Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Kliknutím sem získáte informace o části II (Úvod, materiály a metody) tohoto článku.

Jak čínské léky, které tonizují ledviny, inhibují apoptózu dopaminergního neuronu?

Shaogang Lin,1 Shuifen Ye,2 Jinmu Huang,1 Yun Tian,3 Yihui Xu,2 Mengqi Wu,2 Jingxia Wang,2 Songying Wu,4 a Jing Cai, MD, Ph.D.2

Abstraktní

Wistar potkani byli intragastricky perfuzováni čínskými léky používanými k tonizaciledvina. Ty zahrnovaly 0,180 g/ml Herba Epimedii (Epimedium), Semen Cuscutae (Dodder Seed) nebo Herba Cistanches (Desertliving Cistanche), 0,04 mg/ml inhibitoru monoaminooxidázy-B selegilinu nebo destilované vody po dobu 14 po sobě jdoucích dnů k přípravě séra obsahujícího léky nebo slepého séra. Buňky MES23.5 v logaritmické fázi byly kultivovány v médiích doplněných 15% sérem obsahujícím léčivo po dobu 24 hodin, po níž následovala inkubace v kultivačním roztoku obsahujícím 100 μmol/l H2O2 po dobu 3 hodin. Výsledky 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromidu (MTT) a průtokové tonometrie ukázaly, že všechna séra obsahující léčiva zlepšila míru přežití buněk MES23.5 poškozených H2O2, inhibovala expresi pro-apoptotické FasL a kaspázy-3, podporovala anti-apoptotickou expresi Bcl-2. Séra obsahující léky však měla malý vliv na expresi Fas v buňkách MES23.5 poškozených H2O2. Výsledky imunosorbentového testu vázaného na enzymy ukázaly, že sérum obsahující Herba Cistanches nebo Herba Epimedii zvýšilo expresi nervového růstového faktoru, neurotrofického faktoru odvozeného od mozku a neurotrofického faktoru odvozeného od gliových buněčných linií v poškozených buňkách MES23.5; Semen Cuscutae obsahující sérum pouze zvýšil expresi neurotrofického faktoru odvozeného od mozku; zatímco exprese výše uvedených neurotrofických faktorů zůstala stejná v buňkách léčených selegilinem obsahujícím sérum. Tato zjištění naznačují, že čínské léky používané k tonizaci ledvin mohou chránit nervové buňky regulací expreseapoptóza-související faktory a neurotrofické faktory v buňkách MES23.5.

Klíčová slova: nervová regenerace, tradiční čínská medicína, sérum obsahující léčiva, MES23.5Dopaminergnínervové buňky, neurotrofické faktory,apoptózaParkinsonova choroba, neuroprotekce

Hlavní body výzkumu

(1) Tato studie sledovala faktory související s apoptózou a neurotrofické faktory, aby odhalila inhibiční účinky čínských léčivých přípravků na tonizaciledvinana apoptóze na molekulární úrovni.

(2) Výsledky ukázaly, že čínské léky pro tonizaciledvinamůže chránit nervové buňky regulací expreseapoptóza-související faktory a neurotrofické faktory.

cistanche k léčbě funkce ledvin

ÚVOD

Parkinsonova choroba je charakterizována degenerací a ztrátouDopaminergníneurony v substantia nigra, oblasti středního mozku, stejně jako tvorba Lewyho těla[1,2]. Ztráta dopaminergních neuronů a Parkinsonova choroba jsou vysoce korelovány s aktivací apoptotické dráhy[3,4]. Pro neuroprotekci byla použita řada cytokinů a neurotrofických faktorů[5,6]. Složené přípravky čínských léků, které mohou tonizovatledvinabylo hlášeno, že významně zlepšují příznaky Parkinsonovy nemoci. Mechanismus účinku však zůstává nejasný[7,8,9]. Již dříve jsme ukázali, že čínské léky, které tonizují ledviny, mohou chránitDopaminergníneuronů regulací expreseapoptóza-související faktory a zvyšující se obsah neurotrofických faktorů na zvířecím modelu Parkinsonovy nemoci[10]. Důkazy z experimentů in vitro však chybí.

