Část 2: Karbamylovaný sortilin spojený s kardiovaskulární kalcifikací u pacientů s chronickým onemocněním ledvin

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Kliknětetadypro část 2.

Karbamylovaný sortilin mění vazbu ligandu

Sortilin je koreceptorem pro několik ligandů.8 Karbamylace lysinu významně mění vlastnosti postranního řetězce lysinu, přičemž kladně nabitá aminoskupina je nahrazena objemnou polární skupinou, což potenciálně ovlivňuje vazbu ligandu. Zkoumali jsme interakce nejčastěji modifikovaných postranních řetězců sortilinu lysinu nalezených vchronický ledvinachoroba(aminokyselinová sekvence [sekvence krystalové struktury]), Lys95(62), Lys205(172), Lys260(227) a Lys294(261), pomocí in silico modelování pro predikci možných strukturně-funkčních následků karbamylace lysinu. Použili jsme existující krystalovou strukturu ektodomény sortilinu jak z formy vázané na neurotensin při neutrálním pH (soubor PDB Q24: 4PO7; obrázek 3a), tak z formy bez ligandu při kyselém pH (soubor PDB: 6EHO; doplňková tabulka S5).

Při neutrálním pH tvoří Lys95(62) solný můstek s Glu609(576) a vodíkovou vazbu s karbonylovou skupinou hlavního řetězce Arg90(57). Při kyselém pH je interakce s Glu609(576) těsnější, protože vzdálenost mezi aminoskupinou Lys95(62) a karboxylovou skupinou Glu609(576) nyní umožňuje vytvoření vodíkové vazby, zatímco interakce s Arg90(57 ) není přítomen. Proto karbamylace na Lys95(62) může destabilizovat obě konformace sortilinu. Karbamylace na Lys205 by tedy možná upřednostňovala kyselou pH konformaci sortilinu. Lys294(261) nemá žádné interakce při neutrálním ani kyselém pH.

Účinky cistanche: léčba onemocnění ledvin

Konečně, při neutrálním pH, Lys260(227) interaguje s neurotensinem-Tyr11 ve vazebném místě pro ligand v b-vrtulovém tunelu sortilinu. Protože struktura sortilinu s kyselým pH nemá žádnou afinitu k ligandu, nenalezli jsme v této struktuře žádné interakce postranního řetězce Lys260(227). Interakce s neurotensinemTyr11 bude ovlivněna karbamylací a může vést k nižší afinitě k neurotensinu. Interleukin 6 (IL-6), známý ligand sortilinu,20 váže sortilin prostřednictvím svého C-terminálního konce, který obsahuje arginin v ekvivalentní poloze neurotensinu-Tyr11. Karbamylace Lys260(227) by tedy pravděpodobně mohla zvýšit afinitu k IL-6, potenciálnímu přispěvateli k vaskulární kalcifikaci.

Následné vazebné studie pomocí povrchové plasmonové rezonanční spektroskopie a SortCo nebo SortCarb odhalily účinnější vazbu IL-6 na SortCarb (KD ¼ 23 nM) ve srovnání s Q25 s nemodifikovaným SortCo (KD ¼ 141 nM), což naznačuje, že karbamylovaný sortilin je potenciálním -6 vazebného partnera (obrázek 3b a c). Progranulin, další známý ligand sortilinu,22 se vázal na SortCo, ale vazba na SortCarb nemohla být detekována (doplňkový obrázek S7A a B). SortCo i SortCarb jsou vázány na protein spojený s lidským receptorem fúzovaný s GST tagem,23 ale ne s GST samotným, což podporuje Q26 strukturální integritu sortilinu bez ohledu na jeho karbamylační stav a prokazuje specifičnost našeho experimentálního nastavení (doplňkový obrázek S7C– F).

