Fenylethanoidové glykosidy Cistanche Tubulosa indukují apoptózu v buňkách hepatocelulárního karcinomu H22 jak vnějšími, tak vnitřními signálními cestami

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Pengfei Yuan, Jinyu Li, Adila Aipire, Yi Yang, Lijie Xia, Xinhui Wang, Yijie Li a Jinyao Li

Abstraktní

Pozadí:Cistanche tubulosa(Schenk) R. Wight je tradiční čínská medicína, která parazituje na kořenech rostliny Tamarix a používala se k léčbě mužské impotence, sterility, tělesné slabosti a jako tonikum. Jeho protinádorový účinek na hepatocelulární karcinom je však stále v nedohlednu. Zde jsme zkoumali protinádorový účinekfenylethanoidové glykosidy C. tubulosa(CTPG) na buňkách hepatocelulárního karcinomu H22 in vitro i in vivo a jeho mechanismy. Metody: Morfologie, životaschopnost, apoptóza, buněčný cyklus a mitochondriální membránový potenciál (Δψm) buněk H22 byly analyzovány inverzní mikroskopií, MTT testem a průtokovou cytometrií. Exprese a aktivace proteinů v dráze apoptózy byly detekovány Western blotem. In vivo protinádorový účinek byl hodnocen na nádorovém myším modelu založeném na samcích Kunming myší. Výsledky: Léčba CTPG významně potlačila růst buněk H22 v závislosti na dávce a čase, což korelovalo se zvýšenou apoptózou a zastavením buněčného cyklu ve fázích G0/G1 a G2/M. Kromě toho byla v buňkách H22 ošetřených CTPG pozorována chromozomální kondenzace. Léčba CTPG významně zvýšila poměr Bax/Bcl{10}}, snížila Δψm a zvýšila uvolňování cytochromu c. Hladiny štěpené kaspázy-8 a kaspázy-9 ve vnějších i vnitřních signálních cestách byly významně zvýšeny, což následně aktivovalo kaspázu{13}} a -3 ke štěpení PARP. Nakonec CTPG (Cistanchetubulosafenylethanoidové glykosidy) inhiboval růst buněk H22 u myší a zlepšil míru přežití nádorových myší. Závěry: Tyto výsledky naznačují, že CTPG potlačuje růst buněk H22 jak vnější, tak vnitřní cestou apoptózy.

Pozadí

Rakovina jater se celosvětově umístila na šestém místě ve výskytu rakoviny a na čtvrtém místě v počtu úmrtí na rakovinu. Navíc se umístil na čtvrtém místě v incidenci rakoviny a na prvním místě v úmrtnosti na rakovinu v zemích s nízkým sociodemografickým indexem [1]. V Číně je rakovina jater třetí hlavní příčinou úmrtí souvisejících s rakovinou v roce 2015 [2]. Více než 90 procent primárních karcinomů jater ve světě tvoří hepatocelulární karcinom (HCC) [3]. V současné době je hlavní možností léčby HCC resekce jater. Méně než 30 procent pacientů s HCC však splnilo kritéria kurativní resekce jater a celkové 5-roční přežití je stále tak nízké, jak 35-50 procento kvůli vysoké míře recidivy [4, 5 ]. Dostupnost léčebných možností pro pacienty se středně pokročilým až pokročilým HCC je velmi omezená. Sorafenib, molekulárně cílený lék, byl schválen FDA jako léčba první volby pro pokročilou HCC. Sorafenib však prodlužuje pouze asi 3 měsíce přežití a míra odpovědi je nižší než 4 procenta [6, 7]. Je naléhavé vyvinout nové léky nebo strategie proti HCC. Tradiční čínská medicína (TCM) samotná nebo v kombinaci s jinými strategiemi byla použita k léčbě HCC a prokázala klinické přínosy včetně prodloužené doby přežití, zlepšení kvality života, snížení nežádoucích reakcí atd. [8, 9].Cistanche, druh TČM, má různé biologické funkce, jako napřantioxidační, protizánětlivé, proti stárnutí,a neuroprotekce [10, 11]. Fenylethanoidové glykosidy byly považovány za hlavní aktivní složkyCistanchekteré mají různé aktivity včetně antioxidační, protizánětlivé, hepatoprotekce a neuroprotekce [12–15]. Naše skupina to oznámilaFenylethanoidové glykosidy Cistanche tubulosa(CTPG) mohl indukovat apoptózu v buňkách melanomu B16-F10 a inhiboval růst nádorů u myší [16]. V této studii jsme měřili protinádorový účinek CTPG na buňky HCC H22 in vitro i in vivo a zkoumali jeho mechanismy. Zjistili jsme, že CTPG indukoval apoptózu v buňkách H22 jak vnějšími, tak vnitřními signálními cestami a potlačoval růst nádorů H22 u myší.