Buněčná linie MES23.5 je hybridizována z buněk středního mozku z embrya potkana a buněčné linie gliomu gliomu myšího neuroblastomu N18TG2. Tato buněčná linie má vlastnostiDopaminergníneuronů a je snadnější kultivovat než střední mozek nervové buňky. Proto byly tyto buňky rozsáhle používány pro studium neurodegenerativních onemocnění[11].

Zjistit, zda čínské léky, které tonizujíledvinamůže chránit in vitro kulturyDopaminergníneuronů, vyvolali jsme oxidační poškození v buňkách MES23.5 pomocí H2O2 a ošetřili poškozené buňky sérem obsahující herba epimedii (Epimedium), Semen Cuscutae (Dodder Seed) nebo Herba Cistanches (Desertliving Cistanche). Průtoková cytometrie a enzymově vázaný imunosorbentní test (ELISA) byly použity k detekci expreseapoptóza-související faktory a neurotrofické faktory. Naším cílem bylo prozkoumat neuroprotektivní mechanismus čínských léků, které mohou tonizovatledvinapro prevenci Parkinsonovy nemoci. Jako kontrolní přípravky byly použity inhibitory selegilinu a monoaminooxidázy-B.

VÝSLEDKY

Vliv různých koncentrací H2O2 na růst buněk MES23.5

Výsledky 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromidu (MTT) ukázaly, že míra přežití buněk MES23,5 zůstala po expozici 50, 100, 150, 200, 300 a 400 μmol/l H2O2 po dobu 1 hodiny (P > 0,05), ale významně se snížila po 3 hodinách, s výjimkou buněk vystavených 50 μmol/l H2O2 (P< 0.01).="" moreover,="" there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" survival="" rate="" among="" different="" h2o2="" concentration="" groups,="" except="" 50="" μmol/l="" h2o2,="" at="" each="" time="" point="" (p="">0,05). Míra přežití buněk MES23,5 nebyla snížena až do 24hodinové léčby H2O2 50 μmol/l (P< 0.05).="" thus,="" we="" treated="" mes23.5="" cells="" with="" 100="" μmol/l="" h2o2="" for="" 3="" hours="" (table="">

Tabulka 1 Míra přežití (%) buněk MES23,5 léčených různými koncentracemi H2O2 v průběhu času

Vliv různých koncentrací séra obsahujícího léčivo na růst buněk MES23,5 indukovaných H2O2

Výsledky MTT ukázaly, že v buňkách MES23,5 indukovaných H2O2 nebyla zjištěna žádná změna, která by byla předem ošetřena sérem obsahujícím 5 % (V/V) a 10 % (V/V) po dobu 24 hodin (P > 0,05). Avšak předběžná léčba sérem obsahujícím léčivo 15 % (v/v), 20 % (v/v), 25 % (v/v) a 30 % (v/v) po dobu 24 hodin významně zlepšila míru přežití buněk MES23,5 indukovaných H2O2 (P< 0.05="" or="" p="">< 0.01),="" but="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" among="" the="" concentrations="" (p="">0,05). V následných experimentech bylo tedy použito 15 % (v/v) séra obsahujícího léčivo (tabulka 2).

Tabulka 2

Míra přežití (%) buněk MES23,5 indukovaných H2O2 po léčbě sérem obsahujícím léčivo v různých koncentracích

Vliv séra obsahujícího léčivo na expresi faktorů souvisejících s apoptózou v buňkách MES23.5 indukovaných H2O2

Průtoková cytometrie ukázala, že obsah FasL a kaspázy-3 se významně zvýšil v modelové skupině ve srovnání se skupinou léčenou slepým sérem; P< 0.05).="" fasl="" and="" caspase-3="" content="" significantly="" reduced="" in="" the="" herba="" epimedii,="" semen="" cuscutae,="" herba="" cistanches="" and="" selegiline="" groups="" when="" compared="" with="" the="" model="" group="" (p="">< 0.05).="" however,="" fasl="" and="" caspase-3="" content="" in="" the="" herba="" epimedii="" group,="" as="" well="" as="" fasl="" content="" in="" the="" herba="" cistanches="" group,="" remained="" higher="" when="" compared="" with="" blank="" serum="" group="" (p="">< 0.05;="" table="">