Dále jsme hodnotili, zda by změněná afinita k IL-6 mohla ovlivnit signální dráhy zapojené do vaskulární kalcifikace. Při kalcifikaci hSMC podpořilo přidání IL-6 k SortCarb expresi mRNA ALPL a RUNX2 (obrázek 3d a e) a také aktivitu TNAP (obrázek 3f), zatímco v kombinaci se SortCo nemělo žádný účinek. Tato data ukazují, že karbamylace sortilinu zvyšuje schopnost vazby ligandu na IL-6, což způsobuje zvýšenou kalcifikaci buněk hladkého svalstva.

figure 3-1

Karbamylace Sortilinu je spojena s vaskulární kalcifikací vchronickýledvinachorobapacientů Na základě našich údajů, se kterými bylo zjištěno spojení karbamylovaných zbytků sortilinuchronickýledvinachorobaa kalcifikace, jsme dále studovalichronickýledvinachorobaúčastníci studie CARVIDA, u kterých počítačové tomografické skeny kvantifikovaly CAC. Stejně jako účastníci studie CARE FOR HOMe měla většina účastníků CARVIDA 2 a 3 PTM s často postiženými zbytky lysinu 95 a 260 (doplňkový obrázek S8A). Ve srovnání s pacienty bez karbamylovaných zbytků byli pacienti s 1 zbytkem sortilin karbamyl-lysin starší (P ¼ 0.002), měli nižší eGFR (P ¼ 0,008), byli více často (bývalí) kuřáci (P ¼ 0,023) a měli významně vyšší objem CAC (P < 0,001;="" obrázek="" 4a="" a="" doplňková="" tabulka="">

Ln-(CAC plus 1) na začátku koreloval s přítomností a zvýšením posttranslačně karbamylovaného sortilinu (doplňková tabulka S7). Kromě toho byl Ln-(CAC þ 1) také spojen s mužským pohlavím, diabetes mellitus, antidiabetiky a léky snižující hladinu lipidů, vyšším věkem, sérovým IL-6 a hemoglobinem A1c a nižším eGFR a sérovým lipoproteinem s vysokou hustotou ( Doplňková tabulka S7). Nicméně asociace mezi karbamylovanými zbytky sortilinu a výchozí hodnotou Ln-(CAC + 1) zůstala významná po úpravě pro všechny výše uvedené proměnné (P ¼ 0,029; tabulka 3).

cistanche

Účinky cistanche: léčba onemocnění ledvin

Dále jsme hodnotili, zda přítomnost karbamylovaných zbytků má vliv na progresi CAC. Přítomnost karbamylovaného sortilinu (vs. žádná karbamylace) zvýšila progresi CAC (P ¼ 0,047). Podrobně,chronickýledvinachorobapacienti s karbamylovaným sortilinem (n ¼ 33) vykazovali významně zvýšenou progresi CAC za střední dobu sledování 4,4 roku (obrázek 4b), s ročním nárůstem mediánu objemu CAC o 30.32 Q27 (interkvartilní rozsah ¼ 84,0) (obrázek 4C). V porovnání,chronickýledvinachorobapacienti bez karbamylace sortilinu (n ¼ 8) odhalili roční změnu mediánu objemu CAC 1,63 (interkvartilní rozmezí ¼ 8,54) a žádnou významnou progresi CAC během období sledování (obrázek 4b a c). Po úpravě o kovariáty spojené s progresí CAC (výchozí objem CAC, věk, pohlaví, index tělesné hmotnosti, eGFR, diabetes mellitus, sérový IL-6, sérový lipoprotein s vysokou hustotou a léky snižující hladinu lipidů) byl stav karbamylace již není spojen s progresí CAC (P ¼ 0.286).

Pacienti s karbamyl-lysinovým zbytkem 260 vykazovali nejvyšší nárůst objemu CAC než pacienti bez karbamylovaného zbytku nebo karbamyl-lysinových zbytků jiných než 260 (doplňkový obrázek S8B).

Celkově data naznačují, že posttranslační karbamylovaný sortilin je spojen s objemem CAC a jeho progresí u pacientů schronickýledvinachoroba.

DISKUSE

V různých experimentálních studiích in vitro a in vivo a ve 2 nezávislých prospektivních kohortách prokazujeme, že pacienti schronickýledvinachorobavykazují specifický vzor posttranslačních karbamylovaných zbytků lysinu sortilinu v oběhu, které lze také detekovat ve vaskulární stěně. Kromě toho byla karbamylace sortilinu spojena s CAC vchronickýledvinachorobapacientů, nezávisle na věku,ledvinafunkce a další rizikové faktory pro kalcifikaci. Mechanicky bychom mohli prokázat, že karbamylace sortilinu zvyšuje jeho schopnost vázat IL-6 a působí přímo na vaskulární buňky, aby podpořila vaskulární kalcifikaci (obrázek 4d). Celkově tato studie odhalila nový netradiční rizikový faktor kalcifikace, který potenciálně přispívá k vysoké zátěžikardiovaskulárnínemoci vchronickýledvinachoroba.

