Příčina chronického onemocnění ledvin (CKD) - Anémie

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

ČÁST Ⅰ:Proteinurické chronické onemocnění ledvin je spojeno se změněnou životností červených krvinek, deformovatelností a metabolismem

Rosi Bissinger, Travis Nemkov a kol.

Vývojanémieje typickou komplikací pokročilýchchronické onemocnění ledvin(CKD) a je spojena se zhoršenou kvalitou života¹a zvýšené riziko kardiovaskulárních příhod²a hospitalizace,³stejně jako kognitivní úpadek.⁴Závažnostanémiebyla považována za nezávislý prediktor úmrtnosti u dialyzovaného i nedialýzovaného CKD (chronické onemocnění ledvin) pacientů.⁵Patofyziologie onemocnění ledvin souvisejícíanémieje komplexní a zahrnuje nedostatek železa a erytropoetinu (EPO) na pozadí zánětu nízkého stupně, který zase narušuje normální erytropoézu u CKD (chronické onemocnění ledvin) pacientů.⁶V pokročilém CKD (chronické onemocnění ledvin), je odezva EPO neadekvátně nízká ve vztahu ke stupnianémie.^7,8 Vysoká prevalence současného nedostatku železa u CKD (chronické onemocnění ledvin) je důsledkem narušené homeostázy železa.⁹ Opomíjený mechanismus ztráty železa u CKD (chronické onemocnění ledvin) je proteinurie, která může vést ke ztrátám železa vázaného na transferin močí (až 0,3 mg/den), když proteinurie dosáhne nefrotického rozsahu.¹⁰Další faktor, o kterém se předpokládá, že k tomu přispíváanémiev CKD (chronické onemocnění ledvin) patients is the shortened lifespan of red blood cells (RBCs), first described >před 60 lety.^6,11,12

Přínos Cistanche: léčba onemocnění ledvin a zlepšení funkce ledvin

Nedávná studie využívající dechový test na oxid uhelnatý prokázala, že délka života červených krvinek se postupně zkracuje ze 120 dnů u pacientů s CKD 1.chronické onemocnění ledvin) až 60 dnů u pacientů s CKD stadia 5 (chronické onemocnění ledvin).¹³ Zejména transfuze alogenních červených krvinek od zdravých dárců do CKD (chronické onemocnění ledvin) po pacientech následovala rychlá clearance erytrocytů podaných transfuzí bez známek hemolýzy.¹²Pravděpodobným mechanismem pro toto pozorování může být stimulace buněčné smrti podobné apoptóze v bezjaderných červených krvinkách, což označuje vzorec poškození, při kterém není narušena integrita buněčné membrány a cytoplazmatický obsah zůstává nedotčen.¹⁴Červené krvinky podstupující buněčnou smrt vykazují různé morfologické změny vyplývající z poškození cytoskeletu, jako je tvorba povrchových váčků, ztráta elasticity membrány a/nebo buněčná dehydratace.¹⁵Na molekulární úrovni je smrt červených krvinek spojena s intracelulární akumulací Ca2+, změněným stavem buněčné energie a rozpadem fosfolipidové asymetrie, což nakonec vede k externalizaci fosfatidylserinu (PS) na vnější plazmatickou membránu.^15,16V důsledku toho makrofágy a specializované dendritické buňky rychle rozpoznávají PS-externalizované RBC, což vede k erytrózové fagocytóze a jejich katabolismu ve slezině a játrech.¹⁷Kvůli matoucí patofyziologiinemoc ledvin– přidruženéanémieu lidí jsou opodstatněné studie na zvířatech, aby přesně určily přispívající mechanismy. Nefropatie vyvolaná doxorubicinem (DIN) u myší 129S1/SvImJ¹⁸a myši s indukovatelným nedostatkem podocinu (Nphs2Dipod)¹⁹jsou 2 modely, které jsou charakterizovány indukcí proteinurie v nefrotickém rozsahu během dnů, progresí k selhání ledvin po 3 týdnech a úmrtím za 6 až 7 týdnů.^19–21Oba myší modely účinně rekapitulují všechna stádia lidského CKD (chronické onemocnění ledvin). V této studii jsme testovali, zda progresivní selhání ledvin u těchto myší s proteinuriínemoc ledvinovlivňuje životnost červených krvinek a přispívá kanémie. Paralelně jsme zkoumali fenotyp červených krvinek v krvi odebrané z CKD (chronické onemocnění ledvin) pacientů s proteinurií nefrotického rozsahu.

