Ztmavnutí kůže je důsledkem nahromadění kožního barviva melaninu. Aby se tomu zabránilo, jsou komerčně dostupné amplitudy činidel zesvětlujících pokožku, z nichž většina inhibuje syntézu melaninu. Odbarvování melaninu je alternativní metodou zesvětlení pleti. V této studii ukazujeme, že ligninperoxidáza (LiP), extracelulární enzym purifikovaný z Phanerochaete chrysosporium NK-1 izolovaný z lesní půdy, může účinně degradovat a odbarvovat melanin in vitro. Pro optimalizaci reakčních podmínek byly zkoumány podmínky odbarvování včetně pH, teploty, inkubační doby, koncentrace enzymu a přidání mediátoru. Výsledky ukazují, že pH 3, 40 stupňů, 15 IU/ml a 10 hodin inkubace byly optimální podmínky pro odbarvení melaninu. Bylo také zjištěno, že použití mediátoru, veratrylalkoholu, je účinné pro zvýšení účinnosti dekolonizace melaninu s až 92% odbarvením. Výsledky skenovací elektronové mikroskopie ukázaly prázdné prostory na ošetřených melaninových granulích ve srovnání s neošetřeným vzorkem, což ukazuje na degradaci melaninu. Byly pozorovány změny v oblasti otisků prstů melaninu. Mezi vlnočty 1500–500 cm-1 například přítomnost nových píků v ošetřeném melaninu při 1513, 1464 a 1139 cm-1 CH2, CH3 ohyb a C–O–C úsek představovaly strukturální změny. V odbarveném melaninu byl také detekován nový pík při 2144 cm-1 (alkynyl C≡C úsek). Studie cytotoxicity ukázala, že ošetřený melanin a LiP mají nízké cytotoxické účinky; mediátor veratrylalkohol by však mohl mít za následek vysokou úmrtnost, což naznačuje, že jeho použití by mělo být pečlivě testováno při formulování produktů pro zdraví a péči o pleť. Závěry studie naznačují, že LiP produkovaný Phanerochaete chrysosporium má potenciál být použit v lékařském a kosmetickém průmyslu, zejména pro vývoj kosmetických bělících činidel na biologické bázi.

Podle relevantních studií je cistanche běžnou bylinou, která je známá jako „zázračná bylina, která prodlužuje život“. Jeho hlavní složkou je cistanosid, který má různé účinky, jako je antioxidační, protizánětlivý a podpora imunitních funkcí. Mechanismus mezi cistanche a bělením kůže spočívá v antioxidačním účinku cistanchových glykosidů. Melanin v lidské kůži vzniká oxidací tyrosinu katalyzovanou tyrosinázou a oxidační reakce vyžaduje účast kyslíku, takže se volné radikály v těle stávají důležitým faktorem ovlivňujícím produkci melaninu. Cistanche obsahuje cistanosid, což je antioxidant a může snižovat tvorbu volných radikálů v těle, čímž inhibuje produkci melaninu.

Klikněte na Cistanches Herba For Whitening

Další informace:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Melanin je skupina komplexních, nepoddajných a pervazivních polycyklických biopolymerních kožních pigmentů produkovaných specializovanými kožními buňkami nazývanými melanocyty 1,2. Jeho primární funkcí je chránit pokožku před škodlivým UV zářením slunečního záření vytvářením supranukleárních čepiček kolem DNA kožních buněk 3. Kromě toho je zodpovědný za různé barvy kůže tím, že absorbuje různé volné radikály v cytoplazmě. Většina těchto látek zesvětlujících pokožku získaných z přírodních zdrojů inhibuje produkci melaninu v kožních buňkách inhibicí enzymů tyrosinázy, potlačením biosyntézy pigmentu a prostřednictvím některých alternativních cest. Různé sloučeniny, jako je hydrochinon, mono-benzylethery hydrochinonu, rtuť, kortikosteroidy a arbutin, se používají v komerční formulaci kosmetiky na bělení kůže, avšak jejich aplikace je spojena s vážnými vedlejšími účinky. Například se uvádí, že rtuť způsobuje poškození ledvin a olovo způsobuje úzkost, depresi a psychózu 4,5. Užívání kortikosteroidů může způsobit Cushingův syndrom, diabetes, hypertenzi, adrenální insuficienci, imunosupresi, ztenčení kůže, akné, dermatitidu a hypertrichózu 6. Tain et al. (2009) uvedli, že použití arbutinu v kosmetice na bělení kůže bylo účinné při koncentracích až 3 procenta, ale další zvýšení koncentrace způsobilo cytotoxické účinky. Vzhledem k těmto omezením byly aplikace těchto inhibitorů v kosmetice pro bělení kůže široce kritizovány orgány pro zdraví a bezpečnost. Bylo navrženo, že kosmetika na bělení pokožky by mohla do roku 2021 dosáhnout až 155,44 miliard USD s ročním tempem růstu 4,9 procenta. Vzhledem k rostoucí poptávce po bezpečných a přírodních bělicích prostředcích na celém světě se enzymatická dekolonizace melaninu těší značnému zájmu 7–9.