Tabulka 3

FasL-, Fas-, kaspáza-3- a Bcl-2-pozitivní exprese (%) v buňkách MES23.5 indukovaných H2O2 po léčbě sérem obsahujícím léčivo

Změny v obsahu Bcl-2 v buňkách z každé skupiny byly opačné než hladiny FasL a kaspázy-3. Obsah Bcl-2 byl signifikantně snížen v modelové skupině ve srovnání se skupinou slepých sér (P< 0.05);="" bcl-2="" content="" was="" significantly="" higher="" in="" the="" herba="" epimedii,="" herba="" cistanches,="" and="" selegiline="" groups="" when="" compared="" with="" the="" model="" group="" (p="">< 0.05),="" but="" the="" increase="" in="" bcl-2="" content="" was="" not="" obvious="" in="" the="" semen="" cuscutae="" group="" (table="" 3).="" no="" significant="" difference="" was="" found="" in="" fas="" content="" among="" the="" groups="" (p="">0.05; Tabulka 3).

Vliv séra obsahujícího léčivo na expresi neurotrofických faktorů v buňkách MES23,5 indukovaných H2O2

Výsledky ELISA ukázaly, že obsah nervového růstového faktoru byl významně snížen v modelové a selegilinové skupině ve srovnání s prázdnou sérovou skupinou (P< 0.05).="" however,="" nerve="" growth="" factor="" levels="" were="" greater="" in="" the="" herba="" epimedii,="" semen="" cuscutae,="" and="" herba="" cistanches="" groups="" when="" compared="" with="" the="" model="" group,="" but="" significant="" differences="" were="" only="" found="" between="" the="" herba="" cistanches="" and="" model="" groups="" (p="">< 0.05;="" table="">

Tabulka 4

Nervový růstový faktor (NGF), neurotrofický faktor odvozený od mozku (BDNF) a změny obsahu neurotrofického faktoru odvozeného z gliových buněk (GDNF) v buňkách MES23.5 indukovaných H2O2 po léčbě sérem obsahujícím léčivo po dobu 24 hodin

Obsah neurotrofického faktoru odvozeného z mozku byl významně snížen v modelové a selegilinové skupině ve srovnání se skupinou slepého séra (P< 0.05),="" and="" was="" significantly="" greater="" in="" the="" herba="" epimedii,="" semen="" cuscutae,="" and="" herba="" cistanches="" groups="" when="" compared="" with="" the="" blank="" serum="" group="" (p="">< 0.05;="" table="">

Obsah neurotrofického faktoru odvozeného z gliových buněčných linií byl signifikantně vyšší ve skupině Herba Cistanches ve srovnání se skupinou slepého séra, modelu, Semen Cuscutae a selegilinu (P< 0.05),="" but="" no="" significant="" difference="" were="" found="" between="" the="" herba="" epimedii="" and="" herba="" cistanches="" groups="" (table="">

cistanche pro zlepšení funkce ledvin

DISKUSE

Patologické a nervové biochemické změny u Parkinsonovy nemoci zahrnují předevšímDopaminergníztráta neuronů v substantia nigra-corpus striatum, tvorba eozinofilních Lewyho tělísek a redukce dopaminových vysílačů v corpus striatum[14]. Studie ukázaly, že neuronálníapoptózaje důležitou příčinou výskytu a progrese neurodegenerativních onemocnění, jako je Parkinsonova choroba a Alzheimerova choroba[15,16].

Moderní farmakologické studie se zabývaly tím, že čínské léky Herba Epimedii, Semen Cuscutae a Herba Cistanches, které mohou tonizovatledvina, jsou neuroprotektivní. Herba Epimedii, bylinná rostlina z čeledi Berberidaceae, může chránit nervové buňky před poškozením amyloidem beta-peptidu (25–35) a snížitapoptóza[17]. Semen Cuscutae je sušené zralé semeno dodderu. Může regulovat imunitu, zpomalit stárnutí, snížit produkci volných radikálů, podporovat tvorbu superoxiddismutázy, zvýšit obsah Ca2+ v séru, inhibovat kalciové kanály typu L, kontrolovat příliv vápníku, regulovat osteoporózu a potlačovat nervové buňky.apoptóza[18,19]. Herba Cistanches je chylokaulous šupinatý list v suchých oblastech. Může prodloužit životnost, inhibovat oxidaci a zlepšit obsah centrálních neurotransmiterů[20,21]. Selegilin, inhibitor monoaminooxidázy-B, může také chránit nervové buňky několika cestami, které zahrnují inhibici aktivity monoaminooxidázy-B, snížení endogenní nebo exogennídopamindegradace, udržování koncentrace dopaminu v synaptickém terminálu, snížení monoaminooxidázy-B, podpora aktivity antioxidázy, zpomalení oxidace, snížení tvorby hydroxylových radikálů a ochrana dopaminergních neuronů[22].

