Jak oxid dusnatý syntáza ovlivňuje ledviny?

Kontakt: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Molekulární studie toxicity diazinonu na základě indukovatelné exprese syntázy oxidu dusnatého (iNOS) v hepatocytech a histopatologii ledvin potkanů ​​(Rattus norvegicus)

Abstraktní

Diazinon je organofosfátový insekticid, který se široce používá k hubení škůdců, ale má vyšší toxicitu než jiné insekticidy. Diazinon, který je náhodně požit orálně, má vliv na zvýšení reaktivních forem kyslíku (ROS) v těle. Reaktivní formy kyslíku (ROS) budou aktivovat prozánětlivý cytokin, který bude indukovat indukovatelnostSyntáza oxidu dusnatého(iNOS), ve kterém iNOS (Syntáza oxidu dusnatého) vyrobíOxid dusnatý(NO) jako volný radikál. Vysoká hladina ROS způsobí poškození buněk. Tato studie byla zaměřena na stanovení toxického účinku diazinonu na iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)exprese v játrech aledvinahistopatologie potkanů ​​(Rattus norvegicus). Potkani byli rozděleni do 4 skupin, které se skládaly z negativní kontrolní skupiny a tří experimentálních skupin, kterým byl podáván diazinon 20 mg/kg BW (P1), 40 mg/kg BW (P2) a 60 mg/kg BW (P3). Parametry, které byly v tomto výzkumu pozorovány, jsou vyjádřením iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)v játrech pomocí imunohistochemického barvení, poté analyzováno pomocí jednocestné ANOVA následované Tukey testem (a=0,05) aledvinahistopatologie, která byla pozorována pomocí barvení hematoxylin-eosinem a analyzována kvalitativně popisně. Výsledky ukázaly, že perorální podávání diazinonu významně zvýšilo iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)výraz (str<0,001)in the="" liver="" and="" caused="" damage="" to="" the="">ledvinykůra, která byla prokázána infiltrací zánětlivých buněk, nekrotickéledvinabuňky tubulů a krvácení v intertubulárním prostoru.

klíčová slova:Diazinon, organofosfát, iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)výraz,ledvinahistopatologie.

Cistanche zlepšují funkci ledvin

1. Úvod

Používání pesticidů zvyšuje produkci, zejména jako prevence proti škůdcům a plevelům (Kusriani, 2012). Časté používání pesticidů však může způsobit, že tyto pesticidy budou toxické pro spotřebitele, včetně zvířat, jak vdechováním, orálním podáním, tak kůží (Ameriana, 2006). Jedním z běžně používaných pesticidů je diazinon. Diazinon je organofosfátový pesticid, který má mechanismus inhibující funkci enzymu cholinesterázy. Tyto pesticidy mají také menší účinek na necílové organismy a jsou toxičtější pro obratlovce ve srovnání s organochlorovanými látkami (Luthfanto, 2014). Normálně budou pesticidy neutralizovány v játrech hepatocyty detoxikací, ale tyto sloučeniny jsou také schopné tvořit volné radikály v důsledku poškození buněk. Expozice organofosfátům, ke které dochází nepřetržitě, může vyvolat poškození jater jako orgánu, který hraje roli v procesu detoxikace (Ginting, 2014). Organofosfáty, které byly metabolizovány v játrech, mají schopnost inhibovat enzym AChE. Inhibice tohoto enzymu má přímo za následek zvýšení hladiny acetylcholinu v nervovém systému a nervosvalovém systému. Zvýšení AChE může způsobit, že ionty v buňkách se stanou nestabilními a spustí tvorbu reaktivních kyslíkových druhů (ROS) (Uchendu, 2012). Zvýšené ROS spustí produkci prozánětlivých cytokinů. Naik a Vishva (2011) uvádějí, že ROS ovlivňuje transkripci prozánětlivých cytokinů, kde vysoké hladiny ROS budou následovány vysokými hladinami prozánětlivých cytokinů, a pokud je produkce ROS inhibována inhibitory, ovlivní snížení produkce prozánětlivých cytokinů, jako je např. jako IL-6 a TNF. Zvýšená produkce prozánětlivých cytokinů bude indukovat iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)a tvoří NO v nadměrném množství (Aktan, 2004).

Theledvinaje hlavním orgánem, který udržuje rovnováhu extracelulární tekutiny (ECF) prováděním jejích funkcí při vylučování a metabolismu (Curthoys, 2014). Vylučování nebo eliminace xenobiotického metabolismu vede kledvina. Theledvinapoškození může snížit úroveň vylučování chemických látek bez zvýšení toxicity toxických látek (Gupta, 2012). Podmínky oxidačního stresu zahájí proces peroxidace lipidů odebráním vodíkových iontů z vazby polynenasycených mastných kyselin (PUFA) za vzniku stabilnější molekuly. Proces přerušení vazby na PUFA může způsobit nekrózu buněk nebo tkání (Sharma et al..2003).