Mikrobiální extracelulární enzymy, jako je lakáza, manganová peroxidáza a ligninperoxidáza (LiP), byly dříve testovány na odbarvování melaninu a jsou považovány za potenciální ekologicky šetrnou alternativu k toxickým chemikáliím 1. Mezi nimi byl LiP shledán velmi účinným pro odbarvování. melaninu kvůli jeho vysokému redoxnímu potenciálu oxidovat veratrylalkohol (VA) než ostatní příbuzné enzymy. Navzdory vysokému oxidačnímu potenciálu a účinné katalýze melaninu jsou objemová produkce a potíže s čištěním hlavními omezeními komerčních aplikací LiP v prostředcích pro bělení kůže. Navíc LiP ztrácí svou enzymatickou aktivitu pro dekolonizaci melaninu pod nadbytkem peroxidu vodíku, který je považován za kritický pro oxidaci melaninu. Kromě své důležité role H2O2 inaktivuje LiP, čímž snižuje katalytický výkon enzymu.

Výsledek

Odbarvování melaninu Phanerochaete chrysosporium NK‑1.Kmeny hub byly testovány na odbarvení melaninu. Houby byly bodově naočkovány na pevné médium obsahující melanin a VA jako induktor LiP. Po sedmi dnech inkubace vykazoval Phanerochaete chrysosporium NK-1 schopnost odbarvovat melanin, jak je znázorněno na obr. 1.

Podmínky pro optimální odbarvení melaninu.pH. Purifikovaný enzym byl použit pro odbarvení syntetického melaninu in vitro. Byly pozorovány účinky různých podmínek na odbarvování melaninu 10. Nejprve byly zkoumány účinky pH na odbarvování melaninu pomocí LiP. Za tímto účelem bylo provedeno odbarvení melaninu při různých podmínkách pH v rozmezí od 2.0 do 6,0 při teplotě 30 stupňů v přítomnosti i nepřítomnosti VA po dobu inkubace 6 hodin. Výsledky na obr. 2 ukazují, že obecně bylo odbarvení melaninu v přítomnosti VA vyšší ve všech podmínkách pH. Zejména je výraznější v podmínkách vyššího pH. VA může napomáhat tvorbě kationtových radikálů 11. Tyto radikály mají mnohem vyšší redoxní potenciál atakovat C–C vazby nespecificky v melaninu a vedou k odbarvení 12. V přítomnosti VA bylo dosaženo nejvyššího odbarvení melaninu 88 procent při pH 3 následované 71 procenty při pH 2, zatímco nejnižší odbarvení melaninu 39 procent bylo pozorováno při pH 6. V nepřítomnosti VA bylo nejvyšší odbarvení melaninu 86 procent pozorováno při pH 3, zatímco nejnižší při pH 5 a 6 bylo pozorováno odbarvení melaninu o 35 procent a 36 procent. Odbarvování melaninu pomocí LiP v této studii bylo vysoce účinné při podmínkách nižšího pH, tj. 2 a 3 (obr. 2), ačkoli jiné studie prokázaly optimální podmínky pH při 4 1.