Metody

Buněčná linie

Buňky myšího hepatocelulárního karcinomu H22 byly získány z Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering, Xinjiang University (Urumqi, Xinjiang, Čína) a kultivovány v médiu RPMI 1640 (Gibco) doplněném 100 U/ml penicilinu a 100 ug/ml. streptomycin a 10% tepelně inaktivované fetální bovinní sérum (Gibco) při 37 stupních ve zvlhčené atmosféře 5% CO2.

MTT test

CTPG byl zakoupen od Hetian Dichen Biotech Co., Ltd. (Hetian, Xinjiang, Čína) a hlavní sloučeniny CTPG byly kvalifikovány a kvantifikovány pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie [16]. Životaschopnost buněk byla hodnocena pomocí 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-difenyltetrazolium bromidu (MTT) (Sigma, St. Louis, MO , USA) test. Buňky H22 byly naočkovány do 96-jamkových destiček v hustotě 2 × 104 buňky v 10} ul média na jamku a kultivovány při 37 stupních. Po 24 hodinách byly buňky ošetřeny různými koncentracemi CTPG (0, 100, 200, 300 a 400 ug/ml) nebo 0,3 procenta DMSO (stejné jako u 400 ug/ml CTPG) po dobu 24, 48 a 72 hodin, v daném pořadí. . Po centrifugaci při 1000 otáčkách za minutu po dobu 7 minut byl supernatant odstraněn a do každé jamky bylo přidáno 100 ul roztoku MTT (5 mg/ml v PBS). Destičky byly inkubovány při 37 stupních po dobu 4 hodin a bylo přidáno 100 ul DMSO, aby se rozpustily vytvořené krystaly formazanu. Hodnoty OD490 byly detekovány 96-jamkovou čtečkou mikrotitračních destiček (Bio-Rad Laboratories, CA, USA). Životaschopnost buněk byla vypočtena podle vzorce: Životaschopnost buněk (procenta)=(OD-ošetřené/OD-neošetřené) × 100 procent.

Detekce apoptózy

Buňky H22 byly ošetřeny různými koncentracemi CTPG (0, 100, 200, 300 a 400 ug/ml) nebo 0,3% DMSO po dobu 24 hodin a poté obarveny Annexinem V FITC/ Propidium jodid (PI) Apoptosis Detection Kit (YEASEN, Čína) podle pokynů výrobce. Vzorky byly analyzovány průtokovou cytometrií (BD FACSCalibur, USA).

Detekce mitochondriálního membránového potenciálu

Buňky H22 byly ošetřeny různými koncentracemi CTPG (0, 200 a 400 ug/ml) po dobu 24 hodin a poté barveny barvivem JC-1 propustným pro membránu (Beyotime, Čína) po dobu 20 min při 37 stupních. Po dvojnásobném promytí JC-1 pufrem byly vzorky resuspendovány ve 300 ul JC-1 pufru a analyzovány průtokovou cytometrií (BD FACSCalibur, USA).