Fas, FasL a rodina kaspázy a proteinů Bcl-2 hrají důležitou roli v regulaci buněkapoptóza[23,24]. Předchozí pokusy na zvířatech z naší skupiny ukázaly, že čínské léky, které tonizujíledvinamůže snížit obsah kaspázy-3 a FasL v substantia nigra-corpus striatum myší s Parkinsonovou chorobou[11]. To naznačuje důležitou roli čínských léků, které tonizujíledvinadownregulací apoptotických faktorů k ochraně neuronů u myší s Parkinsonovou chorobou. Tato studie použila kultivované buňky in vitro a vystavila je séru obsahujícímu léky, aby přímo pozorovala účinky čínských léků. Tato metoda navíc minimalizovala interferenci přímé expozice buněk lékům. Výsledky ukázaly, že Herba Epimedii a Herba Cistanches zvýšily expresi Bcl-2 a Herba Epimedii, Semen Cuscutae a Herba Cistanches snížily expresi kaspázy-3 a FasL. To naznačuje, že regulace exprese Bcl-2 a kaspázy-3 Herbou Epimedii a Herbou Cistanches hraje důležitou roli v nervových buňkáchapoptóza.

Neurotrofické faktory jsou typem polypeptidu nebo proteinu uvolňovaného organismy. Studie ukázaly, že nervový růstový faktor, neurotrofický faktor odvozený z mozku a neurotrofický faktor odvozený od gliových buněčných linií mohou nabídnout výživné mikroprostředí pro nervový systém a hrát kritickou roli při udržování normálního vývoje nervového systému, přežití neuronů a regulace nervového systému [25,26,27]. Nervový růstový faktor je zodpovědný hlavně za vývoj, diferenciaci a přežitíDopaminergníneurony, jakož i opravy zraněnýchDopaminergníneurony[28,29]. Neurotrofické faktory odvozené od mozku mohou sloužit jako antioxidant a chránit nervové buňky synergií neurotrofických faktorů odvozených od gliových buněčných linií [30,31]. Neurotrofický faktor odvozený od gliových buněk má specifické trofické účinky na dopaminergní neurony a může vyživovat nervové buňky změnou objemu nervových buněk, délky procesů a ovlivněním specifické produkce bílkovin[32]. Naše předchozí studie ukázala, že čínské léky, které mohou tonizovatledvinamůže upregulovat endogenní obsah nervového růstového faktoru, neurotrofického faktoru odvozeného z mozku a neurotrofického faktoru odvozeného z gliové buněčné linie v substantia nigra-corpus striatum myší s Parkinsonovou chorobou a účinně redukovat nervové buňkyapoptóza[11]. Výsledky této studie ukázaly, že Herba Cistanches zvýšila obsah neurotrofického faktoru odvozeného od nervového růstového faktoru a gliových buněčných linií a že Herba Epimedii, Semen Cuscutae a Herba Cistanches zvýšily obsah neurotrofického faktoru odvozeného od mozku v buňkách MES23.5.

Stručně řečeno, čínské léky používané k tonizaciledvina, jako je Herba Epimedii a Herba Cistanches, mohou chránit nervové buňky regulací expreseapoptóza-související faktory a neurotrofické faktory. Účinek Semen Cuscutae je pomalý a mírný, takže jeho účinky na buňkyapoptózanejsou zřejmé. Sledovali jsme však pouze apoptotické inhibiční účinky těchto léků. Jsou zapotřebí další studie k prozkoumání neuroprotektivních mechanismů těchtoledvinatonizující čínské léky.