Teplota. Odbarvování melaninu pomocí LiP bylo studováno při různých teplotách v rozmezí 20–60 stupňů v přítomnosti i nepřítomnosti VA v inkubační době 6 hodin. V nepřítomnosti VA byla pozorována podobná procenta (19 procent) odbarvení melaninu při teplotě 20 a 30 stupňů (obr. 3). Nejvyšší a nejnižší odbarvení melaninu v nepřítomnosti VA bylo pozorováno při 40 a 50 stupních. Avšak s VA v roztoku se odbarvení melaninu zvýšilo z 20 na 40 stupňů a snížilo se až na 60 stupňů. V přítomnosti VA je nejvyšší odbarvení melaninu přibližně 60 procent při 40 stupních. Odbarvování je obecně nižší, protože experiment byl prováděn za mírnějších podmínek pH.

Koncentrace LiP. Bylo také zkoumáno odbarvování melaninu s variacemi v koncentracích enzymů. Pět různých koncentrací, tj. 5, 10, 15, 20 a 25 IU/ml LiP, bylo zkoumáno na odbarvení melaninu v přítomnosti a nepřítomnosti VA, jak ukazuje obr. 4. Překvapivě byla nejúčinnější koncentrace enzymu 15 IU/ml pro oba roztoky s i bez VA. Po inkubační době 6 hodin bylo nejvyšší odbarvení melaninu 92 procent v přítomnosti VA a 70 procent v nepřítomnosti mediátoru při koncentraci enzymu 15 IU/ml, zatímco nejnižší odbarvení melaninu o 23 procent bylo pozorováno u nepřítomnost VA při použití 5 IU/ml LiP. Není jasné, že odbarvování je méně účinné při vysokých koncentracích enzymu, tj. 20 a 25 IU/ml (obr. 4).

Inkubační doba. Experimenty s odbarvováním byly prováděny po 2, 4, 6, 8 a 10 hodinách inkubace. Tyto reakce byly také prováděny v přítomnosti a nepřítomnosti VA. Výsledky ukázaly, že účinnost odbarvení pozitivně koreluje s inkubační dobou, jak se očekávalo (obr. 5). Nárůst rozsahu delokalizace byl výraznější v počáteční inkubaci. Nejvyšší odbarvení melaninu (68 procent) bylo pozorováno po inkubační době 10 hodin v přítomnosti VA a 59 procent v nepřítomnosti VA. Odbarvení melaninu bylo pouze 15 procent po 2 hodinách inkubace bez VA. Proto jsme na základě výsledků testu usoudili, že optimální podmínky jsou pH 3, 40 stupňů, 15 IU/ml a 10 hodin inkubace.

Analýza SEM (scanning electron microscope) a FTIR (Fourier-transform infrared spectroscopy).Morfologické a strukturální změny v melaninu byly charakterizovány pomocí SEM a FTIR. Odbarvený melanin byl analyzován pomocí SEM, aby byly pozorovány morfologické změny povrchu. Jako kontrola byl použit syntetický melanin bez jakékoli enzymatické úpravy. Jak je znázorněno na obr. 6, na ošetřených melaninových granulích byl prázdný prostor ve srovnání s neošetřeným vzorkem, což naznačuje, že částice melaninu byly napadeny enzymem.

