Depozice sérového amyloidu P je citlivým a specifickým rysem membránové glomerulopatie s maskovanými usazeninami IgG kappa

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Christopher P. Larsen1, Shree G. Sharma1, Tiffany N. Caza1, Daniel J. Kenan1, Aaron J. Storey2, Ricky D. Edmondson2, Christian Herzog2 a John M. Arthur2

KLÍČOVÁ SLOVA:glomerulonefritida; maskované usazeniny; hmotnostní spektrometrie; membranózní glomerulopatii; subepiteliální ložiska

Cistanche může zlepšit funkci ledvin

Membranózní glomerulopatie s maskovanými depozity kappa IgG (MGMID) je nedávno popsaným obrazem glomerulonefritidy s jedinečnou histopatologií. Vzor je charakterizován subepiteliální a/nebo mezangiálníimunnídepozita, která jsou "maskovaná", k imunoglobulinovému barvení rutinní imunofluorescencí, ale silně se barví na IgG a kappa lehký řetězec po štěpení proteázou. Pacienti s tímto typem glomerulonefritidy jsou nejčastěji mladé ženy s proteinurií a vágní anamnézou autoimunitního onemocnění, jako je nízký titr antinukleárních protilátek. Zde jsme porovnali profil hmotnostní spektrometrie mikrodisekovaných glomerulů laserovým záchytem z devíti renálních biopsií MGMID s osmi biopsiemi vykazujícími jiné vzory membránové glomerulopatie. Protein nejvýrazněji zvýšený v MGMID byl sérový amyloid P. Imunobarvení ukázalo sérový amyloid P kolokalizovaný s IgG v glomerulech MGMID, ale ne s PLA2R asociovanou membranózní glomerulopatií. Sérový amyloid P byl pozitivní v glomerulech všech 32 biopsií MGMID, ale negativní v biopsiích jiných typů membránových glomerulopatií, jako jsou ty spojené s PLA2R a THSD7A. Mezi 173 biopsiemi byly čtyři biopsie s barvením glomerulárního sérového amyloidu P, které nesplňovaly kritéria pro MGMID nebo amyloidózu. Všechny čtyři tyto biopsie s pozitivním barvením sérovým amyloidem P měly membránový vzor glomerulopatie s IgG kappa depozity, které se lišily od MGMID pouze absencí "maskování". Pozitivní barvení v glomerulárních depozitech na amyloid v séru Pidentifikuje jedinečnou formu glomerulonefritidy, která pravděpodobně sdílí společný patofyziologický mechanismus onemocnění.

Membranózní glomerulopatie s maskovanými depozity IgG kappa (MGMID) je histopatologický obraz glomerulonefritidy popsaný v roce 2014, což byl první popis toho, co bylo nazváno maskovaná glomerulární depozita.1 Charakteristická histopatologie tohoto onemocnění zahrnuje přítomnost mezangiálních a subepiteliálních usazeniny s omezením IgG kappa. Zajímavé je, že ačkoli barvení komplementové složky 3 (C3) je často evidentní rutinní imunofluorescencí na zmrazené tkáni, barvení Ig často maskuje, což znamená, že ukazuje falešně negativní barvení rutinní imunofluorescencí, ale pozitivní barvení, když se opakuje na tkáni zalité v parafínu po štěpení proteázou. Pokud tedy patolog nebude udržovat vysoký index podezření na tuto entitu, může být chybně diagnostikována jako glomerulopatie C3. Další entity, které byly popsány, aby ukázaly tento maskovací fenomén u glomerulárních depozit, zahrnují membranoproliferativní glomerulonefritidu s maskovanými monotypickými Ig depozity a kryoglobulinemickou glomerulonefritidu.2,3

Pacienti, u kterých byla biopsií zjištěna MGMID, jsou nejčastěji mladé ženy<40 years="" of="" age,="" and="" many="" have="" positive=""> serologic study results such as antinuclear antibodies, although few carry a diagnosis of any well-defined autoimmune disease such as lupus.4 Mean proteinuria in a recent case series of 41 patients was 3.5 g/24 h, and mean serum creatinine was found to be 1.4 mg/dl.4 The deposits of all reported cases that could be tested for IgG subclass were of the IgG1 kappa subclass. Despite this monotypic staining on biopsy, the vast majority of patients tested (>95 procent) bylo negativních na monoklonální Ig elektroforézou sérových proteinů a nebyly pozorovány žádné případy v souvislosti se základní hematologickou malignitou.4

Byla vyslovena hypotéza, že sdílené klinicko-patologické nálezy mezi pacienty s MGMID by mohly naznačovat společný molekulárně patofyziologický mechanismus, který řídí jejich onemocnění. Naším záměrem při prvním hlášení této entity bylo definovat kohortu pro další analýzu.1 Popisujeme zde přítomnost proteinového sérového amyloidu p komponenty (SAP), který se jedinečně nachází v depozitech glomerulů MGMID. Imunobarvení na SAP v glomerulárních depozitech je citlivá a specifická technika pro diagnostiku MGMID, která také poskytuje patogenní pohled.