Tato studie byla provedena za účelem stanovení toxického účinku diazinonu proti iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)exprese v jaterní a renální histopatologii krys.

Syntáza oxidu dusnatého ovlivňuje funkci ledvin

2. Materiály a metody

2.1. Zvířecí modely a experimentální design

Dvacet krys (Rattus norvegicus) bylo rozděleno do 4 skupin: negativní kontrolní skupina (zdravé krysy). Skupinám P1, P2 a P3 byl podáván diazinon po dobu 8 týdnů orálně pomocí vyživovací sondy s dávkami 20 mg/kg tělesné hmotnosti, 40 mg/kg tělesné hmotnosti a 60 mg/kg tělesné hmotnosti. Diazonium 600EC bylo mícháno s destilovanou vodou, dokud neobsahovalo 5 mg diazonia v 1 ml (Baconi et al., 2013).

Krysy byly aklimatizovány po dobu jednoho týdne před přijetím léčby. Všechny podmínky a manipulace se zvířaty byly prováděny podle protokolu schváleného komisí pro etické prověřování Univerzity Brawijaya (č.: 732-KEP-UB).

2.2. Příprava a pozorování histopatologie ledvin

Přípravaledvinahistopatologie se skládá z následujících fází: fixace, dehydratace, clearance, zalévání, řezy, lepení na skleněné předměty podle Muntihy (2001). Pozorování zledvinahistopatologie byly prováděny pomocí binokulárního světelného mikroskopu se zvětšením mikroskopu 100x a následně až 400x. Pozorování bylo provedeno na renálním glomerulu a renálních tubulech.

2.3. Analýza exprese iNOS (syntázy oxidu dusnatého) v játrech

iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)exprese na játrech byla analyzována imunohistochemickými metodami s použitím anti iNOS (Syntáza oxidu dusnatého) jako primární protilátka a anti-králičí IgG biotinem značená jako sekundární protilátka. Měření iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)exprese na játrech byla provedena pomocí softwaru Immunoratio. Výsledky procentuální plochy exprese iNOS byly analyzovány kvantitativně pomocí jednocestného testu analýzy variance (ANOVA) a následovaly Tukeyho testem.

3. Výsledky a diskuse

3.1. Analýza exprese iNOS (Nitric Oxide Synthase) v játrech

Analyzovat expresi iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)na jaterních buňkách byla provedena imunohistochemickou metodou. Výraz iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)může být zobrazen jako hnědý barevný výraz na hepatocytech, který lze vidět na obrázku 1.

Obrázek 1. iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)výraz na játrech.

(1) Negativní kontrolní skupina (K-). (2)P1 (indukováno diazinonem 20 mg/kg tělesné hmotnosti. (3) P2 (indukováno diazinonem 40 mg/kg tělesné hmotnosti).

(4) P3 (indukovaný diazinonem 60 mg/kg tělesné hmotnosti. Bílý kruh ukazuje plochu iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)výraz.

Výsledek imunohistochemie byl analyzován kvalitativně a ukázal, že došlo ke zvýšení intenzity hnědého zbarvení (obrázek 1). Tento výsledek naznačuje, že došlo ke zvýšení iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)úrovně exprese v léčené skupině ve srovnání s kontrolní skupinou.

Pro měření úrovně iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)exprese na hepatocytech použitá softwarová imunoreakce. Výsledky kvantitativní analýzy iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)expresi v játrech potkanů ​​lze vidět v tabulce 1 a lze usoudit, že existuje významný rozdíl (p<0.001) between="" the="" treatment="" groups="" compared="" to="" the="" negative="" control="" group="" (k-).="" in="" the="" negative="" control="" group="" that="" was="" the="" group="" without="" diazinon="" organophosphate="" induction,="" the="" average="" percentage="" area="" of=""> (Syntáza oxidu dusnatého)Sexprese byla 1,340 ±0,092 procenta. V léčebné skupině 1 (P1), což byla skupina indukovaná diazinon organofosfátem v dávce 20 mg/kg tělesné hmotnosti, průměrné procento plochy iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)exprese byla 4,184±1,041 procenta. Léčebná skupina 2 (P2) byla skupina indukovaná diazinon organofosfátem v dávce 40 mg/kg tělesné hmotnosti a průměrem iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)výraz byl 7,496±0,997 procent . Léčebná skupina 3 (P3) byla skupina indukovaná diazinon organofosfátem v dávce 60 mg/kg tělesné hmotnosti a průměrem iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)výraz byl 11,604 ± 0.864.