CKD (chronické onemocnění ledvin) aanémie: CISTANCHE

METODY

Podrobné informace o materiálech a metodách jsou uvedeny v Doplňkových materiálech a metodách.

Studie myší

Experimenty byly provedeny na 8-týdenních divokých myších 129S1/SvImJ obou pohlaví (Charles River). DIN byla indukována jedinou injekcí doxorubicinu (14,5 mg/g tělesné hmotnosti), jak bylo popsáno dříve.^18,22Ke kontrole myelotoxického účinku doxorubicinu, který nesouvisí s rozvojem nefropatie, byly myši C57BL/6 rezistentní na doxorubicin také podrobeny stejnému léčebnému protokolu.²³ Kromě toho byly podobné experimenty provedeny na 8-týdenních myších s indukovatelnou delecí podocinu (B6-Nphs2tm3.1Antc*Tg [Nphs1-rtTA*3G] 8Jhm*Tg[tetO -cre]1Jaw) nebo myši Nphs2Dipod, které byly léčeny doxycyklinem po dobu 14 dnů.¹⁹Všechny pokusy na zvířatech byly prováděny v souladu s příručkou Národního institutu zdraví pro péči a používání laboratorních zvířat a německým zákonem o dobrých životních podmínkách zvířat se souhlasem místních úřadů (Regierungspräsidium Tübingen, čísla schválení M12/17 a M17/19G ). Experimentální design studií na myších je uveden na doplňkovém obrázku S1.

Pacienti

Pacientská studie byla provedena v souladu s Helsinskou deklarací a byla schválena místní etickou komisí Fakultní nemocnice Tübingen (556/2018BO2). Vzorky krve a moči s lithium-heparinem byly získány od pacientů s proteinurií v nefrotickém rozsahu a zachovanou rychlostí glomerulární filtrace (GFR; stadia 1–2; n ¼ 10) a pacientů se sníženou GFR (CKD (CKD)chronické onemocnění ledvin) etapa 3–5; n ¼ 15) ve Fakultní nemocnici Tübingen. Jako kontrolní skupina byla krev od zdravých dobrovolníků stejného věku a pohlaví (n ¼ 25) poskytnuta krevní bankou Fakultní nemocnice Tübingen. Všechny lidské vzorky byly odebrány po informovaném souhlasu. Klinické charakteristiky pacientů jsou uvedeny vStůl 1.

Tabulka 1|Charakteristika pacientů s CKD (chronické onemocnění ledvin) a zdravých dárců krve

Analýzy průtokovou cytometrií

Různé parametry smrti RBC buněk byly stanoveny pomocí jiné cytometrie.¹⁴ Pro stanovení životnosti červených krvinek in vivo bylo do retroorbitalu injikováno 25 ml 5,6-karboxyfluorescein diacetát sukcinimidylesteru [5(6)-CFDA, SE] barviva v koncentraci 9,96 mM (rozpuštěné v dimethylsulfoxidu). plexus myší divokého typu s injekcí 129S1/SvImJ a doxorubicinem, jak bylo popsáno dříve.24 V uvedených časových bodech byla myším odebrána krev z retroorbitálního plexu a procento 5(6)-CFDA, SEþ buňky byly detekovány další cytometrickou analýzou. Nakonec byla data analyzována pomocí softwaru FlowJo (FlowJo LLC).

Deformovatelnost červených krvinek a osmotická gradientová ektocytometrie

Deformovatelnost červených krvinek byla měřena pomocí laserem asistovaného optického rotačního analyzátoru buněk (LORCA Max Sis; RR Mechatronics), který byl podrobně popsán jinde.²⁵Analýzy osmotického gradientu ektacytometrie (cosmos can) byly také provedeny pomocí LORCA Max Sis a měřily se deformovatelnost za různých osmotických podmínek.²⁶

Histologické vyšetření

Pro barvení hematoxylinem a eosinem byly sleziny a stehenní kosti obarveny hematoxylinem a eosinem. Všechna sklíčka byla obarvena primární protilátkou Ter119 (BD Pharmingen; ředění 1:500). Pro barvení kyselinou jodistou – Schiff, 2 5-mm silné plátkyledvinybyly obarveny kyselinou jodistou – Schiffovým činidlem (Carl Roth) a hematoxylinem (Abcam). Barvení May-Grünwald-Giemsa (Pappenheimova metoda) bylo provedeno pro stanovení změn tvaru RBC, jak bylo popsáno dříve.²⁷ Izolace glomerulů byla provedena pomocí biotinylačního přístupu a buněčného třídění.¹⁹Pro proteinovou detekci podocinu byla aplikována protilátka od Sigma (P0372).¹⁹K barvení jader byl použit Roti-Mount Fluor Care 4,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI; Carl Roth).