Obrázek 1|Sérový amyloidní P–komponent (SAP) je významně obohacen v mikrodisekovaných glomerulech pacientů s membranózní glomerulopatií s maskovanými depozity kappa IgG. Pro statistickou analýzu byly použity normalizované absolutní kvantifikační hodnoty založené na intenzitě z MaxQuant (Max Planck Institute of Biochemistry, Planegg, Německo). Přerušované čáry znázorňují heuristické mezní hodnoty pro změnu skládání a P-hodnotu. (a) Graf sopky porovnávající 3 membránové případy s pozitivním receptorem fosfolipázy A2 (PLA2R) s jinými identifikuje 2 proteiny, které jsou zřetelnými odlehlými hodnotami v pravém horním kvadrantu. (b) Graf sopky porovnávající 2 trombospondinové domény typu 1 obsahující 7A (THSD7A) – pozitivní membránové případy s jinými identifikuje 2 proteiny, které jsou zřetelně odlehlé, přičemž THSD7A vykazuje největší násobnou změnu. (c) Graf sopky porovnávající vzorky glomerulopatie podobné membráně s maskovanými depozity kappa IgG se všemi ostatními typy membránových případů identifikuje 6 proteinů, které jsou zřetelnými odlehlými hodnotami v pravém horním kvadrantu. C6, složka komplementu 6; C7, složka doplňku 7; CFHR1, protein 1 související s komplementovým faktorem H; HP1BP3, heterochromatinový protein 1 vázající protein 3; HPRT1, hypoxanthin fosforibosyltransferáza 1; IGHG3, Ig těžké konstantní gama 3.

VÝSLEDEK

Hmotnostní spektrometrie laserem zachycených mikrodisekovaných glomerulů

Analýza hmotnostní spektrometrií laserem zachycených mikrodisekovaných glomerulů z 9 případů MGMID byla porovnána s 8 případy membranózní glomerulopatie (MG), včetně 3 případů MG s pozitivním receptorem fosfolipázy A2 (PLA2R), 2 případy trombospondinové domény typu 1 obsahující 7A ( THSD7A) – pozitivní MG a 3 případy lupus MG. V této analýze bylo identifikováno celkem 1695 proteinů. Byla provedena analýza principu, aby se otestovalo, zda proteiny podílející se na patogenezi onemocnění MG lze detekovat hmotnostní spektrometrií. Pro každý známý membránový typ byla porovnána rozdílná hojnost proteinů se zbývajícími skupinami pomocí hodnot normalizované absolutní kvantifikace na základě intenzity (iBAQ). Statistická analýza byla provedena pomocí Welchova t-testu a výsledky byly vizualizovány na sopečném grafu. PLA2R byl významně hojnější v případech MG spojené s PLA2R a vykazoval nejsilnější násobnou změnu (obrázek 1a). THSD7A vykazoval nejsilnější násobné změny v MG spojeném s THSD7A, i když s větší P-hodnotou kvůli nízké velikosti vzorku v této skupině (n ¼ 2; obrázek 1b). Celkově tato analýza principu prokázala, že hmotnostní spektrometrie laserem zachycených mikrodisekovaných glomerulů může identifikovat proteiny významné pro patogenezi onemocnění u membranózní glomerulopatie.

Dále jsme se pomocí tohoto přístupu snažili identifikovat proteiny potenciálně zapojené do patogeneze MGMID. Celkem 6 proteinů bylo významně hojnějších ve vzorcích MGMID ve srovnání s ostatními skupinami (tabulka 1). Protein s nejvyšší násobnou změnou byl SAP (obrázek 1c). Zbývající proteiny sestávaly z IgG Kappa, 3 komplementových proteinů a heterochromatinového proteinu 1-vazebného proteinu 3 (HP1BP3). SAP byl považován za nejlepšího kandidáta, protože byl detekován ve všech vzorcích MGMID a vykazoval největší rozdíl v abundanci ve srovnání se vzorky bez MGMID. Všechny Ig identifikované hmotnostní spektrometrií v laserem zachycených mikrodisekovaných glomerulech z případů membránové glomerulopatie s depozity IgG kappa jsou uvedeny v doplňkové tabulce S1. Spektrální počty vzorkováním všech proteinů, které vykazovaly $1 log2 zvýšenou hojnost ve vzorcích MGMID a P-hodnotu #0.1, jsou uvedeny v doplňkové tabulce S2.

Cistanchemůže zlepšitledvinafunkce

Barvení SAP v případech membranózní glomerulopatie

Polyklonální králičí protilátka proti proteinu SAP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) vykazovala silné pozitivní barvení podél glomerulárních bazálních membrán případů s MGMID, které se konfokální analýzou kolokalizovaly s IgG. SAP nevykazoval kolokalizaci s IgG v glomerulech z MG asociovaného s PLA2R (obrázek 2). Polyklonální králičí protilátka proti HP1BP3 byla testována ve 4 biopsiích pomocí MGMID a vykazovala negativní barvení v glomerulárních depozitech všech 4 případů.