Negativní kontrolní skupina vykazovala iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)exprese v nízké intenzitě (1,340 ± 0,092 procenta). McNaughton a kol. (2002) zjistili, že iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)byl exprimován v normálních jaterních acini. Šíření iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)v normálních játrech ukazuje oblast kolem brány s nejsilnější expresí a intenzita klesá podél jaterních acini. Podle Kubese (2000) iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)může poskytnout terapeutické účinky, pokud je regulován ve správném množství a umístění, iNOS má pozitivní roli včetně hojení kůže a střevní sliznice, boj proti některým bakteriím, potenciál v regulaci proliferace a diferenciace T buněk a regulaci náboru leukocytů .

Léčebná skupina vykazovala významné zvýšení procentuální plochy iNOS (Syntáza oxidu dusnatého) (p<0,001). diazinon="" such="" as="" organophosphate="" in="" general="" will="" be="" metabolized="" which="" mainly="" takes="" place="" in="" the="" liver.="" the="" metabolism="" that="" occurs="" in="" phase="" 1="" metabolism="" is="" an="" oxidation="" process,="" where="" organophosphate="" will="" be="" broken="" down="" into="" oxon-organophosphate="" metabolites="" and="" free="" sulfur="" ions="" with="" the="" help="" of="" cytochrome="" enzymes(cyp)(gupta,="" 2009).="" metabolites="" from="" phase="" 1="" metabolism="" are="" free="" radicals,="" unstable="" substances="" that="" have="" no="" electron="" pairs.="" free="" radicals="" will="" produce="" reactive="" oxygen="" species="" (ros)such="" as="" superoxide,="" hydroxyl="" radicals,="" and="" hydrogen="" peroxide="" through="" interactions="" with="" other="" molecules.="" free="" radicals="" react="" with="" phospholipids="" from="" the="" plasma="" membrane,="" endoplasmic="" reticulum="" membrane,="" or="" mitochondrial="" membrane="" and="" cause="" cell="" death="" (gupta,="" 2012).="" organophosphate="" pesticides="" can="" also="" cause="" oxidative="" stress(mishra,="" 2013).="" this="" oxidative="" stress="" condition="" is="" caused="" by="" diethyl="" as="" an="" organophosphate="" free="" radical(diazinon)that="" is="" capable="" to="" produce="" large="" amounts="" of="" ros.="" oxidative="" stress="" is="" an="" impaired="" balance="" between="" prooxidants="" and="" antioxidants="" that="" causes="" potential="" damage="" (uchendu="" et="" al.,="">

Zvyšující se ROS spustí produkci prozánětlivých cytokinů. Druhy reaktivního kyslíku ovlivňují transkripci prozánětlivých cytokinů, kde vysoké hladiny ROS budou následovány vysokými hladinami prozánětlivých cytokinů, podobně, pokud je produkce ROS inhibována inhibitory, ovlivní také pokles produkce prozánětlivých cytokinů, jako je IL{{0 }} a TNF (Naik a Vishva, 2012). Dunlop et al. (2014) a Pahan et al. (2000) uvedli, že TNF- a IL-1 hrají roli ve zvýšení exprese iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)v tkáních prostřednictvím aktivace Nappar Kappa B(NF-kB), ve které NF-kB vstupuje do jádra a váže se na promotorovou oblast iNOS (Syntáza oxidu dusnatého). Zvýšená produkce prozánětlivých cytokinů bude indukovat iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)a tvoří nadměrné množstvíOxid dusnatý(NO) (Aktan, 2004).

3.2. Analýza histopatologie ledvin

Výsledky tohoto výzkumu vlivu toxicity diazinonu naledvinahistopatologické znaky využívající barvení hematoxylinem-eosinem (HE) jsou uvedeny na obrázku 2. Histologický obraz renální kůry potkana v negativní kontrolní skupině (K-) skupině vykazoval normální stav a nebyla nalezena žádná abnormalita. Dokazuje to výskyt renálního korpusu, proximálních a distálních konvulzivních tubulů s vrstvou krychlových epiteliálních buněk (obrázek 2(1)).