Ultra-výkonná kapalinová chromatografie-hmotnostní spektrometrie metabolomika z myších červených krvinek

Analýzy byly provedeny tak, jak bylo dříve publikováno.²⁸Stručně řečeno, analytická platforma využívá systém ultra-vysokoúčinné kapalinové chromatografie Vanquish (Thermo Fisher Scientific) připojený online k hmotnostnímu spektrometru Q Exactive (Thermo Fisher Scientific).

Cistanche léčí onemocnění ledvin způsobené anémií

Statistické analýzy

Data jsou poskytnuta jako aritmetický průměr SEM nebo jako medián s interkvartilním rozsahem (25.–75. percentil), kde n představuje počet použitých zvířat nebo zahrnutých pacientů. Data byla testována na normalitu pomocí Kolmogorov-Smirnovova testu, D'Agostinova testu a Shapiro-Wilkova testu. Odchylky byly analyzovány Bartlettovým testem na stejné odchylky. Tukey nebo Dunn vícenásobný srovnávací posttest, nepárový Studentův t-test nebo Mann-Whitney U test byly provedeny pomocí GraphPad Prism 8 (GraphPad Software). P < 0.05="" s="" 2-="" tailed="" testováním="" bylo="" považováno="" za="" statisticky="" významné.="" další="" grafy="" byly="" vyneseny="" pomocí="" graphpad="" prism="">

VÝSLEDEK

Experimentální proteinurické onemocnění ledvin indukujeanémieu myší Po indukci se u myší 129S1/SvImJ s myší DIN a Nphs2Dipod vyvinula proteinurie nefrotického rozsahu (obrázek 1a a doplňkový obrázek S2C) a progresivní selhání ledvin charakterizované vysokými hladinami močoviny v plazmě od 20. dne dále (obrázek 1b a doplňkový obrázek S2D). Během prvních 10 dnů u myší došlo k nárůstu tělesné hmotnosti s ascitem (obrázek 1c a doplňkový obrázek S2E), což odráží retenci sodíku způsobenou vylučováním serinových proteáz nebo proteinurií.¹⁸Po spontánním zvratu retence sodíku tyto myši neustále hubly. U myší s DIN a u myší Nphs2Dipod odhalily snímky světelné mikroskopie zachycené po 10 dnech typické histomorfologické změny konzistentní s fokální segmentální glomerulární sklerózou (obrázek 1d a doplňkový obrázek S2B). Ty chyběly u myší C57BL/6 s injekcí doxorubicinu (obrázek 1d). Léčba doxorubicinem vyvolala silný pokles hemoglobinu, počtu červených krvinek a hematokritu (obrázek 1e–g) od 10. dne u myší 129S1/SvImJ a C57BL/6, které byly normalizovány ve dnech 20 a 30. 20. a 30. den se u myší s injekcí doxorubicinu 129S1/SvImJ a u myší s deficitem podocinu vyvinul progresivní vývojanémie, vyznačující se sníženým středním korpuskulárním objemem (obrázek 1h) a sníženým hemoglobinem (doplňkový obrázek S2F), což naznačuje, žeanémieje spojena s progresivním selháním ledvin a nikoli s léčbou doxorubicinem per see.

Obrázek 1|Funkce ledvin a zjevná anémie u myší 129S1/SvImJ s injekcí doxorubicinu.(a–d) U myší 129S1/SvImJ s injekcí doxorubicinu se rozvinula (a) vysoká proteinurie, (b) progresivní zvýšení koncentrace močoviny v plazmě, (c) přechodné zvýšení tělesné hmotnosti a (d) typické histomorfologické změny indikující fokální segmentální glomerulární sklerózu v den 10 (kyselina jodistá-Schiffovo barvení; sloupec ¼ 10 mm). (e–h) Navíc se tyto myši vyvinulyanémieodráží (e) snížená hladina hemoglobinu, (f) nižší počet červených krvinek (RBC), (g) snížená hladina hematokritu a (h) snížený střední korpuskulární objem. (a–d) Myši C57BL/6 s injekcí doxorubicinu nevykazovaly žádné známky poškození ledvin a (e–g)anémiev den 10 byl normalizován ve dnech 20 a 30. Jsou zobrazeny aritmetické průměry SEM. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="">< 0.001,and="" ****p="" <="" 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" between="" healthy="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" #p=""><0.05, ##p="" <="" 0.01,="" ###p="" <="" 0.001,="" and="" ####p="" <="" 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" to="" the="" baseline="" of="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" and="" §p="" <="" 0.05,="" §§p="" <="" 0.01,="" §§§p="" <="" 0.001,="" and="" §§§§p="" <="" 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" between="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" c57bl/6="" mice.="" crea,="">