Analýza buněčného cyklu

Buňky H22 byly naočkovány do 60 mm kultivačních misek a ošetřeny různými koncentracemi CTPG (0, 100, 200, 300 a 400 ug/ml) nebo 0,3 % DMSO pro 24 hodin Všechny buňky byly shromážděny a dvakrát promyty PBS. Buňky byly fixovány v 70% ledově chladném ethanolu při -20 stupních po dobu 2 hodin a dvakrát promyty PBS, poté resuspendovány ve 300 ul propidium jodid/RNase barvícího pufru (BD Biosciences). Po 10 minutách při teplotě místnosti byly vzorky odebrány průtokovou cytometrií (BD FACSCalibur, USA) a distribuce buněčného cyklu byla analyzována pomocí softwaru ModFit LT 3.0.

Barvení Hoechst 33 258

Morfologické změny buněčných jader H22 byly analyzovány barvením Hoechst 33,258 s membránou propustným DNA-vazebným barvivem. Buňky H22 byly nasazeny na 6-jamkovou destičku v koncentraci 1 x 105 buněk/jamku ve 2 ml média. Po 60% ~ 70% konfluenci byly buňky ošetřeny CTPG (0, 100, 200, 300 a 400 ug/ml) po dobu 24 hodin. Buňky byly shromážděny a fixovány 4% ledově chladným paraformaldehydem při 4 stupních po dobu 10 minut. Po promytí PBS byly buňky obarveny Hoechst 33,258 (Beyotime, Čína) při 4 stupních po dobu 10 minut. Vzorky byly pozorovány inverzním fluorescenčním mikroskopem (Nikon Eclipse Ti-E, Japonsko).

Western blot

Anti-kaspáza-3, kaspáza proti štěpení-3, Anti-Bcl-2 a anti-Bax byly zakoupeny od společnosti Beyotime Biotech Co., Ltd. (Shanghai, Čína). Anti-kaspáza-7, anti-kaspáza-7, anti-kaspáza-8, anti-štěpená-kaspáza-8, anti-kaspáza-9, anti -štěpená kaspáza-9, anti-PARP, anti-štěpená PARP, anti-myší IgG-HRP a anti-králičí IgG-HRP byly zakoupeny od Cell Signaling Technology. Anti- -aktin byl zakoupen od společnosti Beijing ComWin Biotech Co., Ltd. (Peking, Čína).

Buňky H22 byly ošetřeny různými koncentracemi CTPG (0, 100, 200, 300 a 400 ug/ml) nebo 0,3 procenta DMSO po dobu 24 hodin. Buňky byly shromážděny a lyžovány pomocí Cell Lysis Solution RIPA (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) po dobu 30 minut na ledu. Vzorky byly odstředěny (12,000 g po dobu 15 minut při 4 stupních), aby se shromáždily supernatanty a koncentrace proteinů byly měřeny soupravou BCA (Thermo Fisher Scientific, USA). Stejné množství proteinu v každém vzorku bylo izolováno pomocí 12% SDS-PAGE a přeneseno na PVDF membrány (Biosharp, Čína). Po blokování pufrem TBST obsahujícím 5 procent odtučněného mléka byly membrány inkubovány s odpovídajícími primárními protilátkami a sekundárními protilátkami konjugovanými s křenovou peroxidázou (HRP). Po promytí TBST byly cílové proteiny detekovány testovací soupravou ECL (Beyotime, Čína).

Zvířata a etické prohlášení

Samci myší Kunming ve stáří 6-8 týdnů byli zakoupeni od Animal Laboratory Center, Xinjiang Medical University (Urumqi, Xinjiang, Čína). Myši byly chovány ve standardním zařízení pro zvířata s řízenou teplotou a světelným cyklem univerzity Xinjiang. Všechny studie na zvířatech byly provedeny podle pokynů Výboru pro péči o zvířata a použití na univerzitě v Xinjiang. Protokol byl schválen Výborem pro etiku experimentů na zvířatech v Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering (BRGE-AE001), Xinjiang University.