Histopatologický obraz renální kůry potkanů ​​ve skupině P1 vykazoval abnormality, které se vyznačovaly přítomností buněk podstupujících karyolýzu a hypertrofii. Karyolýzové buňky byly charakterizovány vymizením buněčného jádra, zatímco epiteliální buňky podstupující hypertrofii mají vlastnosti zvětšené velikosti buněk, takže struktura renálních tubulů se jeví nepravidelná. Na tomto obrázku jsou vidět erytrocyty v intertubulárním prostoru, což ukazuje na přítomnost krvácení (obrázek 2(2). Histopatologický obrázek ve skupině P2 ukazuje abnormality podobné skupině P1. Abnormality, které lze pozorovat v kůře ledviny krys P2 zahrnují výskyt buněk podstupujících karyolýzu, hypertrofii buněk a krvácení.ledvinatubuly vypadají nepravidelně ve srovnání se skupinou K- (obrázek 2(3)). Histopatologický obraz kůry ledvin potkanů ​​ve skupině P3 vykazoval abnormality, jak je vidět na histopatologickém snímku kůry ledvin u potkanů ​​Pl a P2, charakterizovaný výskytem hypertrofie buněk, karyolýzy a erytrocytů v intertubulárním prostoru (hemoragie ). Lze také pozorovat přítomnost infiltrace zánětlivých buněk do tkání (obrázek 2(4)).

Diazinon organofosfát, který byl podáván krysám perorálně, bude tráven trávicím traktem, který bude poté absorbován střevem, zejména dvanácterníkem. Metabolismus organofosfátů probíhá hlavně v játrech, ale v menší míře také v dlani a střevech. Organofosfát projde 1. fází metabolismu, což je oxidační proces, kdy se organofosfát rozloží na oxon-organofosfátové metabolity a volné ionty síry pomocí enzymů cytochromu (CYP) (Gupta, 2009; Elersek a Metka 2011). Oxon-organofosfátový metabolit pak vstupuje do krevního řečiště a jde do jater k dalšímu metabolismu. V játrech se oxon-organofosfátové metabolity hydrolyzují pomocí enzymů karboxylesterázy (CE) a paraoxonázy (PON), rozštěpí se na dialkylfosfát a opustí skupinu. Dialkylfosfatáza pak bude katalyzována enzymy ve fázi 2 metabolismu, které budou produkovat molekuly, které jsou hydrofilní a mohou být vylučovány močí, zatímco opouštějí skupiny (ve formě diethylu), které mohou vyvolat oxidační stres v těle. Diethyl je velmi reaktivní molekula a může reagovat s hydroxylovými radikálovými skupinami (-OH) za vzniku nových volných radikálů (Elersek a Metka, 2011). Vysoký počet volných radikálů v těle nemůže být neutralizován endogenními antioxidanty, což vede k nerovnováze mezi volnými radikály a antioxidanty, která způsobuje oxidační poškození (Caramori a Papi, 2004). K tomuto oxidačnímu poškození dochází, protože diethyl-hydroxyl jako volný radikál z organofosfátového diazinonu je schopen produkovat velké množství ROS (Uchendu et al., 2012). Zvyšující se ROS pak způsobí podmínky oxidačního stresu a zahájí proces peroxidace lipidů odebíráním vodíkových iontů z polynenasycených mastných kyselin (PUFA) za vzniku stabilnějších molekul. Proces štěpení vazby PUFA může způsobit nekrózu buněk nebo tkání (Sharma et al., 2003).

Abnormality se vyskytly vledvinatubulární epitel v důsledku přímého kontaktu epitelu s toxickou látkou diazinon a vledvinatubulu, dochází v procesu tvorby moči k procesu reabsorpce a augmentace (Mescher, 2010). Toxická látka diazinon, která je stále v cévách, bude v přímém kontaktu s endotelem a způsobí tak narušení permeability cévní membrány. Krvácení v intertubulárním prostoru bylo způsobeno porušením permeability membrán krevních cév (peritubulárních kapilár), takže erytrocyty mohou vstoupit do tkáně (Djumadi et al., 2008). Poranění endoteliálních buněk spouští zánětlivé reakce, které mají za následek akumulaci makrofágů a krevních destiček vně a uvnitř tepen. Objevení se infiltrace zánětlivých buněk v poškozené tkáni ukazuje, že metabolity diazinonu způsobují toxicituledvina(Khudair et al., 2017).

Na základě výsledků histopatologického vzhledu vykazovala kůra ledvin v léčené skupině abnormality ve srovnání s K-skupinou. Bylo známo, že skupina P1 s nejnižší dávkou 20 mg/kg tělesné hmotnosti vykazovala poškozeníledvinatubulárních buněk ve srovnání s K-skupinou.