Karbamylace proteinu může být zprostředkována kyanátem, který se vyvíjí během spontánního rozkladu močoviny nebo je generován myeloperoxidázou katalyzovanou oxidací thiokyanátů v místech zánětu.24 Ukázali jsme, žechronický ledvinachorobapacientů s vyššími hladinami močoviny v důsledku sníženéledvinafunkce vykazovala více zbytků karbamylace sortilinu než zdravé kontroly. Nezjistili jsme však žádnou souvislost mezi celkovými hladinami a aktivitou myeloperoxidázy a karbamylace sortilinu, což naznačuje urémii jako primární hybnou sílu pro karbamylaci sortilinu.chronickýledvinachoroba. Naše data navíc ukazují, že věk, NT-proBNP a nižší příjem antagonistů aldosteronu jsou spojeny s více karbamylovanými zbytky. Naše údaje jsou v souladu s předchozími zprávami, které identifikovaly stárnutí jako významný mediátor karbamylace proteinů.25 Bylo prokázáno, že antihypertenziva hydrochlorothiazid a amlodipin ovlivňují hladiny homocitrulinu, aminokyseliny související s cyklem močoviny a produktu odvozeného od karbamylace.26 Zda příjem antagonistů aldosteronu snižuje homocitrulin, a tím snižuje karbamylované zbytky vchronickýledvinachorobapacientů, není znám. Drechsler a kol. prokázali korelaci mezi sérovým karbamylovaným albuminem a NT proBNP, která byla spojena se srdečním selháním u pacientů závislých na dialýzechronickýledvinachorobapacientů.27 Není známo, zda karbamylace sortilinu může sloužit také jako rizikový faktor pro srdeční selhání, ale zvýšená koronární kalcifikace s potenciálně následnými škodlivými účinky na srdeční funkci by mohla v naší studii vysvětlit souvislost mezi karbamylovanými rezidui sortilinu a hladinami NT proBNP.

cistanche

Účinky doplňku cistanche: léčba onemocnění ledvin a zlepšení imunity

Nedávné studie identifikovaly úlohu sortilinu v patogenezi vaskulárních a metabolických poruch, ale zaměřily se především na tkáňovou expresi sortilinu spíše než na zkoumání funkce rozpustné formy.7 Cirkulující sortilin může pocházet z buněčného uvolňování jejich luminální domény, jak bylo prokázáno in vitro , 28–30, a ze sekretovaných extracelulárních váčků naplněných sortilinem.9,31 Karbamylace vede ke změnám náboje, strukturních a funkčních vlastností proteinů, zprostředkovává ztrátu funkce a potenciálně patofyziologické buněčné a molekulární odpovědi.5 čas specifický karbamylační vzor lysinového zbytku cirkulujícího sortilinu vchronickýledvinachorobapomocí cíleného MS přístupu a předpověděl funkční a strukturální změny pomocí in silico modelování. Navrhujeme, že karbamylace lysinu bude podporovat kyselou pH konformaci sortilinu, což ovlivní afinitu sortilinu k ligandu závislou na pH. Předchozí studie krystalové struktury prokázaly, že při pH 5,5, což představuje prostředí podobné prostředí pozdních endozomů, sortilin podléhá konformačním změnám a tvorbě dimerů, takže známá vazebná místa jsou nedostupná pro vazbu ligandu.32,33

Lysin 260 tvoří vodíkovou vazbu k tyrosinu neurotensinu uvnitř b-vrtulového tunelu, což naznačuje, že by byly ovlivněny i další ligandy, které se vážou podobně jako neurotensin. Náš výzkum zjistil zvýšenou afinitu IL-6 ke karbamylovanému sortilinu, což naznačuje účast v signálních drahách IL-6. Několik studií naznačilo, že IL-6 může přispívat k vaskulární kalcifikaci vchronickýledvinachoroba.22,34,35 funkční role v patologii kalcifických cév. Rozpustný karbamylovaný sortilin podporoval vaskulární kalcifikaci in vitro a ex vivo zvýšením osteogenních cílových genů, aktivity TNAP a mineralizace matrice. Navíc přidání IL-6 ke karbamylovanému sortilinu dále zvýšilo osteogenní cílové geny a aktivitu TNAP.