Odbarvený melanin byl také analyzován pomocí FTIR s neošetřeným melaninem jako kontrolou (obr. 7). Byly získány molekulární otisky jak odbarveného, ​​tak neošetřeného melaninu a porovnány, aby se potvrdily jakékoli strukturální změny v upraveném melaninu. 13. FTIR spektra melaninu (C18H10N2O4) ukázala široké absorpční spektrum při 3272 cm-1, které lze přičíst charakteristickému O –H natahování nebo N–H natahování vibrace karboxylové kyseliny a fenolových skupin. Změny ve FTIR spektru léčeného melaninu byly patrné. Širokopásmové pásmo na vlnočtech 3000–3500 cm−1 ukazuje na přítomnost skupin -NH a -OH v kontrolních i ošetřených vzorcích. Intenzita ošetřeného vzorku je však významně vyšší než u kontrolního vzorku, což naznačuje, že ošetření mělo přidání těchto funkčních skupin do struktury enzymatickými útoky. Píky při 2884,4 cm-1 a 2822 cm-1 indikovaly přítomnost alkylových skupin v kontrole, zatímco v odbarveném melaninu vrchol při vlnočtu 2884,4 cm-1 chyběl. Pík při 2822 cm-1 se odchýlil na vlnovou délku 2835,92 cm-1, což představovalo strukturální změny v ošetřeném melaninu i v této oblasti. Vrchol na vlnočtu 1710 cm−1 v kontrole byl připisován přítomnosti karboxylové kyseliny. Tento pík také chyběl nebo byl do značné míry snížen u odbarveného melaninu, což opět potvrzuje strukturální změny v ošetřeném melaninu. K některým změnám došlo také v oblasti otisků prstů. Mezi vlnočty 1500–500 cm-1 například přítomnost nových píků v ošetřeném melaninu při 1513, 1464 a 1139 cm-1 představovala strukturální změny. Nový pík při 2144 cm-1 byl také detekován v odbarveném melaninu.

Cytotoxické účinky.Cytotoxicita degradovaného melaninu a LiP byla zkoumána pomocí metody cytotoxicity garnátů 14,15. V této studii byly cytotoxické účinky ošetřeného melaninu a LiP nízké s mírou životaschopnosti larev krevet vyšší než nebo rovnou 90 procentům (tabulka 1). Zvýšení koncentrace LiP nemělo žádný dopad na životaschopnost larev krevet až do 80 ul/ml (~80 IU/ml), což naznačuje jejich nízkou cytotoxickou aktivitu. V pozitivních kontrolách s VA byla úmrtnost 100 procent, což naznačuje, že je třeba opatrnosti při aplikaci LiP v přítomnosti VA jako mediátoru v lékařské a kosmetické oblasti.

Diskuse

V případě teploty bylo nejvyššího růstu hub a produkce enzymů dosaženo při 40 stupních , což odpovídá přirozenému prostředí P. chrysosporium. Schopnost LiP degradovat melanin je založena na strukturální podobnosti mezi melaninem a ligninem 18. Účinnost degradace melaninu LiP in vitro byla korelována s několika faktory, jako je pH, teplota, koncentrace enzymu a inkubační doba. jako existence VA. liP může oxidovat VA na jeho kationtové radikály (VA∙ plus ) a sloužit jako redoxní mediátor, který dále odbarvuje melanin, jak je znázorněno na obr. 8.

H2O2 je nezbytný substrát jako konečný akceptor elektronů během odbarvování melaninu. LiP se snadno inaktivuje v nadbytečné koncentraci, která vyvolává prasknutí struktury hemu nebo tvorbu neaktivní sloučeniny III. Uvádí se, že tento inhibiční účinek lze potlačit oxidací VA na VA kationtový radikál 1 . LiP oxiduje VA na VA kationtové radikály, které působí jako redoxní mediátor k odbarvování melaninu. VA je přírodní sloučenina vyrobená z hub s bílou hnilobou, u kterých se očekává, že budou mít méně vedlejších účinků. Přítomnost mediátoru VA však vedla k vysoké mortalitě testovaných organismů ve srovnání s nízkými cytotoxickými účinky ošetřeného melaninu a LiP. Měl by být pečlivě testován ve složení produktů pro zdraví a péči o pleť.

Materiály a metody

Izolace a identifikace kmenů hub.Plísňová izolace byla provedena z kontaminované lokality, která byla dlouhou dobu využívána jako skládka dřevních materiálů. Vzorek byl odebrán do sterilních lahví a přenesen do laboratoře k čištění. Purifikace byla provedena na pobřežním dextrózovém agarovém médiu. Ze vzorku byly izolovány a purifikovány čtyři různé kolonie hub. Screening na nejlepší kmen byl proveden na základě odbarvení melaninu a produkce biomasy v přítomnosti melaninu jako jediného zdroje uhlíku v médiu s minerální solí (MSM). Na základě screeningu byl vybraný organismus identifikován sekvenováním DNA 5,8S rRNA a 18S rRNA pomocí univerzálních primerů ITS-1 a ITS-4 10. Jejich genomová DNA byla extrahována podle metody Andersona et al. 19. Po purifikaci bylo provedeno sekvenování PCR produktů. Sekvence byly porovnány pomocí nástroje BLAST v NCBI a homology byly analyzovány na fylogenezi pomocí Molecular Evolutionary Genetic Analysis (MEGA). Na základě maximální pravděpodobnosti byl zkonstruován sousední strom pro identifikaci izolovaného kmene houby. Sekvence byly předloženy NCBI GenBank s přístupovým číslem KX064682.1. Fylogenetická analýza odhalila, že izolát KX064682.1 byl kmen Phanerochaete chrysosporium NK-1.