Barvení SAP bylo provedeno celkem na 211ledvinabiopsies glomerulonefritidou (tabulka 2). Celkem 36 případů s depozity imunitního typu se obarvilo pozitivně na SAP. Všechny případy, které se obarvily pozitivně, sdílely určité histopatologické rysy včetně přítomnosti mezangiálních a subepiteliálních depozit s IgG kappa restrikcí a bez endokapilárních nebo membranoproliferativních změn podle světelné mikroskopie. SAP byl ve všech případech negativní, s maskovanými depozity, které nebyly MGMID, včetně 3 případů kryoglobulinemické glomerulonefritidy a 3 případů maskované membranoproliferativní glomerulonefritidy. Negativní byla také ve všech 19 případech proliferativní glomerulonefritidy s monoklonálními Ig depozity (PGNMID), včetně případů s IgG1 kappa (4 případy), IgG2 lambda (1 případ), IgG 3 kappa (8 případů) a IgG3 lambda (6 případů ). Všech 30 případů polyklonální membranózní glomerulopatie (PLA2R, THSD7A, lupus a segmentální) bylo negativních na SAP. Další formy glomerulonefritidy byly také studovány a byly negativní. Mezi glomerulonefritidou spojenou s infekcí bylo 7 pozitivních na IgG barvení a 6 mělo důkaz subepiteliálních hrbolků. Jak se očekávalo, všech 6 případů amyloidózy vykazovalo pozitivní barvení v amyloidních depozitech. Rozmazaný vzor ukládání byl však v ostrém kontrastu s granulárním barvením přítomným v případech MGMID. Reprezentativní mikrofotografie glomerulů na barvení SAP z řady různých renálních onemocnění jsou uvedeny na doplňkovém obrázku S1.

Všech 32 případů dříve identifikovaných jako MGMID bylo pozitivních na SAP. Kromě toho bylo pozitivní barvení na SAP v glomerulech u 4 z 25 případů membranózní glomerulopatie s monotypickou depozicí IgG, která nebyla maskována rutinou

imunofluorescence, včetně 4 ze 13 případů s IgG1 kappa, 0 ze 2 případů s IgG1 lambda, 0 z 5 případů s IgG2 kappa, 0 ze 4 případů s IgG3 kappa a {{ 12}} z 1 případu s IgG4 kappa. Celkově bylo 32 z 36 (89 procent) SAP-pozitivní glomerulopatie maskováno a spadalo do kategorie MGMID, zatímco ostatní 4 z 36 (11 procent) byly demaskovány a diagnostikovány jako MG s depozity kappa IgG1. Pacienti s monotypickou membranózní glomerulopatií, která nemaskovala, ale byla pozitivní na SAP, měli průměrný věk 33 let s poměrem žen k mužům 4:0. Případy s monotypickou membranózní glomerulopatií, které nemaskovaly, ale byly negativní na SAP, měly průměrný věk 59,3 let s poměrem žen k mužům 15:4.

Tabulka 1|Proteiny se významně zvýšily v glomerulech pacientů smembranózní glomerulopatiis maskovanými kappa depozity IgG, jak ukazuje hmotnostní spektrometrie

Reaktivita séra na SAP

Séra od 22 pacientů s MGMID, 12 s PLA2R-pozitivní membranózní glomerulopatií a 6 normálních kontrol byla testována na IgG reaktivitu vůči SAP pomocí enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Ačkoli mezi pacienty v každé skupině existovala určitá variabilita, mezi skupinami nebyl žádný významný rozdíl v reaktivitě IgG vůči SAP (doplňkový obrázek S2).

Obrázek 2|Kolokalizace IgG a sérového amyloidu P–komponenty (SAP). (a–c) Imunofluorescenční experimenty provedené na vzorku renální biopsie od pacienta s diagnózou membranózní glomerulopatie s maskovanými depozity kappa IgG ukazují barvení granulární glomerulární bazální membrány na (a) SAP a (b) IgG. (c) Existuje silná kolokalizace SAP a IgG v depozitech glomerulární bazální membrány. (d–f) Imunofluorescenční experimenty provedené na vzorku renální biopsie od pacienta se 3 membránovými glomerulopatiemi pozitivními na fosfolipázy A2 receptoru ukazují (d) negativní barvení glomerulární bazální membrány na SAP a (e) pozitivní barvení granulární glomerulární bazální membrány na IgG. (f) U tohoto pacienta se 3 membranózními glomerulopatiemi spojenými s receptorem A2 fosfolipázy A2 chybí kolokalizace. Chcete-li optimalizovat zobrazení tohoto obrázku, podívejte se na online verzi tohoto článku v tabulce 2|Výsledky barvení sérového amyloidu p komponenty (SAP) v renálních biopsiích

AA, amyloid A; AL, lehký řetězec amyloidu; C3, složka doplňku 3; GBM, glomerulární bazální membrána; MG, membranózní glomerulopatie; MGMID, membranózní glomerulopatie s maskovanými depozity IgG kappa; MPGN, membranoproliferativní; glomerulonefritida; PGMNID, proliferativní glomerulonefritida s monoklonálními depozity IgG kappa; PLA2R, receptor fosfolipázy A2; THSD7A, trombospondin typu 1 obsahující doménu 7A.