Studie nádorových myší

Pro indukci nádorového myšího modelu bylo samcům Kunming myší subkutánně injikováno 1 x 106 H22 buněk v 10} ul PBS do pravého boku. Po 3 dnech byly myši náhodně rozděleny do 3 skupin (7 myší/skupina). Kontrolní skupině bylo injikováno 0,1 ml DMSO subkutánně kolem nádoru. Skupinám s CTPG-200 a CTPG- 400 bylo subkutánně injikováno 200 nebo 400 mg/kg CTPG v 0,1 ml DMSO kolem nádoru. Myši byly ošetřovány každé 2 dny po dobu až 21 dnů. Velikosti nádorů byly měřeny pomocí posuvného měřítka až do 25 dnů a objem nádoru byl vypočten podle vzorce: objem nádoru (mm3)=(délka × šířka2)/2. Po 25 dnech bylo přežití nádorových myší monitorováno každý den až do konce této studie.

Statistická analýza

Statistická významnost byla vypočtena jednosměrnou analýzou rozptylu mezi léčenými a kontrolními skupinami. Všechna data byla vyjádřena jako průměr ± standardní odchylka (SD). p < 0,05="" bylo="" považováno="" za="" statisticky="">

Výsledek

CTPG snížil životaschopnost buněk H22 in vitro

Aby se prozkoumal protinádorový účinek CTPG na HCC, byly buňky H22 ošetřeny různými koncentracemi CTPG (0, 100, 200, 300 a 400 ug/ml) in vitro. Po 24 hodinách byla pozorována morfologie buněk H22 pomocí inverzního mikroskopu. Zjistili jsme, že morfologie buněk H22 se působením CTPG dramaticky změnila. Se zvyšující se koncentrací CTPG se buňky staly malými a kulatými a počet buněk se také výrazně snížil (obr. 1a). Test MTT byl použit k analýze životaschopnosti buněk H22 po ošetření CTPG po dobu 24, 48 a 72 hodin, v daném pořadí. CTPG významně snížil životaschopnost buněk H22 v závislosti na dávce a času (obr. 1b). CTPG při 300 ug/ml dosáhlo nejlepší inhibiční rychlosti (obr. 1c). Hodnoty IC50 CTPG pro buňky H22 jsou 236 ug/ml za 24 hodin a 169,8 ug/ml za 48 hodin.

CTPG indukoval apoptózu v buňkách H22

Aby se zjistilo, zda je snížená životaschopnost buněk H22 zprostředkována indukcí apoptózy, byly buňky H22 ošetřeny různými koncentracemi CTPG (0, 100, 200, 300 a 400 ug/ml) po dobu 24 hodin a obarveny s PI a Annexinem V. Výsledky průtokové cytometrie ukázaly, že CTPG významně indukuje apoptózu buněk H22 (včetně časné a pozdní apoptózy) způsobem závislým na dávce (obr. 2a). Ačkoli vysoká dávka CTPG také významně zvýšila nekrózu buněk H22, nekróza hraje menší roli v inhibici růstu buněk H22 kvůli jejímu nižšímu podílu (8,3 procenta) ve srovnání s apoptózou (52,6 procenta). Dále byly izolovány celkové proteiny H22 buněk po ošetření CTPG a exprese antiapoptotického B buněčného lymfomu 2 (Bcl-2) a proapoptotického BCL-2- asociovaného X proteinu (Bax) byly detekovány pomocí Western blot. Data skenování ve stupních šedi ukázala, že hladiny exprese Bax a Bcl-2 byly zvýšeny a sníženy. Poměr Bax/Bcl-2 byl významně zvýšen (obr. 2b). Tyto výsledky naznačují, že CTPG indukuje apoptózu v buňkách H22.