Deskový test na odbarvení melaninu.Pro odbarvení melaninu byla použita houba s bílou hnilobou, Phanerochaete chrysosporium NK-1. Je známo, že Phanerochaete chrysosporium produkuje LiP. Syntetický melanin (B049-97–6) byl použit jako modelový melanin ve všech experimentech s odbarvováním melaninu. Modifikované médium s VA 2 jako induktorem LiP bylo použito k testování schopnosti melaninového odbarvování houby. Petriho misky byly použity ke kultivaci Phanerochaete chrysosporium NK-1. Médium bylo připraveno rozpuštěním 10 g glukózy, 2 g sladového extraktu, 4 g MgSO4·7H2O, 1 g KH2PO4, 0.01 g FeSO4, 0,005 g ZnSO4, 0,2 g syntetického melaninu a 15 g agaru v 1-l destilované vody. Inokulované Petriho misky byly inkubovány při teplotě místnosti ve tmě. Byl pozorován rozsah, ve kterém se melanin odbarvil pod a kolem kolonie houby. Bylo zjištěno, že houba je schopna odbarvovat melanin a dále se používá k přípravě enzymatických roztoků.

Příprava enzymu pro odbarvování melaninu.Tekuté médium kultury obsahovalo 10 g glukózy, 0,2 g kvasničného extraktu, 0.07 g VA, 3.{{13 }} g kyseliny vinné, 1 g tweenu 80, 0,2 g KH2PO4, 0,146 g CaCl2·2H2O, 0,157 g K2HPO4, 0.05 g MgS04·7H2O, 42,5 mg ZnSO4·7H2O, 70 mg CoCl2·6H2O, 7.0 mg CuCl2·2H2O, 0,54 mg FeCl3, 0,9 mg NaCl a 0,2 mg syntetického melaninu na litr destilované vody 20. pH média bylo upraveno na 4,0 roztoky NaOH a HCl. 250ml baňky obsahující alikvoty 100ml kultivačního média byly autoklávovány a naočkovány 5ml inokulem. Baňky byly poté inkubovány na rotační třepačce při 30 stupních po dobu 15 dnů. Duplikátní vzorky byly odebrány pro testy aktivity LiP v intervalu 24 hodin.

Enzymový test.Činidla pro test LiP zahrnovala 250 mM pufr vinanu sodného pH 5,5, 10 mM VA a 4 mM H202 (30 procent). Enzymový test byl proveden v kyvetě s oxidem křemičitým a absorbance byla měřena při 310 nm UV-viditelným spektrofotometrem (Shimadzu, Kyoto, Japonsko). Absorbance byla monitorována v časech 0–30 s za okolních podmínek. Aktivita enzymu byla vypočtena podle Beerova zákona, Eq. (1) 21.

kde c, je koncentrace atenuačních druhů; A je optická absorpce; ε je koeficient molárního útlumu; d je délka optické dráhy. Měření aktivity enzymu zahrnuje stanovení změny koncentrace v čase, Eq. (2).

