ( procenta ). Trojúhelník označuje P<0.05 vs.="" control.="" asterisk="" indicates=""><0.05 vs.="">ledvinový kámenskupina

Vylepšený pohyb NBD-PS směrem ven

Aby se určilo, zda je transport PS směrem ven ovlivněn oxalátem, byly buňky MDCK intracelulárně označeny NBD-PS a byl stanoven rozsah jeho pohybu na leták s příklady-mic. Inkubační médium obsahovalo hovězí sérový albumin (1 procento w/v), který rychle extrahoval povrchově exprimovaný NBD-PS. Přibližně 34,5 procenta NBD-PS migrovalo do vnějšího letáku v kontrolních buňkách, zatímco rychlost přenosu PS ven v buňkách skupiny CaOx byla zvýšena na 75,3 procenta ve srovnání s celkovým vnitřním značeným NBD-PS, což bylo významně vyšší než že v buňkách kontrolní skupiny (P<0.01, fig.3a).to="" determine="" whether="" tgf-β1="" causes="" ps="" eversion="" in="" renal="" tubule="" cell="" membranes="" by="" activating="" plscr,="" cells="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox="" groups="" were="" transfected="" with="" plscr="" sirna.="" after="" plscr="" sirna="" transfection,="" the="" externalization="" rate="" was="" lower="" than="" that="" in="" the="" tgf-β1="" and="" caox=""><0.01 for="" both,="" fig.3b,="">

Obr. 2 Exprese TGF- 1/Smad v kontrolní skupině, ledvinový kámen a ledvinový kámen plus SB431542 a exprese PLSCR v buněčné membráně renálního tubulu.

(A)TGF- 1/Smad výraz. (B) Relativní hladiny fosfolipidové skramblázy (PLSCR) a reprezentativní blot s expresí normalizovanou k expresi GAPDH.P<>

Trojúhelník označuje P<0.05 vs.control.="" the="" round="" dot="" indicates=""><0.05 vs.="" the="" caox="" group.="" pound="" sign="" indicates=""><0.05 vs.="" tgf-β1="">

PRO ČÁST KLIKNĚTE ZDE Ⅱ