DISKUSE

MGMID je nedávno popsaný a jedinečný vzorec glomerulopatie charakterizovaný subepiteliálními a mezangiálními depozity, které se barví na IgG kappa parafinovým IF (obrázek 3). Pacienti s tímto typem glomerulopatie bývají mladé ženy (věk<40 years)="" and="" often="" have="" vague="" autoimmune="" phenomena.="" we="" report="" here="" the="" discovery="" by="" mass="" spectrometry="" of="" increased="" sap="" in="" the="" glomeruli="" of="" these="" patients="" and="" show="" positive="" staining="" for="" this="" protein="" in="" the="" glomerular="" deposits="" of="" 100%="" of="" cases="" diagnosed="" as="" mgmid.="" positive="" staining="" for="" sap="" was="" also="" tested="" in="" a="" wide="" variety="" of="" igmediated="" glomerulonephritis="" types="" and="" found="" to="" be="" present="" in="" 4="" of="" the="" 173="" cases="" tested="" that="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" or="" amyloidosis.="" all="" of="" these="" cases="" that="" stained="" positive="" for="" sap="" but="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" shared="" histopathologic="" fifindings="" with="" mgmid,="" including="" the="" pattern="" of="" immune="" deposition="" and="" igg1="" kappa="" restriction,="" only="" differing="" by="" the="" fact="" that="" they="" did="" not="" mask="" by="" routine="" immunofluorescence.="" additionally,="" these="" patients="" were="" demographically="" similar="" to="" mgmid="" patients="" in="" that="" they="" tended="" to="" be="" young="">

SAP je 25-kDa pentamerní protein v rámci rodiny pentraxinů, který je kódován genem APCS a je hojně zastoupen v séru a jako součást glomerulární bazální membrány.5 Ačkoli přesná funkce SAP není jasná, je známo interagovat v plazmě s širokou škálou proteinů, včetně složek komplementu, apolipoproteinů a regulátorů koagulace a proteolýzy.6 Tvoří stabilní interakce závislé na vápníku se svými ligandy, včetně proteinů, lipoproteinů a DNA, a chrání je před degradací. SAP slouží jako rozpustná molekula rozpoznávající vzory, která se účastní vrozené imunitní odpovědi, rozpoznává různé molekulární vzorce spojené s patogeny a poškozením, včetně mikrobiálních složek a apoptotických buněčných zbytků.7 Interakce SAP s molekulárními patogeny nebo poškozením vzory podporují komplementem zprostředkovanou clearance apoptotických buněčných úlomků přímou vazbou na komplementovou složku 1q (C1q) a aktivací klasické komplementové dráhy. Navzdory aktivaci komplementu je známo, že SAP uděluje imunoregulaci a snižuje neutrofilní aktivituzánětv tkáních prostřednictvím snížené endoteliální adheze,8 snížené funkce elastázy9 a sníženého navádění do tkání.10 Je také známo, že SAP je hlavním vazebným proteinem pro DNA a chromatin v plazmě.11

U onemocnění je SAP nejlépe známý tím, že je součástí ložisek amyloidózy. I když je to méně dobře prozkoumáno, existují také důkazy, že by mohl hrát roli v lidských a zvířecích modelech autoimunitních onemocnění. Protilátky SAP byly identifikovány u pacientů sautoimunitnínemocía bylo prokázáno, že snížená exprese SAP podporujeautoimunitav myších modelech. Protilátky proti SAP jsou identifikovány u 44 procent pacientů se systémovým lupus erythematodes, přičemž titry protilátek korelují s aktivitou onemocnění.12 Bylo zjištěno, že nedostatek SAP vede k rozvoji spontánní autoimunity u autoimunitně náchylných myší C57BL/6 au neautoimunitních myší. náchylné myši 129/Sv při křížení s myšmi C57BL/6 (129/Sv x C57BL/6 F2)13, ale ne u samotného kmene 129/Sv, což naznačuje, že pro deficit SAP k vyvolání autoimunity může být nutná základní genetická náchylnost.14 myši vykazují produkci antinukleárních protilátek, protilátek proti jednovláknové DNA, protilátek proti dvouvláknové DNA a revmatoidních faktorů. Vyvíjejí se proliferativníimunníkomplexně zprostředkovaná glomerulonefritida, častěji u žen.13 U myšího modelu lupusové nefritidy, kde je glomerulonefritida indukována injekcí aktivované vlastní DNA v séru, snížila genová terapie SAP plazmidovým vektorem produkci protilátek proti dvouvláknové DNA , ukládání imunitního komplexu a zánět ledvin a předcházelo vzniku lupusové nefritidy.15