Optimalizace pro zvýšenou produkci LiP a odbarvování melaninu in vitro.Optimalizace pro zvýšenou produkci LiP z Phanerochaete chrysosporium NK-1 s použitím melaninu jako substrátu byla provedena pomocí návrhu Placket Burman. Placket v plné délce byl založen na skutečnosti, že podkopává interaktivní efekty mezi různými proměnnými, zatímco bere v úvahu pouze lineární trendy, Eq. (3) 22.

kde Y představuje odezvu a symboly označují regresní koeficient a k je počet studovaných faktorů. Bylo studováno celkem 9 faktorů pro dosažení nejvyšší koncentrace LiP z Phanerochaete chrysosporium NK-1 pro odbarvení melaninu přítomného v médiu. Placket-Burmanův design byl zkonstruován s celkem 12 experimentálními běhy, jak je uvedeno v tabulce 2. Experimenty byly prováděny celkem 35 dní a byla měřena odezva (LiP aktivita IU/ml). Experimentální data byla analyzována pomocí statistického softwaru 'Design Expert 9'. Optimalizované médium bylo použito pro zvýšenou produkci LiP a purifikováno srážením amoniem.

Optimalizace produkce a čištění enzymů.Pro stanovení optimální inkubační doby z hlediska aktivit LiP bylo použito ponořené médium. Jak je znázorněno na připojeném obr. 1, kultivační roztok má maximální enzymatickou aktivitu 8. den, která je 140 IU/ml. Proto byla pro výrobu roztoku enzymu použita inkubační doba 8 dní.

Bylo provedeno celkem 12 experimentů s cílem určit faktory (9), které mají dopad na aktivity LiP. Mezi testy se hodnoty odezvy aktivity LiP pohybují od 171 IU/ml do 576 IU/ml, jak je znázorněno na připojeném obr. 2. Běhy s nejvyšší aktivitou LiP byly běhy 3 (576 IU/ml) následované běhy 10 (547 IU/ml). Podle regresní analýzy mají na aktivitu LiP pozitivní vliv teplota, čas, koncentrace glukózy, koncentrace substrátu a mediátor. Vliv kvasnicového extraktu byl shledán jako zanedbatelný. Jiné faktory mají negativní vliv. Optimální podmínky pro výrobu LiP jsou čas: 35 dní, teplota: 40 stupňů, glukóza (na litr): 20 g, fruktóza: 10 g, kvasnicový extrakt: 2 g, pepton: 2 g, inokulum: 10 ml, substrát mediátor: 0,1 ml. Tyto podmínky byly poté použity pro zvýšenou produkci LiP, který byl purifikován metodami srážení amoniem a gelové chromatografie (Sephadex G-75).

Byla provedena extrakce enzymu při optimalizovaném pH, teplotě a inkubační době. Gelová filtrační kolona Sephadex G75 byla použita k oddělení frakce obsahu proteinu z buněčného lyzátu týkající se hustotního gradientu podle pokynů výrobce. Množství proteinů v surovém extraktu bylo také indikováno prostřednictvím počtu pásů, které se objevily na analýze natriumdodecylpolyakrylamidového gelu (SDS-PAGE). Molekulová hmotnost purifikovaného enzymu byla 46.0 kDa, jak bylo vypočteno z analýzy SDS-PAGE (doplněný obr. 3). Enzymatické aktivity po srážení amoniem a čištění gelovou chromatografií jsou 684.0 a 957,6 IU/ml, v daném pořadí.

Purifikovaný enzym byl použit pro odbarvení melaninu za různých fyzikálně-chemických podmínek, včetně pH, teploty, inkubační doby a koncentrace enzymu. Syntetický melanin (B049-97-6) byl použit jako modelový melanin ve všech experimentech s odbarvováním melaninu podle 23.

Odbarvovací experimenty.Účinky pH na odbarvování melaninu. Aby bylo možné pozorovat účinky pH na odbarvování melaninu pomocí LiP, byly odbarvovací reakce melaninu provedeny při pH od 2.0– 6.0. Reakční směs obsahovala 1 0 ul surového enzymu rozpuštěného v TE pufru a 1990 ul 0,02 procenta w/v melaninu. Tyto reakce byly prováděny jak v přítomnosti, tak v nepřítomnosti VA. Reakční směsi byly inkubovány při teplotě 30 stupňů po dobu 6 hodin. Kontrolní experimenty byly prováděny paralelně nahrazením aktivního LiP denaturovaným enzymem, který byl vařen při 95 stupních. Reakční směsi byly monitorovány na odbarvení melaninu za použití spektrofotometru při vlnové délce 540 nm před a po inkubaci. Účinnost odbarvování enzymu byla vyjádřena v procentech ( procentech ). Odbarvení melaninu bylo vypočteno pomocí Eq. (4) 11.

