Estrogenní aktivita glykosidů z Cistanche Deserticola jako adjuvans estrogenových receptorů in vitro

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Hui Song, Wen-Lan Li, Xiang-Ming Sun, Yang Hu, Jing-Xin Ding, Yu-Bin Ji, Jing-Ya Wang

ÚVOD

Cistanche deserticola("Rou Cong Rong" v čínštině), tradiční čínská bylinná medicína, která byla poprvé zaznamenána v ShenNongBenCaoJing, se používá k léčbě nedostatku ledvin, impotence, stařecké zácpy a nedostatku krve po tisíce let.[1] Je distribuován hlavně v pouštních oblastech severozápadní Číny, jako je Gansu a Xinjiang.[2] Moderní farmakologické výzkumy prokázaly, že C. deserticola může podporovat široké léčebné funkce, jako je hormonální regulace, imunomodulační, antioxidační, neuroprotektivní, protizánětlivá a estrogenní aktivita.[3,4] Glykosidy cistanches (GC) byly považovány za jeden z hlavní aktivní složky s různými biologickými účinky.[5,6]

Estrogenové receptory- (ERs-) a ER jsou podtypy ER, které by mohly regulovat fyziologické funkce.[7] Tyto proteiny by mohly regulovat transkripci cílových genů vazbou na asociované regulační sekvence DNA v buněčném jádře. Oba podtypy jsou výrazně exprimovány v kardiovaskulárním a centrálním nervovém systému.[8,9] ER existuje hlavně v mléčné žláze, děloze, vaječnících, kostech, mužských reprodukčních orgánech a prostatě. ER je přítomna hlavně v prostatě, vaječnících a močovém měchýři.[10,11] Navíc existují některé společné fyziologické role pro tyto dva podtypy, jako je vývoj a funkce vaječníků a ochrana kardiovaskulárního systému. [12,13] Předchozí výzkum v naší skupině odhalil estrogenně podobný mechanismus GC metodou metabolomické analýzy.[14] V kontinuální studii jsme analyzovali mechanismus estrogenní aktivity GC na buněčných liniích MCF‑7 souvisejících s ER.

MATERIÁLY A METODY

Nástroje

Inkubátor ECO-170P-230 byl od New Brunswick Scientific (China) Co., Ltd., čtečka mikrodestiček Bio-Rad 680 a elektroforéza byly od Bio-Rad Laboratories, Inc., mikroskop CX21 byl od Olympus Co., Ltd. , gelový zobrazovací systém GIS‑2019 byl od společnosti Tanon Science and Technology Co., Ltd., deska s plochým dnem byla od společnosti Corning Inc., průtoková cytometrie EPICS‑XL byla od společnosti Beckman‑Coulter Inc. a StepOnePlus Real‑Time polymerázová řetězová reakce (PCR) systém byl od Thermo Fisher Scientific.

Chemikálie a činidla

GC byly připraveny v naší laboratoři způsobem uvedeným dříve[14] a čistota GC byla stanovena na 52 procent (akteosid byl použit jako marker ke stanovení GC) ultrafialovou spektrofotometrií. Estradiol (E2) byl zakoupen od Yuanye Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, Čína). Fetální bovinní sérum (FBS) a RPMI-1640 byly od Gibco Co., Ltd., 96jamková destička s plochým dnem byla od Corning Inc. a dimethylsulfoxid (DMSO) a 3-[4,5-dimethyl-2-thiazolyl ]-2,5-difenyltetrazolium bromid (MTT) byly zakoupeny od společnosti Sigma-Aldrich Corporation. Reagencie TRIzol, souprava reverzní transkripce (RT) a souprava TB Green™ RT-PCR byly zakoupeny od TaKaRa Co., Ltd., Dalian, Čína. Anti-ER králičí pAb, anti-ER králičí pAb a ‑aktinové protilátky byly zakoupeny od Wanlei Biotechnology Co., Ltd. Všechny ostatní běžné chemikálie byly zakoupeny od standardních komerčních dodavatelů.

příprava vzorků

Příprava glykosidů zásobního roztoku Cistanches

Extrakt GC byl rozpuštěn v DMSO za vzniku zásobního roztoku o koncentraci 0,1051 g/ml a skladován při 4 stupních. RPMI‑1640 bez fenolové červeně byl použit k naředění zásobního roztoku na různé koncentrace před použitím.