Obrázek 3|Nálezy renální biopsie u membranózní glomerulopatie s maskovanými depozity IgG kappa. Zde jsou uvedeny mikrofotografie z biopsie zobrazené na obrázku 2. (a) Segmentové hroty jsou přítomny podél glomerulárních bazálních membrán podle Jonesova stříbra s methenaminem (původní zvětšení × 400). (b) Elektronová mikroskopie odhalí subepiteliální depozita přítomná podél glomerulární bazální membrány (původní zvětšení × 12, 000). (c) Glomeruli barvení negativní na IgG rutinní imunofluorescencí na čerstvé tkáni (přímá imunofluorescence; původní zvětšení × 400). (d) Glomeruli ze stejného případu se pozitivně barví na tkáni zalité v parafínu po štěpení proteázou (přímá imunofluorescence; původní zvětšení × 400). (e) Glomeruli vykazují barvení na kappa a (f) ne lambda na proteázou natrávené tkáni zalité v parafínu (přímá imunofluorescence; původní zvětšení × 400). Chcete-li optimalizovat zobrazení tohoto obrázku, podívejte se na online verzi tohoto článku na adrese www.ledvina-international.org.

Navzdory omezení lehkého řetězce pozorovanému při biopsii v současné době neexistuje žádný důkaz o tom, že by tato entita byla spojena se základními lymfoproliferativními poruchami nebo cirkulujícími monoklonálními Ig. čas. Úloha autoprotilátek SAP je také nejistá. Na rozdíl od jiných forem membranózní glomerulopatie s proteinem specificky přítomným v imunitních depozitech, jako je onemocnění spojené s PLA2R,16 se nezdá, že by MGMID byl řízen autoprotilátkami namířenými proti SAP, protože se nám nepodařilo detekovat reaktivitu sérových protilátek proti SAP u pacientů s MGMID . Alternativní vysvětlení je, že IgG kappa je přítomen spíše jako výsledek normální interakce mezi těmito 2 proteiny než autoimunitní interakce antigen-protilátka, protože je známo, že Ig kappa řetězec je součástí normálního interaktomu sérového SAP.6 Proto i když je užitečné pro tkáňovou diagnostiku této entity, testování na protilátky SAP v séru v současné době neslouží jako neinvazivní diagnostika a základní příčina tohoto onemocnění zůstává záhadou.

Klinické výsledky u MGMID jsou extrémně variabilní, od spontánní remise přes progresi do konečného stadialedvinachorobas recidivou při transplantaci. Retrospektivní analýza neprokázala žádnou souvislost mezi použitou léčbou a klinickým výsledkem.4 Objev podílu SAP na tomto onemocnění má potenciálně důsledky pro terapii. Léčby přímo zacílené na SAP se ukázaly jako časné slibné v léčbě amyloidózy.17,18 Výsledky hmotnostní spektrometrie navíc naznačují, že terapie zaměřené na kaskádu komplementu by mohly být užitečné při léčbě této formy glomerulonefritidy, vzhledem k tomu, že většina proteinů, které byly zvýšeny v glomerulech MGMID souvisí s komplementem. Jsou zapotřebí další studie k identifikaci biomarkerů aktivity pro toto onemocnění, stejně jako terapie.

Důvod maskování imunitních depozit v biopsiích MGMID při rutinní imunofluorescenci zůstává záhadou. Přítomnost SAP v ložiskách přináší nová možná vysvětlení tohoto jevu v případech MGMID. Například je známo, že interakce proteinu SAP jsou silně závislé na Ca2þ6 a mnoho transportních médií a pufrů používaných při zpracování tkáně renální biopsie pro imunofluorescenci neobsahuje Ca2þ. Tato in vitro nepřítomnost Ca2þ by mohla vést k narušení imunitních depozit, takže již nejsou k dispozici pro detekci imunofluorescencí na zmrazené tkáni. Depozita imunitního komplexu by však zůstala dostupná pro detekci ve formalínem fixované tkáni, jako výsledek formalínem indukovaných kovalentních chemických vazeb mezi proteiny ve tkáni.

Poprvé zde popisujeme jedinečnou přítomnost SAP v glomerulárních depozitech MGMID. Navíc ukazujeme, že barveníledvinabiopsiefor SAP identifikuje případy s klinicko-patologickými rysy podobnými těm v MGMID, bez maskování, rutinní imunofluorescencí. Vzhledem k těmto výsledkům se domníváme, že pozitivní barvení v glomerulárních depozitech na SAP identifikuje jedinečnou formu glomerulonefritidy, která sdílí společný patofyziologický mechanismus onemocnění. Až do nedávného popisu MGMID byly tyto případy diagnostikovány do mnoha různých kategorií od glomerulopatie C3 přes glomerulonefritidu spojenou s infekcí až po atypickou membránovou glomerulopatii.1 Rychlý vývoj diagnostických kritérií a naše chápání této formy glomerulonefritidy zdůrazňují sílu hmoty spektrometrie, která poskytuje patofyziologický pohled na imunitně zprostředkovanou glomerulonefritidu.