Cistanche zlepšují funkci ledvin

4. Závěr

Bylo prokázáno, že podávání diazinonu v nejnižší dávce 20 mg/kg tělesné hmotnosti má u potkanů ​​toxický účinek, což je indikováno významným zvýšením iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)výraz (str<0.001)and showed="" the="" damage="" of="" the="" renal="" cortex="" in="" the="" form="" of="" renal="" tubular="" cell="" necrosis,="" hemorrhage,="" and="" renal="" tubular="" cell="">

5. Reference

[1] Aktan, F 2004 iNOS (Syntáza oxidu dusnatého)-Zprostředkovaná produkce oxidu dusnatého a její regulace. Life Sciences, 75:639-653.

[2] Ameriana, M. 2006. Perilaku Petani Sayuran z Menggunakan Pestisida Kimia.J. Hort.18(1):95-106,2008.

[3] Arthur,CGand EHJohn.1997.Fisiologi Kedokran.EGC.Edisi9.1997.

[4] Aulanni'am, A. Rosdiana a NL Rahmah. 2012. Potence of Sargassum duplikované Bory extrakty při léčbě zánětlivých střevních extraktů onemocnění v Rattus norvegicus. Journal of Life Sciences 6:144-154.

[5] Caramori, G. a A. Papi. 2004. Antioxidanty v otravě organofosforovými sloučeninami. IntJ Pharm Bio Sci,59 (2): 170-173.

[6] Cox, C.2000.Diazinon: Toxicology.Journal of Pesticide Reform/ Summer 20(2).

[7] Curthoys, NP a WM Orson. 2014. Funkce proximálních tubulů a reakce na acidózu. Americká nefrologická společnost. Clinical Journal of the American Society of Nephrology 9:1627-1638

[8] Djumadi, H., dan H. Sugiyono. 2008. Pengaruh Pemberian Insektisida Diazinon dan Kurkumin Kunyit (Curcuma domestica) Per-Oral terhadap Perubahan Struktur Histologis Duodenum Mencit (Mus musculus).Jurnal Penelitian Sains & Teknologi, Vol.9(1):62-83.

[9] Dunlop, K., G.Kiranjot, K. Crystal, I.Julijana, D.Rupinder, D.Jean-Francois, ACKim, J. Amish, PJ McNamara a PJ Robert. 2014. Terapeutická hyperkapnie zabraňuje inhalačním oxidem dusnatým indukované systolické dysfunkci pravé komory u juvenilních potkanů. Elsevier Inc. Free Radical Biology and Medicine 9: 35-49.

[10] Elersek,T.and F.Metka.2011.Pesticides: The Impacts of Pesticides Exposure.InTech Europe. Rijeka.

[11] Frazier,SK, CSJohn,CHGordon,B.Graham, B.Roger, N.Shinji, N.Akiyoshi, D.Beate a B. Axel.2012. Proliferativní a neproliferativní léze močového systému potkanů ​​a myší. Toxicologic Pathology, 40:14S-86S

[12] Georgievskii, V.1., BNAnnenkov a VTSamokhin. 2013. Materiální výživa zvířat: Studie v zemědělských a potravinářských vědách. Butterworths & Co. (Vydavatelé) Ltd. Londýn. 160-161.

[13] Gupta, RC2012.Veterinární toxikologie Druhé vydání.Elsevier inc. Waltham. USA.

[14]Hubrecht, R. a J. Kirkwood. 2010. UFAW: Příručka péče a řízení laboratorních a jiných výzkumných zvířat. Federace univerzit pro dobré životní podmínky zvířat. Spojené království.

[15]Khudair, ZW, ASHanan a KE Manal. 2017. Histopatologické změny, které vyvolaly ve vnitřních orgánech bílé krysy po expozici Diazinon.Bas..Vet.Res. 1(2)

[16] Kubes, P.2000. Inducible Nitric Oxide Synthase: A Little Bit of Good in All of Us. http://dx.doi.org/10.1136/gut.47.1.6 [24. července 2019].

[17] McNaughton, L., P.Lakshmi, AMMaria, K. Norm, M. Irvin, M. Redwan, H. Outayba a WR Marek. 2002. Distribuce syntázy oxidu dusnatého v normálních a cirhotických lidských játrech. Proceedings of the National Academy of Science Vol. 99, No.26 17161-17166.

[18] Mescher, AL2010. Junqueira's Basic Histology: Text & Atlas 12 Edition. The McGraw-Hill Companies, Inc. Spojené státy americké.

[19] Mishra, BP 2013. Antioxidační stav a oxidační stres při otravě organofosfátovými pesticidy.IOSR.Journal of Dental and Medical Sciences (IOSR-JDMS)e-ISSN:2279-0853, p-ISSN:2279-0861 .Svazek 7, vydání 6 (květen–červen 2013), PP 20-24