CTPG indukuje chromozomální kondenzaci a zastavení buněčného cyklu v buňkách H22

Bylo publikováno, že poškození DNA a zástava buněčného cyklu indukovaná léky může inhibovat růst nádorových buněk a způsobit apoptózu nádorových buněk [17, 18]. Pro detekci morfologie jader v buňkách H22 po ošetření CTPG po dobu 24 hodin byly buňky H22 obarveny pomocí Hoechst 33,342 a pozorovány pomocí inverzní fluorescenční mikroskopie. Buňky ošetřené CTPG vykazovaly na dávce závislé zvýšení jasně kondenzovaného chromatinu jader, zatímco neošetřené buňky vykazovaly homogenně obarvená jádra (obr. 3a). Distribuce buněčného cyklu v buňkách H22 byla dále analyzována barvením PI po ošetření CTPG po dobu 24 hodin. Jak je znázorněno na obr. 3b, léčba CTPG významně zvýšila podíl buněk G0/G1- a G2/M-fáze a významně snížila podíl buněk S-fáze, což naznačuje, že CTPG indukoval G 0/G1 a G2/M zastavení fáze v buňkách H22. Vysoká dávka CTPG také významně zvýšila podíl sub G1 buněk.

CTPG snížil mitochondriální membránový potenciál a zvýšil uvolňování cytochromu c

Mitochondriálně závislá dráha hraje důležitou roli v indukci apoptózy [19, 20]. Změny mitochondriálního membránového potenciálu (Δψm) lze sledovat JC-1 barvením v důsledku JC-1 agregátu (červená fluorescence) se může rozpadat na monomer (zelená fluorescence) se snížením Δψm [21]. Po ošetření CTPG po dobu 24 hodin byly buňky H22 obarveny barvivem JC- 1. Údaje z průtokové cytometrie ukázaly, že červená fluorescence v kanálu FL-2 a zelená fluorescence v kanálu FL-1 byly po léčbě CTPG významně sníženy a zvýšeny. Podíl PE−FITC plus buněk byl významně zvýšen (obr. 4a), což naznačuje, že CTPG snížil Δψm v buňkách H22. To je v souladu se zvýšeným poměrem Bax/Bcl{13}}. V důsledku toho jsme pozorovali, že uvolňování cytochromu c bylo významně zvýšeno po léčbě CTPG (obr. 4b). Tyto výsledky ukázaly, že CTPG může částečně indukovat apoptózu v buňkách H22 prostřednictvím mitochondriálně závislé (vnitřní) dráhy.

CTPG aktivoval kaspázovou dráhu a zabránil opravě DNA

Dále byla analyzována aktivace kaspázy indukovaná CTPG prostřednictvím vnější i vnitřní signální dráhy. Po ošetření CTPG po dobu 24 hodin byly z buněk H22 izolovány celkové proteiny a pomocí Western blotu byly detekovány hladiny pro- a štěpených kaspáz. Ve srovnání s neléčenou nebo DMSO kontrolou léčba CTPG významně upregulovala nejen hladinu štěpené kaspázy-8 (vnější dráha), ale také hladinu štěpené kaspázy-9 (vnitřní dráha) (obr. 5). Postupně aktivovaná kaspáza-8 a -9 štěpila downstream prokaspázu-3 a -7, které byly pozorovány na obr. 5. Aktivovaná kaspáza-3 štěpila DNA opravný enzym poly (ADP-ribóza) polymerázy (PARP), aby se zabránilo opravě DNA a akumulovalo poškození DNA, jak je pozorováno na obr. 3a.

Tyto výsledky ukázaly, že CTPG indukoval apoptózu v buňkách H22 jak vnějšími, tak vnitřními signálními cestami.