METODY

Techniky zpracování renální biopsie

Byly použity standardní techniky zpracování renální biopsie, včetně světelné, imunofluorescenční a elektronové mikroskopie.19,20 Všechny vzorky ze světelné mikroskopie byly obarveny hematoxylinem a eosinem, Jonesovým methenaminovým stříbrem, Massonovým trichromem a reagentem kyselina jodistá – Schiff. Všechny přímé imunofluorescenční řezy byly nařezány na 4 mm a reagovaly s flfluoresceinem značenými polyklonálními králičími anti-lidskými protilátkami proti IgG, IgA, IgM, C3, C1q, fibrinogenu a k- a l-lehkým řetězcům (Dako, Carpenteria, CA) po dobu 1 hodiny a opláchněte; bylo aplikováno krycí sklíčko pomocí vodného montážního média. Vybrané případy byly obarveny na polyklonální myší anti-lidské protilátky IgG1, IgG2, IgG3 a IgG4 značené flfluoresceinem (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Parafínová imunofluorescence byla provedena po štěpení proteázou, jak bylo popsáno dříve.2,3 Pro analýzu hmotnostní spektrometrií bylo vybráno celkem 9 biopsií MGMID a 8 srovnávacích kontrolních biopsií s membránovou glomerulopatií jiných typů. Protokol studie byl schválen radou Solutions Institutional Review Board a byl v souladu s principy Helsinské deklarace.

Cistanche umítonizovatledvina

Hmotnostní spektrometrie laserem zachycených mikrodisekovaných glomerulů

Tkáň renální biopsie z tkáně fixované ve formalínu a zalité v parafínu byla nařezána v tloušťce 10 mm na sklíčka s rámem Leica PET-membrána (Leica, Wetzlar, Německo). Tato sklíčka byla poté obarvena hematoxylinem. Glomeruly byly mikrodisekovány do mikrocentrifugačních zkumavek pomocí mikroskopu Leica DM60{{20}}0B. Mikrodisekované glomeruly byly lyžovány ve 2% dodecylsulfátu sodném a 0,1M dithiothreitolu při 99 stupních po dobu 1 hodiny a zpracovány přípravou vzorků za pomoci filtru (FASP).21 Vyčeřený lyzát byl přenesen do koncentrátorů Vivacon 500 (MWCO 30 kDa; Sartorius , Göttingen, Německo). Dodecylsulfát sodný byl odstraněn opakovaným promytím 8M močovinou v 0,1M tris(hydroxymethyl)-aminomethan/CI, pH 8,5; vzorky byly poté alkylovány 0,05 M jodacetamidem. Jodoacetamid byl odstraněn 3 promytími 8 M močovinou/0,1 M tris(hydroxymethyl)-aminomethan/CI, pH 8,5, následovanými 3 promytími 0,05 M hydrogenuhličitanem amonným. Proteiny byly štěpeny trypsinem (stupeň sekvenování, Promega, Madison, WI) v poměru 40:1 w/w při 37 stupních po dobu 16 hodin. Peptidy byly shromážděny centrifugací a odsoleny na špičkách C18-Stage (Thermo Scientific, Waltham, MA).

Štěpené peptidy byly analyzovány tandemovou hmotnostní spektrometrií NanoLC za použití hmotnostního spektrometru Thermo Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Scientific). Peptidy byly naneseny na zachycovací kolonu s reverzní fází (Integra-frit, New Objective, Woburn, MA) obsahující 2,5 mm nabitou povrchovou hybridní pryskyřici Waters XSelect (Waters Corp., Milford, MA) spojenou s 150 mm X 0.075 mm analytická kolona obsahující stejnou pryskyřici s reverzní fází, jaká byla použita v pasti. Ultravýkonný kapalinový chromatografický systém nanoAcquity (Waters Corp.) byl poté použit ke generování 60-minutového gradientu od 98:2 do 60}:40 poměr pufru A:B (pufr A ¼ 0,1 procenta kyseliny mravenčí 0,5 procenta acetonitrilu, pufr B ¼ 0,1 procenta kyseliny mravenčí, 99,9 procenta acetonitrilu).