Účinky inkubační doby na odbarvování melaninu. Pro optimalizaci inkubační doby byly melaninové odbarvovací reakce prováděny v inkubačních dobách 2–10 h. Reakční směs obsahovala 10 ul surového enzymu rozpuštěného v pufru a 1990 ul 0,02 procent w/v melaninu při pH 4 v přítomnosti a nepřítomnosti VA. Reakční směsi byly poté inkubovány při teplotě 30 stupňů a bylo získáno procento odbarvení melaninu.

SEM analýza degradovaného melaninu. Povrchové morfologické změny melaninu byly analyzovány rastrovací elektronovou mikroskopií (JEOL JSM{0}}, Peabody, MA, USA) 24. Jako kontrola byl použit neošetřený melanin. Vzorky byly vysušeny a upevněny na měděných pahýlech (10 x 10 mm2) oboustrannou uhlíkovou páskou (z obou stran lepkavou). Pahýly byly omyty detergentem a vysušeny v sušičce s horkovzdušnou pistolí (KADA 85U/SMD) při 200 stupních po dobu 2 minut před fixací vzorku. Pro zajištění vedení elektronového paprsku bylo použito vedení stříbrnou pastou (SPI-CHEM, West Chester, PA, USA). Zlato bylo na vzorek naneseno plazmou vytvořenou za podmínek vysokého napětí (proud 25 mA po dobu 50 s) a vakua (10−2 ATM). Morfologie povrchu vzorků byla zkoumána při 3000násobném zvětšení.

FTIR analýza odbarveného melaninu.Reakce nebo vzorky, které v optimalizačním experimentu vykazovaly nejvyšší odbarvení melaninu, byly dále analyzovány spektroskopií FTIR (model č. 56, Merlin, Německo). Vzorky byly odstředěny (10, 000 rpm po dobu 1 min) a sušeny na vzduchu jako přípravný krok pro FTIR analýzu 20. Kvalitativní analýza vzorků melaninu byla provedena pomocí UV–Vis blízkého infračerveného (NIR) spektrometru Nástroje Lambda 900/Perkin Elmer. Spektra byla zaznamenána v rozsahu 1000 až 3500 cm-1. Vzorky byly připraveny v KBr peletách s práškovou disperzí. V této analýze byl jako kontrola použit neošetřený syntetický melanin.

Cytotoxicita degradovaného melaninu a LiP.Pro kontrolu cytotoxicity degradovaného melaninu 14,15 byly provedeny testy úmrtnosti garnátů. Vejce garnátů se vylíhla v obdélníkové misce s umělou mořskou vodou. Miska obsahovala plastovou přepážku s malými otvory a rozdělovala misku na dvě nestejné přihrádky. Vejce byla ve větším oddělení kropenatá a zakrytá, aby se zabránilo pronikání světla, zatímco menší oddělení bylo osvětleno lampou nad ním. Vylíhlé larvy byly přitahovány světlem směrem k malému oddělení. Po 48 hodinách inkubace byly zralé nauplie odebrány z osvětleného oddělení pomocí pasterizované pipety.

Statistická analýza.Experimentální data byla analyzována pomocí statistického softwaru 'Design Expert 9'. Grafické obrázky byly nakresleny pomocí tří experimentálních pokusů s vypočtenou směrodatnou odchylkou. Statistická významnost experimentálního běhu byla vypočtena pomocí ANOVA.

Dostupnost dat

Reference

4. Clarkson, TW, Magos, L. & Myers, GJ Te toxikologie rtuti – aktuální expozice a klinické projevy. N. Engl. J. Med. 349, 1731–1737 (2003).

5. Lynde, C., Kraf, J. & Lynde, C. Topická léčba melasmatu a pozánětlivé hyperpigmentace. Skin Therapy Lett. 11, 1–6 (2006).

6. Hughes, J. & Rustin, M. Kortikosteroidy. Clin. Dermatol. 15, 715-721 (1997).

7. Płonka, P. & Grabacka, M. Syntéza melaninu v mikroorganismech: biotechnologické a lékařské aspekty. Acta Biochim. Pol. 53, 423-443 (2006).