Anémie u experimentálního proteinurického onemocnění ledvin není způsobena narušenou erytropoézou

Oba modely anemických myší vykazovaly významné zvýšení procenta cirkulujících retikulocytů (obrázek 2a a doplňkový obrázek S3C). Koncentrace EPO v plazmě byly dramaticky zvýšeny v den 10 u 129S1/SvImJ u myší DIN a zdravých C57BL/6, ale byly opět normalizovány ve dnech 20 a 30 (obrázek 2b). U myší s deficitem podocinu se plazmatické koncentrace EPO zvýšily v den 10 a zůstaly zvýšené ve dnech 20 a 30 (doplňkový obrázek S2H). V histologických analýzách z kostní dřeně a sleziny byl počet erytroidních prekurzorových buněk ve srovnání s myeloidními prekurzory zvýšen 30. den (obrázek 2d–g), což ukazuje na stimulovanou erytropoézu u anemických myší 129S1/SvImJ s DIN.

Obrázek 2|Erytropoéza je stimulována u myší 129S1/SvImJ s anémií s injekcí doxorubicinu. (a) Anémieu myší 129S1/SvImJ s injekcí doxorubicinu došlo navzdory zvýšenému počtu retikulocytů ve dnech 2{{30}} a 30. (b) Plazmatická koncentrace erytropoetinu byla vysoce zvýšená v den 10 u myší 129S1/SvImJ a C57BL/6 s injekcí doxorubicinu, ale byla opět normalizována ve dnech 20 a 30. (c–e) Kvantifikace absolutního počtu (c) myeloidních a (d) erytroidních buněk v kostní dřeni. (e) poměr myeloidních a erytroidních buněk u zdravých a doxorubicinem injikovaných 129S1/SvImJ myší v kostní dřeni ukázal vyšší počet erytroidních prekurzorových buněk u doxorubicinem injikovaných 129S1/SvImJ myší v den 3{{5{{52} }}}}. (f,g) Histologie (f) sleziny a (g) kostní dřeně ukázala nárůst erytroidních prekurzorových buněk, pozorovaný i při nižším zvětšení, u myší 129S1/SvImJ s injekcí doxorubicinu (pravé panely) ve srovnání se zdravými myšmi (levé panely ) v den 30. (f,g) Imunohistochemie Ter119 (spodní panely) podpořila nálezy hematoxylinu a eosinu (H&E). Ter119 je pozitivní v erytroidních prekurzorech (buňky s jádry) a v červených krvinkách (buňky bez jádra). Tyč ¼ 100 mm; vložky ¼ 25 mm. Jsou zobrazeny aritmetické průměry SEM. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01="" a="" ***p="">< 0,001="" indikují="" významný="" rozdíl="" mezi="" zdravými="" myšmi="" 129s1/svimj="" a="" myšmi="" 129s1/svimj="" s="" injekcí="" doxorubicinu;="" ##p="">< 0,01="" a="" ####p="">< 0,0001="" indikují="" významný="" rozdíl="" oproti="" výchozí="" hodnotě="" u="" myší="" 129s1/svimj="" s="" injekcí="" doxorubicinu;="" a="" §p="">< 0,05,="" §§p="">< 0,01="" a="" §§§§p="">< 0,0001="" ukazují="" významný="" rozdíl="" mezi="" myšmi="" c57bl/6="" s="" injekcí="" doxorubicinu="" a="" 129s1/svimj="" a="">

Prospěch zCistanche: léčba onemocnění ledvin a zlepšení funkce ledvin

Snížená životnost červených krvinek je primární příčinou anémie u experimentálního proteinurického onemocnění ledvin