Peptidy byly eluovány z kolony pomocí integrovaného sprejového hrotu (Picofrit, New Objective) a ionizovány elektrosprejem (2.0 kV) s následnou tandemovou hmotnostní spektrometrií s použitím disociace indukované kolizemi s vyšší energií (HCD). Průzkumné skeny peptidových prekurzorů byly provedeny při rozlišení 240K (při 400 m/z) s cílem 5x105 iontového počtu. Tandemová hmotnostní spektrometrie byla provedena izolací při 1,6 Th s kvadrupólem, fragmentací HCD s normalizovanou srážkovou energií 30 a analýzou hmotnostní spektrometrie rychlého skenování v iontové pasti. Získaná data z tandemové hmotnostní spektrometrie byla prohledána proti nejnovější lidské databázi Uniprot obsahující záznamy Swiss Prot a TREMBLE pomocí

MaxQuant (Max Planck Institute of Biochemistry, Planegg, Německo). Vizualizace dat byla provedena pomocí Scaffold v4.6 (Proteome Software, Portland, OR). Míra falešného objevu byla nastavena na 1 procento pro shodu peptidu se spektrem. Pro kvantifikaci byly použity normalizované hodnoty iBAQ z MaxQuant. Distribuce iBAQ pro každý vzorek byly upraveny jako medián pro kontrolu rozdílů v zatížení. Z datové sady byly odstraněny hodnoty iBAQ rovné nule. Pro testování statistických hypotéz byl pro každý protein proveden 2-vzorkový Welchův t-test s použitím normalizovaných hodnot iBAQ pro 2 skupiny. Pokud byl protein detekován pouze v jedné skupině, byl proveden 1-vzorkový Welchův t-test s použitím nejmenší detekované hodnoty iBAQ jako nulové hypotézy.

Barvení SAP

Řezy fixované ve formalínu zalité v parafínu, řezané na 3 mm, byly deparafinizovány a vyhledávání antigenu bylo provedeno pod úhlem 99 stupňů. Řezy reagovaly s králičí polyklonální anti-SAP polyklonální protilátkou (1:400; ThermoFisher, Waltham, MA) následovanou kozí anti-králičí sekundární konjugovanou rhodaminovou červení X, která byla adsorbována na pevnou fázi, aby se zajistila minimální zkřížená reakce s lidským IgG (1:100; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Každý případ byl testován s pozitivními a negativními kontrolami. Barvivo bylo hodnoceno standardní imunofluorescenční mikroskopií. Bylo posouzeno jako pozitivní, pokud bylo v glomerulech pozitivní zbarvení granulární kapilární smyčky, a negativní, pokud nebyla žádná kapilární smyčka.

barvení v glomerulech. Kolokalizace IgG a SAP v glomerulárních bazálních membránách byla zkoumána konfokální mikroskopií s použitím konfokálního laserového skenovacího mikroskopu Zeiss LSM 880 (Zeiss Microscopy, Jena, Německo). Pro tuto analýzu reagoval polyklonální (konjugovaný s flfluorescein isothiokyanátem) králičí anti-lidský IgG (1:40; Agilent, Santa Clara, CA) s tkání získanou teplem po barvení na SAP, jak je popsáno výše. Negativní kontroly byly provedeny pro zajištění specifity protilátky vynecháním primárních protilátek. Čtyři případy MGMID byly testovány na přítomnost HP1BP3 (1:100; Thermo Fisher, Waltham, MA) imunoperoxidázovým barvením.

Testování sérových protilátek proti SAP

Protein SAP (R & D Systems, Minneapolis, MN; {{0}}SAB-050) byl zředěn na 3 ng/ml v uhličitanově-bikarbonátovém pufru (pH 9,6) a potažen na {{ Immulon H2 destička (Thermo Scientific) přes noc při 4 stupních. Destičky byly promyty x3 pomocí 200 ml promývacího pufru (1× fyziologický roztok pufrovaný fosfátem a 0,05 procenta Tween) a blokovány po dobu 2 hodin blokovacím pufrem (1× fyziologický roztok pufrovaný fosfátem, 0,05 procenta doplnění, 1 procento rybí želatiny). Destičky byly poté 3x promyty 200 ml promývacího pufru. Do každé jamky bylo přidáno dvacet mikrolitrů zředěného séra (1:100 v promývacím pufru) a inkubováno po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Destičky byly 7krát promyty 200 ml promývacího pufru a poté byla přidána detekční protilátka, anti-Human IgG-HRP (Jackson ImmunoResearchLaboratories; 309-035-003). Destičky byly promyty x 7 200 ml promývacího pufru. Dále byly 3,3',5,5'-tetramethylbenzidinperoxidázový substrát a peroxidázový substrát Sol B smíchány v poměru 1:1 a na destičku bylo přidáno 100 ml. Reakce byla zastavena přidáním 100 ml 2M H2SO4, ponechána na stole po dobu 20 minut před odečtením při 450 nm. Pro kontrolu, aby bylo zajištěno, že protein SAP je navázán na destičku, jsme použili králičí anti-SAP (Invitrogen, Carlsbad, CA; PA1-28361) v sériovém ředění a následně anti-králičí IgG-HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories ; 111-035-144). Kontrola vykazovala dobrou korelaci mezi ředěním protilátky a absorbancí, s průměrnou R-kvadrát hodnotou 0,95.

Cistanche pro zlepšeníledvinafunkce

ZVEŘEJNĚNÍ

Všichni autoři deklarovali žádné konkurenční zájmy.

DOPLŇKOVÝ

Doplňkový soubor MATERIÁLU (PDF)

Obrázek S1. Reprezentativní snímky glomerulárního barvení SAP z různých renálních onemocnění.