Příprava zásobního roztoku estradiolu

E2 extrakt byl rozpuštěn v DMSO za vzniku zásobního roztoku o koncentraci 0,27 mg/ml a skladován při 4 stupních. RPMI‑1640 bez fenolové červeně byl použit k naředění zásobního roztoku na různé koncentrace před použitím.

Příprava fetálního bovinního séra ošetřeného aktivním uhlím a dextranem

Stovky mililitrů FBS byly smíchány s 250 mg prášku aktivního uhlí a 25 mg dextranu. Po inkubaci po dobu 45 minut při 55 stupních byla směs centrifugována při 4 stupních, 1000 ot./min. po dobu 15 minut. Supernatant byl filtrován pomocí membrány Millipore Express PES, aby se získal dextran ošetřený aktivním uhlím (CDT)-FBS a skladován při -20 stupních.

Buněčná kultura

Buněčné linie lidského karcinomu prsu MCF‑7 byly získány ze sbírky amerických typových kultur (ATCC). Kromě toho byly buňky kultivovány s médiem RPMI-1640 obsahujícím 10 procent FBS a 1 procento penicilin-streptomycinu při 37 stupních ve zvlhčené atmosféře 5 procent CO2. Buňky byly kultivovány v médiu RPMI-1640 bez fenolové červeně obsahujícím 5 procent CDT-FBS 4 dny před testem MTT, aby se estrogen z buněk odstranil.

Analýza buněčné proliferace estradiolu na buněčných liniích MCF{0}}

Buněčná proliferace byla měřena pomocí testu MTT pro buňky MCF-7.[15,16] E2 byl rozpuštěn v kultivačním médiu RPMI-1640 obsahujícím 0,1 procenta DMSO v konečných koncentracích {{27 }}.1, 1, 10, 100 a 1000 nM. Buněčné linie MCF-7 byly kultivovány v médiu RPMI-1640 bez fenolové červeně po dobu 4 dnů. Po trojím promytí fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS) bylo 100 ul média RPMI-1640 bez FBS přidáno do 96jamkových destiček v množství 1,5 × 104 na jamku a inkubováno při 37 stupních po dobu 24 hodin. Následně byly buňky ošetřeny různými koncentracemi roztoku E2 po dobu 72 hodin. Poté bylo do každé jamky přidáno 100 ul roztoku MTT (0,5 mg/ml). Buňky byly inkubovány po dobu 4 hodin. Nakonec bylo přidáno 150 ul DMSO, aby se rozpustily krystaly formazanu. Absorbance byla měřena při 570 nm čtečkou mikrodestiček a byla vypočtena rychlost proliferace (PR).

Analýza buněčné proliferace glykosidů Cistanches na buněčných liniích MCF{0}}

Buněčná proliferace byla měřena pomocí MTT testu pro buňky MCF‑7. GC byly rozpuštěny v kultivačním médiu RPMI‑1640 obsahujícím 0,1 procenta DMSO v konečných koncentracích 0.0175, 0,175, 1,75, 17,5 a 175 µg /ml. Buněčné linie MCF-7 byly kultivovány v médiu RPMI-1640 bez fenolové červeně obsahujícím 5 procent CDT-FBS po dobu 4 dnů. Po trojím promytí PBS bylo 100 ul média RPMI-1640 bez FBS přidáno do 96jamkových destiček v množství 1,5 x 104 na jamku a inkubováno při 37 stupních po dobu 24 hodin. Následně byly buňky ošetřeny různými koncentracemi roztoku GC po dobu 24, 48 a 72 hodin, v daném pořadí. Poté bylo do každé jamky přidáno 100 ul roztoku MTT (0,5 mg/ml). Buňky byly inkubovány po dobu 4 hodin. Nakonec bylo přidáno 150 ul DMSO, aby se rozpustily krystaly formazanu. Absorbance byla měřena při 570 nm čtečkou mikrodestiček a byla vypočtena PR. RPMI‑1640 bez fenolové červeně a médium obsahující E2 (2,725 × 10−3 µg/ml) byly negativní a pozitivní skupiny.