Externalizace PS na zevním letáku plazmatické membrány RBC je indikátorem buněčné smrti a promotorem erytro fagocytózy.¹⁴Smrt buněk RBC byla kvantifikována pomocí fluorescenčně aktivovaných analýz buněčného třídění fluorescenčního povrchového PS vázaného na annexin V.¹⁴ In freshly drawn blood, the percentage of PS-exposing cells was >{{0}}násobně vyšší 2. den0 u myší s DIN (4,16 procenta a 0.86 procent) ve srovnání se zdravými myšmi (1).{{7} }} procenta & 0.11 procent ) (obrázek 3a). Podobně myši Nphs2Dipod vykazovaly přibližné 2-násobné zvýšení expozice PS (1,27 procenta a 0,20 procenta) ve srovnání se zdravými myšmi (0,58 procenta a 0,05 procenta) v den 30 (doplňkový obrázek S3A). Je známo, že erytrocyty jsou eliminovány z oběhu makrofágy sídlícími ve slezině.17 Toto pozorování proto může vysvětlit vyšší poměr sleziny/tělesné hmotnosti u myší Nphs2Dipod (doplňkový obrázek S2G), kde je degradováno dvakrát více RBC ve srovnání se zdravými C57BL/6 myši. Protože proteinurie nefrotického rozsahu vede k dysproteinémii,29 jsme dále zkoumali, zda zvýšená smrt buněk červených krvinek může být stimulována složkou v plazmě myší s DIN. Jak je znázorněno na obrázku 3b, expozice PS ve dnech 10 a 20 byla po inkubaci dvakrát vyšší (30 minut při 37^OC) zdravých červených krvinek v plazmě myší 129S1/SvImJ s injekcí doxorubicinu ve srovnání s inkubací v plazmě zdravých myší. Příliv Ca2+ do červených krvinek, zprostředkovaný napěťově řízenými a na napětí nezávislými neselektivními kationtovými kanály,^30,31je jedním z klíčových regulátorů smrti červených krvinek. V červených krvinkách odebraných ve dnech 20 a 30 od myší 129S1/SvImJ s DIN byly intracelulární koncentrace Ca2+ zvýšeny (obrázek 3c); tento jev byl rekapitulován u myší Nphs2Dipod v den 20 (doplňkový obrázek S3B). V obou myších modelech byla signifikantně negativní korelace procenta PS-pozitivních červených krvinek se závažnostíanémieodráží hladiny hemoglobinu (obrázek 3d a doplňkový obrázek S3D). Kromě toho existovala významná korelace s poškozením ledvin odráženým koncentrací močoviny v plazmě (obrázek 3e a doplňkový obrázek S3E) a v menší míře s proteinurií (obrázek 3f a doplňkový obrázek S3F). Pro kompenzaci ztráty RBC vanémieU obou myší byla stimulována tvorba nových RBC, jak je indikováno zvýšeným procentem cirkulujících retikulocytů, a významně korelovala s velikostí RBC vystavujících PS (obrázek 3g a doplňkový obrázek S3G).

Obrázek 3|U myší s doxorubicinem indukovanou nefropatií se rozvine zvýšená smrt červených krvinek (RBC) zprostředkovaná zvýšenými hladinami intracelulárního vápníku.(a) Externalizace fosfatidylserinu (PS), odrážející smrt RBC, byla zvýšena ve dnech 20 a 30 po indukci doxorubicinem indukované nefropatie. (b) Inkubace zdravých červených krvinek v plazmě odebraných ve dnech 10 a 20 od těchto myší vedla k externalizaci PS. (c) Externalizace PS byla doprovázena zvýšenými hladinami intracelulárního vápníku v červených krvinkách odebraných ve dnech 20 a 3{{30}} po indukci. (d–g) Procento (d) erytrocytů vystavených PS korelovalo s hladinami hemoglobinu, poškozením ledvin indikovaným (e) koncentrací močoviny v plazmě a (f) proteinurií, stejně jako s (g) tvorbou retikulocytů. (d–g) Data zahrnují každý časový bod (0, 10, 20 a 30 dní) každé zdravé myši 129S1/SvImJ a 129S1/SvImJ s nefropatií vyvolanou doxorubicinem. Jsou zobrazeny aritmetické průměry SEM. **P < 0,01,="" ***p="">< 0,001="" a="" ****p="">< 0,0001="" indikují="" významný="" rozdíl="" mezi="" zdravými="" 129s1/svimj="" a="" 129s1/svimj="" myší="" s="" injekcí="" doxorubicinu="" (in.);="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01="" a="" ####p="">< 0,0001="" indikují="" významný="" rozdíl="" od="" výchozí="" hodnoty="" u="" myší="" 129s1/svimj="" s="" injekcí="" doxorubicinu;="" a="" §§§§p="">< 0,0001="" ukazují="" významný="" rozdíl="" mezi="" myší="" c57bl/6="" s="" injekcí="" doxorubicinu="" 129s1/svimj="" a="" myší="" c57bl/6="" s="" injekcí="" doxorubicinu.="" crea,="" kreatinin;="" mfi,="" střední="" intenzita="">

Prospěch zCistanche: léčba onemocnění ledvin a zlepšení funkce ledvin

PRO ČÁST KLIKNĚTE ZDE Ⅱ