Obrázek S2. Studie séroreaktivity anti-SAP pomocí enzymatického imunosorbentního testu.

Tabulka S1. Všechny Ig identifikované hmotnostní spektrometrií v laserem zachycených mikrodisekovaných glomerulech z případů membránové glomerulopatie s depozity kappa IgG.

Tabulka S2. Spektrální počty vzorků všech proteinů ukázaly $1 log2 zvýšenou hojnost ve vzorcích MGMID a P-hodnotu # 0.1.

REFERENCE

1. Larsen CP, Ambruzs JM, Bonsib SM, et al. Membranózní glomerulopatie s maskovanými depozity IgG kappa.ledvinyInt. 2014;86: 154–161.

2. Messias NC, Walker PD, Larsen CP. Parafínová imunofluorescence v laboratoři renální patologie: více než záchranná technika. Mod Pathol. 2015;28:854–860.

3. Larsen CP, Messias NC, Walker PD a kol. Membranoproliferativní glomerulonefritida s maskovanými monotypickými depozity imunoglobulinů. Kidney Int. 2015;88:867–873.

4. Larsen CP, Boils CL, Cossey LN a kol. Klinickopatologické znaky glomerulopatie podobné membráně s maskovanými depozity kappa IgG. Kidney Int Rep. 2016;1:299–305.

5. Emsley J, White HE, O'Hara BP a kol. Struktura pentamerní složky amyloidu P lidského séra. Příroda. 1994;367:338–345.

6. Poulsen ET, Pedersen KW, Marzeda AM, a kol. Interaktom sérového amyloidu P komponenty (SAP) v lidské plazmě obsahující fyziologické hladiny vápníku. Biochemie. 2017;56:896–902.

7. Agrawal A, Singh PP, Bottazzi B a kol. Rozpoznávání vzorů pentraxiny. Adv Exp Med Biol. 2009;653:98–116.

8. Bottazzi B, Inforzato A, Messa M, et al. Pentraxiny PTX3 a SAP v přirozené imunitě, regulaci zánětů a remodelaci tkání. J Hepatol. 2016;64:1416–1427.

9. Li JJ, McAdam KP. Složka lidského amyloidu P: inhibitor elastázy. Scand J Immunol. 1984;20:219–226.

10. Cox N, Pilling D, Gomer RH. Sérový amyloid P: systémový regulátor přirozené imunitní odpovědi. J Leukoc Biol. 2014;96:739–743.

11. Kravitz MS, Pitashny M, Shoenfeld Y. Ochranné molekuly – C-reaktivní protein (CRP), sérový amyloid P (SAP), pentraxin3 (PTX3), lektin vázající manózu (MBL) a apolipoprotein A1 (Apo A1), a jejich autoprotilátky: prevalence a klinický význam v autoimunitě. J Clin Immunol. 2005;25:582–591.

12. Zandman-Goddard G, Blank M, Langevitz P, et al. Protilátky proti sérové ​​amyloidní složce P u pacientů se systémovým lupus erythematodes korelují s aktivitou onemocnění. Ann Rheum Dis. 2005;64:1698–1702.

13. Bickerstaff MC, Botto M, Hutchinson WL, et al. Složka sérového amyloidu P řídí degradaci chromatinu a zabraňuje antinukleární autoimunitě. Nat Med. 1999;5:694–697.

14. Gillmore JD, Hutchinson WL, Herbert J, et al. Autoimunita a glomerulonefritida u myší s cílenou delecí genu pro složku sérového amyloidu P: deficit SAP nebo kombinace kmenů? Imunologie. 2004;112:255–264.

15. Zhang W, Wu J, Qiao B, a kol. Zmírnění lupusové nefritidy genovou terapií sérového amyloidu P s různými mechanismy se lišilo v různých fázích onemocnění. PloS One. 2011;6:e22659.

16. Beck LH, Bonegio RG, Lambeau G, a kol. Receptor fosfolipázy A2 typu M jako cílový antigen u idiopatické membranózní nefropatie. N Engl J Med. 2009;361:11–21.

17. Richards DB, Cookson LM, Berges AC a kol. Terapeutická clearance amyloidu protilátkami proti sérové ​​složce amyloidu P. N Engl J Med. 2015;373:1106–1114.

18. Richards DB, Cookson LM, Barton SV a kol. Opakované dávky protilátky proti složce amyloidu P v séru odstraní depozita amyloidu u pacientů se systémovou amyloidózou. Sci Transl Med. 2018;10.

19. Walker PD, Cavallo T, Bonsib SM. Praktické pokyny pro renální biopsii. Mod Pathol. 2004;17:1555–1563.

20. Walker PD. Renální biopsie. Arch Pathol Lab Med. 2009;133:181–188.

21. Wisniewski JR, Zougman A, Nagaraj N, et al. Univerzální metoda přípravy vzorků pro analýzu proteomů. Metody Nat. 2009;6: 359–362.