Analýza buněčné proliferace glykosidů Cistanches s fulvestrantem na MCF-7 buněčných liniích

Buněčná proliferace byla měřena pomocí MTT testu pro buňky MCF‑7. GC byly rozpuštěny v kultivačním médiu RPMI‑1640 obsahujícím 0,1 procenta DMSO v konečných koncentracích 1,75, 17,5 a 175 µg/ml. Buněčné linie MCF-7 byly kultivovány v médiu RPMI-1640 bez fenolové červeně obsahujícím 5 procent CDT-FBS po dobu 4 dnů. Po trojím promytí PBS bylo 100 ul média RPMI-1640 bez FBS přidáno do 96jamkových destiček v množství 1,5 x 104 na jamku a inkubováno při 37 stupních po dobu 24 hodin. Následně byly buňky ošetřeny různými koncentracemi roztoku GC a inkubovány s fulvestrantem (6,06 x 10-5 µg/ml) po dobu 48 hodin. Poté bylo do každé jamky přidáno 100 ul roztoku MTT (0,5 mg/ml). Buňky byly inkubovány po dobu 4 hodin. Nakonec bylo přidáno 150 ul DMSO, aby se rozpustily krystaly formazanu. Absorbance byla měřena při 570 nm čtečkou mikrodestiček a byla vypočtena PR. RPMI‑1640 bez fenolové červeně a médium obsahující E2 (2,725 × 10−3 µg/ml) byly negativní a pozitivní skupiny.

Test buněčného cyklu

GC byly rozpuštěny v kultivačním médiu RPMI‑1640 obsahujícím 0,1 procenta DMSO v konečných koncentracích 1,75, 17,5 a 175 µg/ml. Buněčné linie MCF-7 byly kultivovány v médiu RPMI-1640 bez fenolové červeně obsahujícím 5 procent CDT-FBS po dobu 4 dnů. Po trojnásobném promytí PBS byl 1 ml média RPMI-1640 bez FBS přidán do 6-jamkových destiček v množství 2,5 x 105 na jamku a inkubováno při 37 stupních po dobu 24 hodin. Následně byly buňky ošetřeny různými koncentracemi roztoku GC a inkubovány s fulvestrantem (6,06 x 10-5 µg/ml) po dobu 48 hodin. Následně byly buňky shromážděny a třikrát promyty PBS, centrifugovány při 4 stupních, 1000 ot./min po dobu 10 minut a fixovány 70% ethanolem při -20 stupních přes noc. Po dvojnásobném promytí PBS byly buňky obarveny roztokem PI (50 mg/ml) obsahujícím 1 mg/ml RNázy A a 0,1 procenta Triton X-100 po dobu 30 minut ve tmě při 4 stupních. Buněčný cyklus byl detekován pomocí průtokové cytometrie a index proliferace (PI) byl vypočten následovně. RPMI‑1640 bez fenolové červeně a médium obsahující E2 (2,725 × 10−3 µg/ml) byly negativní a pozitivní skupiny. PI=(S plus G2 M)/(G0 /G1 plus S plus G2 M) × 100 procent

Izolace RNA a kvantitativní analýza polymerázové řetězové reakce v reálném čase

K měření hladiny mRNA byl použit test RT-kvantitativní PCR (qPCR). Celková buněčná RNA byla extrahována činidlem TRIzol. Pro qPCR byla RNA reverzně transkribována na cDNA ze 4 ug celkové RNA pomocí RT kitu. Analýzy RT‑PCR byly provedeny pomocí soupravy TB Green™ RT‑PCR Kit. Všechny protokoly byly provedeny podle pokynů výrobce. Pár primerů použitý pro amplifikaci ER byl 5'-GGGAAGTATGGCTATGGAATCTG-3' (dopředný) a 5'-TGGCTGGACACATATAGTCGTT-3' (reverzní); pár primerů použitý pro amplifikaci ER byl 5'-AGTGCCGCTCTTGGAGAGCTG-3' (dopředný) a 5'-CCTGGGTCGCTGTGACCAGA-3' (reverzní). Podmínky PCR pro ER a ER byly 94 stupňů po dobu 3 minut následovaných 37 a 40 cykly, v daném pořadí, 94 stupňů po dobu 30 s, 58 stupňů po dobu 2 minut a 72 stupňů po dobu 2 minut. Pár primerů použitý pro amplifikaci GAPDH byl 5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3' (dopředný) a 5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3' (reverzní). Podmínky PCR pro GAPDH byly 94 stupňů po dobu 3 minut následovaných 30 cykly 94 stupňů po dobu 30 s, 58 stupňů po dobu 2 minut a 72 stupňů po dobu 2 minut. Pokaždé byl experiment RT‑qPCR opakován více než dvakrát. K tomu byl jako vnitřní kontrola použit GAPDH. Relativní genová exprese ER/ER transfektantů ve vztahu ke kontrolním buňkám byla vypočtena: 2−(∆∆Ct).