Karbamylace je spojována s alterací extracelulární matrix, 36 oxidačním stresem, 25 endoteliálními dysfunkcemi 37 a aterosklerózou, 38 které se všechny podílejí na zahájení a progresi kalcifikace. Přestože Mori a spol. uvedli, že karbamylace proteinů podporuje vaskulární kalcifikaci prostřednictvím karbamylace mitochondriálních proteinů,6 nebyly identifikovány žádné specifické cílové proteiny. Nedávná studie prokázala, že karbamylace uromodulinu vedla ke ztrátě jeho antikalcifikačních vlastností in vitro. 39 Obě studie použily k detekci karbamylace obecně Western blot. Ukázali jsme, že in vitro karbamylovaný sortilin napodobuje specifickou modifikaci lysinu in vivo nalezenou vchronickýledvinachorobapacientů s RS. Naše studie tedy poskytuje vodítka ke specifickým mechanismům propojováníchronickýledvinachoroba, karbamylaci bílkovin, IL-6 a kalcifikaci.

Dříve byly vysoké hladiny sérového sortilinu spojeny jak s kalcifikací břišní aorty, tak skardiovaskulárníevents independent of traditional Framingham risk factors in a community-dwelling cohort of men aged >50 let.10 U pacientů s nízkým až středním rizikem bolesti na hrudi se hladiny sortilinu nesouvisely se závažností onemocnění koronárních tepen.40 V této studii jsme mohli prokázat, že pacienti schronickýledvinachorobamají vyšší hladiny sortilinu než kontroly s normálnímiledvinafunkce. Hladiny Sortilinu se nezvyšovaly se snižovánímledvinafunkce, jakmile pacient měl achronickýledvinachorobas eGFR<60 ml/min="" per="" 1.73="" m2.="" however,="" we="" observed="" an="" increase="" of="" carbamylated="" sortilin="" residues="" with="" decreased="">ledvinafunkce. Podobně Kalim a kol. neuvádějí žádnou souvislost mezi celkovými a karbamylovanými hladinami albuminu vchronickýledvinachorobapacientů.41 Karbamylace Sortilinu, vyplývající z narušeníledvinafunkce, může dále zvýšit vaskulární kalcifikaci související schronickýledvinachoroba- přidružené minerální poruchy. Naše studie má několik silných stránek a omezení. Mezi silné stránky patří analýza dat získaných in vitro, ex vivo a u pacientů pomocí různých experimentálních přístupů. Pečlivá charakterizace pacientů schronickýledvinachoroba, včetně standardizovaných dotazníků k posouzení charakteristik účastníků, osobních studijních návštěv prováděných vyškolenými studijními sestrami a měření mnoha laboratorních hodnot a kalcifikace, je zvláštní předností studie. Zdá se, že malá kohorta omezuje naši studii; my jsme však použili nezávisléchronickýledvinachorobakohorty s následnými údaji pro kalcifikaci pro ověření stavu karbamylace sortilinu pracnou cílenou RS. Klinické nálezy byly provedeny v němčiněchronickýledvinachorobapacientů a může tak omezit zobecnitelnost nálezů na jiné země nebo etnika. A konečně, ačkoli design studie umožňoval úpravu pro mnoho důležitých matoucích faktorů, zbytkové matoucí účinky, jako v jakékoli observační studii, nelze zcela vyloučit.

cistanche

Účinky cistanche: prevence selhání ledvin

Závěr

Závěrem lze říci, že se jedná o první studii demonstrující specifické aminokyseliny, které jsou posttranslačně modifikovány v cirkulujícím sortilinu. Naše údaje naznačují, že přítomnostchronickýledvinachorobapodporuje karbamylaci cirkulujícího sortilinu a že karbamylovaný sortilin vykazuje prokalcifikační vlastnosti, jak bylo prokázáno in vitro, ex vivo a přítomností v kalcifikované tkáni. Karbamylace Sortilinu byla spojena s CAC, a to i po úpravě podle věku,ledvinafunkce a několik dalších rizikových faktorů, což naznačuje, že prevence karbamylace sortilinu může snížit riziko vznikukardiovaskulárníkalcifikace a tímkardiovaskulárníkomplikace u pacientů schronickýledvinachoroba. Naše výsledky tedy poukazují na karbamylovaný sortilin jako na přispěvatele kkardiovaskulárníchorobná zátěž vchronickýledvinachorobapacientů.

cistanche