8. Lim, Y.-J. a kol. Inhibiční účinky arbutinu na biosyntézu melaninu hyperpigmentace indukované hormony stimulující melanocyty v kultivovaných hnědých kožních tkáních morčat. Oblouk. Pharmacal Res. 32, 367–373 (2009).

9. Petit, L. & Pierard, G. Produkty pro zesvětlení pleti znovu. Int. J. Cosmet. Sci. 25, 169-181 (2003).

10. Rättö, M., Chatani, M., Ritschkof, A.-C. & Viikari, L. Screening mikroorganismů na odbarvování melaninů produkovaných modře zbarvenými houbami. Appl. Microbiol. Biotechnol. 55, 210-213 (2001).

11. Nagasaki, K. a kol. Purifikace, charakterizace a genové klonování Ceriporiopsis sp. kmen MD-1 peroxidáz, které odbarvují melanin lidských vlasů. Appl. Environ. Microbiol. 74, 5106–5112 (2008).

12. Ruiz-Dueñas, FJ & Martínez, Á. T. Mikrobiální degradace ligninu: jak je objemný odolný polymer účinně recyklován v přírodě a jak toho můžeme využít. Microb. Biotechnol. 2, 164–177 (2009).

13. Holmes, EW & Tompson, KD (Patenty Google, 2014).

14. Baravalia, Y., Vaghasiya, Y. & Chanda, S. Cytotoxicita solných krevet, protizánětlivé a analgetické vlastnosti Woodfordia fruticosa Kurz fowers. Írán. J. Pharm. Res.: IJPR 11, 851 (2012).

15. Milhem, MM, Al-Hiyasat, AS & Darmani, H. Testování toxicity výplňových dentálních materiálů pomocí larev artemie (Artemia salina). J. Appl. Oral Sci.

16, 297-301 (2008). 16. Falade, AO a kol. Funkce ligninperoxidázy a perspektivní aplikace. Microbiologyopen 6, e00394.

17. Sung, HJ Odbarvování melaninu ligninperoxidázou s in-situ generovaným H2O2 pro aplikaci bělící kosmetiky (2020).

18. Pérez, J., Munoz-Dorado, J., De la Rubia, T. & Martinez, J. Biodegradace a biologické úpravy celulózy, hemicelulózy a ligninu: přehled. Int. Microbiol. 5, 53-63 (2002).

19. Anderson, MJ, Gull, K. & Denning, DW Molekulární typizace náhodnou amplifikací polymorfní DNA a M13 Southern hybridizace příbuzných párových izolátů Aspergillus fumigatus. J. Clin. Microbiol. 34, 87-93 (1996).

20. Sabar, MA a kol. Degradace uhlí nízké kvality Rhizopus oryzae izolovaná z pákistánského uhelného dolu a jeho zvýšené uvolňování organických látek. Palivo 253, 257–265 (2019).

21. Yadav, M., Singh, S. & Yadava, S. Čištění, charakterizace a depolymerizační aktivita lignin peroxidázy z Lenzitus betulina MTCC-1183. Appl. Biochem. Microbiol. 48, 583–589 (2012).

22. Mohan, S., Viruthagiri, T. & Arunkumar, C. Aplikace Plackett-Burmanova designu pro screening složek média pro produkci tannázy z programových slupek pomocí submerzní fermentace. Int. J. Pharm. Res. Rev. 2, 24–29 (2013).

23. Woo, SH, Cho, JS, Lee, BS & Kim, EK Odbarvení melaninu ligninperoxidázou z Phanerochaete chrysosporium. Biotechnol. Bioprocess. Ing. 9, 256 (2004).

24. Karp, JM a kol. Kultivace lidských embryonálních kmenových buněk bez kroku embryoidního těla zvyšuje osteogenezi in vitro. Stem Cells 24, 835-843 (2006).

Potvrzení

Autorské příspěvky

Konkurenční zájmy

vydavatelstvíPoznámkaSpringer Nature zůstává neutrální ohledně jurisdikčních nároků v publikovaných mapách a institucionálních přidruženích.

Další informace: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501