Western blotting

Exprese ER a ER proteinů byla detekována analýzou western blot jako popsaná metoda s menšími modifikacemi. Stručně řečeno, buňky MCF-7 byly pěstovány v 6-jamkových destičkách při 2,5 × 105 buněk na jamku a ošetřeny GC v konečné koncentraci 1,75, 17,5 a 175 µg/ml po dobu 48 hodin. Po inkubaci byly celobuněčné extrakty připraveny pomocí RIPA pufru obsahujícího 1 mM PMSF. Proteiny v celobuněčných extraktech byly odděleny elektroforézou na 12% dodecylsulfátu sodného-polyakrylamidovém gelu a poté přeneseny na polyvinylidendifluoridové membrány. Membrána byla blokována 5% (w/v) odstředěným mlékem rozpuštěným v TBST pufru a inkubována postupně s primárními a sekundárními protilátkami. Byly pozorovány navázané protilátky.

Statistická analýza

Výsledky byly vyjádřeny jako průměry a standardní odchylky a statistická významnost byla provedena pomocí Studentova t-testu se softwarem SPSS 21.0 (IBM Co., Ltd. America). P<0.05 was="" considered="" statistically="">

VÝSLEDEK

Po 24 hodinách léčby E2 byla proliferace buněk MCF‑7 zjevně zvýšena [obrázek 1a]. 10 nM roztoku E2 by zjevně mohlo stimulovat růst buněk (123,89 procent). Se zvýšením koncentrace E2 však schopnost buněčné proliferace slábla. Optimální koncentrace E2 v tomto experimentu tedy byla 10 nM.

Skupina GC v koncentracích 1,75, 17,5 a 175 µg/mg mohla zvýšit proliferaci buněčných linií MCF-7 způsobem závislým na čase a dávce a vykazovala významný rozdíl oproti negativní skupině [obrázek 1b]. Ve srovnání s negativní skupinou vykazovala skupina E2 zjevnou proliferaci (120,06 procenta).

Kombinovaná medikační skupina (CMG) (fulvestrant s E2 nebo GC) v médiu CDT‑FBS byla inkubována s buňkami MCF‑4. Po 72 hodinách inkubace může CMG vést ke zvýšení PR ve srovnání se skupinou s individuální medikací (IMG) (P < 0.01)="" [obrázek="">

Analýza průtokovou cytometrií ukázala, že GC mohou mírně zvýšit hodnotu PI, což naznačuje, že GC mohou posouvat buňky fáze G{{0}}/G1 do fáze S a G2/M [obrázek 2 a tabulka 1] a podporovat buněčnou DNA syntéza. Výsledek naznačuje, že mechanismus GC na MCF-7 byl podobný mechanismu E2. U CMG (fulvestrant s GC) se hodnota PI buněčného PI mírně snížila na hodnotu IMG (P <>

Analýza RT‑PCR ukázala, že exprese ER a ER mRNA byly zvýšeny ve srovnání s kontrolní skupinou (P < 0,01) v závislosti na dávce po léčbě různými koncentracemi GC po dobu 48 hodin [obrázek 3a a b].

Výsledek Western blot ukazuje, že po léčbě různými koncentracemi GC po dobu 48 hodin se obsah proteinů ER a ER v MCF-7 zvyšuje s GC v závislosti na dávce [obrázek 3c-e]

ZÁVĚR

V tomto výzkumu byl testován vliv GC na proliferaci a buněčný cyklus MCF‑7 metodou MTT a průtokovou cytometrií. GC by mohly zvýšit proliferaci buněk MCF-7 v koncentraci 1,75, 17,5 a 175 µg/ml po inkubaci po dobu 72 hodin. Nárůst má však tendenci se zpomalit, když se CC a fulvestrant užívají společně. GC by mohly zvýšit hodnotu PI buněk MCF‑7, snížit počet buněk ve fázi G1 a zvýšit počet buněk ve fázi S a G2.

Fulvestrant je antagonista specifický pro ER, který blokuje jadernou lokalizaci ER tím, že narušuje dimerizaci receptoru a energeticky závislý jaderný transport.[17] V tomto výzkumu závěr potvrdil, že fulvestrant může oslabit proliferaci GC na buňkách MCF-7 a může ovlivnit transformaci buněčného cyklu. Tato studie tedy ukázala estrogenní aktivitu GC a také ER je cílem GC. V experimentu RT‑PCR a western blot se exprese mRNA a proteinů ER a ER v buňkách MCF‑7 zvyšovala se zvýšením koncentrace GC. GC tedy mohou hrát roli v estrogenní aktivitě podle upregulované mRNA a proteinů ER a ER.