CTPG potlačuje růst H22 HCC in vivo a zlepšuje míru přežití nádorových myší

Nakonec byl vyhodnocen protinádorový účinek CTPG na HCC na nádorovém myším modelu, který byl stanoven subkutánní injekcí buněk H22. Po 3 dnech injekce buněk H22 byly myši s nádorem ošetřeny CTPG 8krát. Tělesná hmotnost myší a velikosti nádorů byly monitorovány v uvedených časových bodech. Jak je znázorněno na obr. 6a, tělesná hmotnost myší v každé skupině nemá žádný významný rozdíl, což naznačuje, že vybrané dávky CTPG nemají žádné zjevné vedlejší účinky. Je zajímavé, že růst nádoru u myší léčených jak 200 mg/kg, tak 400 mg/kg CTPG byl významně inhibován (obr. 6b). Kromě toho dvě dávky léčby CTPG výrazně zlepšily přežití myší s nádorem (3/7, 3/7) ve srovnání s kontrolní skupinou (0/7) na konci experimentu (obr. 6b). Také jsme zjistili, že CTPG významně zvýšil proliferaci splenocytů izolovaných ze samců Kunming myší způsobem závislým na dávce (obr. 6c), což naznačuje, že CTPG má imunostimulační účinek.

Diskuse

TCM se již dlouhou dobu používá k léčbě různých onemocnění včetně rakoviny. Bylo publikováno, že TCM může indukovat apoptózu v různých typech nádorových buněk prostřednictvím jak vnější (zprostředkované receptorem smrti), tak vnitřní (mitochondrie-závislé) signální dráhy k uplatnění protinádorových účinků [22–25]. Tyto dvě cesty mohou aktivovat kaspázu-8 a -9 [24, 26]. Zde jsme zjistili, že CTPG významně potlačuje růst buněk H22 prostřednictvím indukce apoptózy a zastavení buněčného cyklu. Hladiny štěpené kaspázy-8 a -9 byly významně zvýšeny léčbou CTPG, což naznačuje, že na indukci apoptózy se podílely vnější i vnitřní signální dráhy. Naše předchozí studie ukázala, že CTPG indukoval apoptózu v buňkách melanomu B16-F10 cestou závislou na mitochondriích, která zvýšila hladinu štěpené kaspázy-9, ale nikoli kaspázy-8 [16]. CTPG může aktivovat odlišné signální dráhy v různých typech nádorových buněk.

Integrita mitochondriální membrány je přísně regulována členy rodiny proteinů BCL-2 včetně Bax a Bcl{1}} [27, 28]. Poměr Bax k Bcl-2 hraje kritickou roli v dráze apoptózy závislé na mitochondriích [29]. U buněk H22 ošetřených CTPG byl poměr Bax/Bcl-2 významně zvýšen, což by mohlo způsobit snížení Δψm a uvolňování cytochromu c pozorované v této studii. Následně byla pro-kaspáza{11}} odštěpena a aktivována. Nakonec iniciátoři aktivní kaspázy-8 a -9 aktivovali popravčího kaspázy-3, aby štěpil PARP, aby zabránil opravě DNA. Celkově vzato tyto výsledky naznačují, že CTPG indukoval apoptózu v buňkách H22 jak vnějšími, tak vnitřními signálními cestami.

V modelu nádorových myší CTPG významně potlačil růst H22 HCC a výrazně zlepšil přežití nádorových myší. Je zajímavé, že CTPG v závislosti na dávce podporoval proliferaci splenocytů z myší Kunming, což je v souladu s naší předchozí studií [16].

Tyto výsledky naznačují, že CTPG může potlačovat růst H22 HCC u myší jak prostřednictvím přímého protinádorového účinku, tak nepřímého posílení imunity.

Závěry

CTPG potlačoval růst buněk H22 jak in vitro, tak in vivo a indukoval apoptózu v buňkách H22 jak vnějšími, tak vnitřními signálními cestami. Tyto údaje ukázaly, že CTPG by mohl být potenciálním kandidátem pro léčbu HCC.