Abstraktní:Tato studie byla provedena za účelem objasnění inhibičních účinků cykloheterofylinu na syntézu melaninu. Pro objasnění inhibičních účinků cykloheterofylinu na buněčnou linii B16F10 byla měřena životaschopnost buněk, exprese mediátorové ribonukleové kyseliny (mRNA), test aktivity tyrosinázy a test produkce melaninu. Byly stanoveny účinky cykloheterofylinu na expresi mRNA proteinu 1 souvisejícího s tyrosinázou (TYRP1)/TYRP2/tyrosináza (TYR)/mikroftalmie-asociovaný transkripční faktor (MITF) a obsah melaninu. Kvantitativní RT-PCR v reálném čase ukázala, že cykloheterofylin snížil hladinu exprese mRNA genů TYRP1/TYRP2/TYR/MITF a obsah produkce melaninu než buňky B16F10 ošetřené -MSH. Test aktivity tyrosinázy odhalil, že cykloheterofylin snížil produkci melaninu v buňkách B16F10. Tato data ukazují, že cykloheterofylin zvyšuje bělící účinky v buňkách B16F10; cykloheterofylin je tedy účinnou složkou pro bělení kůže. Proto by měl být prozkoumán další výzkum mechanismu účinku cykloheterofylinu pro vývoj funkčních materiálů.

Podle relevantních studií je cistanche běžnou bylinou, která je známá jako „zázračná bylina, která prodlužuje život“. Jeho hlavní složkou je cistanosid, který má různé účinky, jako je antioxidační, protizánětlivý a podpora imunitních funkcí. Mechanismus mezi cistanche a bělením kůže spočívá v antioxidačním účinku cistanchových glykosidů. Melanin v lidské kůži vzniká oxidací tyrosinu katalyzovanou tyrosinázou a oxidační reakce vyžaduje účast kyslíku, takže se volné radikály v těle stávají důležitým faktorem ovlivňujícím produkci melaninu. Cistanche obsahuje cistanosid, což je antioxidant a může snižovat tvorbu volných radikálů v těle, čímž inhibuje produkci melaninu.

Klikněte na Jak používat Cistanche

Další informace:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

1. Úvod

Barvu kůže určuje hemoglobin v krvi, pigment melanin v epidermální vrstvě a -karoten v podkoží. Mezi nimi je barva kůže určena především množstvím a distribucí pigmentu melaninu [1]. Melanin je pigment syntetizovaný z melanosomu v melanocytu, který je přítomen v bazální vrstvě. Pohlcuje nebo rozptyluje ultrafialové (UV) paprsky a má příznivou funkci při potlačování poškození kožních buněk nebo kožních tkání. Nadměrná akumulace melaninu však může způsobit skvrny, pihy a pigmentaci. Je známo, že způsobuje hyperpigmentaci [2,3].

Melaninový pigment je reprezentativní dráždidlo, které způsobuje exogenní stárnutí. Vyrábí se melanogenezí melanocytů, které byly vystaveny UV záření, a má příznivou funkci ochrany pokožky před UV zářením tím, že ztmavuje barvu kůže. Melaninový pigment se skládá z eumelaninu (černý) a feomelaninu (červenohnědý) [4,5]. Melanin je produkován použitím L-tyrosinu, typu aminokyseliny, jako substrátu a prostřednictvím L-DOPA (3,4-dihydroxyfenylalanin) a dále oxidován na DOPA-chinon hlavními enzymy tyrosinázou (TYR), tyrosinase-related protein-1 (TYRP1) a TYRP2. DOPA-chinon se dále oxiduje na červenožlutý feomelanin v přítomnosti sulfhydrylových skupin. DOPA-chinon je také dekarboxylován, oxidován a katalyzován na eumelanin, když jsou sulfhydrylové skupiny vyčerpány [4,5]. Enzym tyrosináza je klíčovým enzymem zodpovědným za produkci melaninu a je známo, že extrakt z lékořice, extrakt z japonského dubu, arbutin a kyselina kojová, což jsou reprezentativní bělící materiály, inhibují aktivitu enzymu tyrosinázy [6,7]. Arbutin hraje roli zejména při inhibici aktivity tyrosinázy kompetitivní reakcí s L-tyrosinem, který je surovinou pro melanin, a kyselinou kojovou vázanou na aktivní místo tyrosinázy pomocí Cu2 plus. O kyselině kojové a arbutinu je známo, že mají silné bělící účinky, ale byly hlášeny vedlejší účinky bezpečnostních problémů, jako je podráždění kůže [8,9]. Probíhá mnoho studií s cílem objevit nové účinné materiály, jako je vývoj přírodních funkčních materiálů [8,9].

Cykloheterofylin (C30H30O7), typ prenylflavonu, je hojně obsažen v Artocarpus heterophyllus a bylo popsáno, že má farmakologické a biologické funkce včetně protizánětlivé, protidestičkové aktivity a antioxidační účinnosti [10–13]. Kromě toho se uvádí, že má antioxidační a anti-aging účinky na lidské dermální fibroblasty indukované UV-A [14,15].

Jako takový bylo hlášeno, že cykloheterofylin je účinný u různých onemocnění, ale neexistuje žádný výzkum účinků produkce melaninu cykloheterofylinem. V této studii jsem zkoumal účinky cykloheterofylinu na expresi markerů TYRP1, TYRP2, TYR a MITF v buňkách B16F10, melanomové buněčné linii odvozené od myší, související s mechanismem produkce melaninu.

2. Výsledky a diskuse

Pro stanovení cytotoxicity cykloheterofylinu v buněčné linii B16F10 byl proveden test CCK{{0}}. K měření životaschopnosti buněk byly přidány různé koncentrace cykloheterofylinu (obrázek 1). Při ošetření koncentrací 20 ug/ml nebo více bylo potvrzeno, že míra přežití buněk B16F10 významně poklesla ve srovnání s kontrolní skupinou. Když byl přidán cykloheterofylin v koncentraci 10 ug/ml, míra přežití buněk B16F10 byla podobná jako u kontrolní skupiny. Proto byl v dalších experimentech přidán cykloheterofylin v koncentracích 10, 1 a 0,1 ug/ml.

Enzym tyrosináza reaguje s L-tyrosinem za vzniku L-DOPA a L-DOPA nakonec produkuje melaninový pigment prostřednictvím DOPAchinonu tyrosinázou, která je známá jako klíčový enzym regulující melanogenezi [4,5]. V tomto experimentu byla kyselina kojová použita jako pozitivní kontrola pro hodnocení stupně inhibice aktivity enzymu tyrosinázy. Stupeň inhibice aktivity enzymu tyrosinázy byl potvrzen ošetřením cykloheterofylinem v koncentracích 10, 1 a 0,1 µg/ml. Bylo potvrzeno, že aktivita enzymu tyrosinázy byla inhibována způsobem závislým na koncentraci cykloheterofylinem (obrázek 2). U skupin léčených cykloheterofylinem v koncentracích 10, 1 a 0,1 ug/ml bylo potvrzeno, že inhibiční účinky enzymu tyrosinázy byly 58,0, 27,4 a 16,9 procent, v daném pořadí.

UV paprsky stimulují keratinocyty v epidermis, aby indukovaly expresi - melanocyty-stimulujícího hormonu (-MSH), hormonu, který stimuluje melanocyty a je vylučován mimo buňku, a vylučovaný -MSH stimuluje melanocyty. Vazbou na receptor melanokortinu 1 (MC1R) indukuje signalizaci související se syntézou melaninu v buňce, což způsobuje produkci melaninového pigmentu [5]. V tomto experimentu bylo k indukci produkce melaninu v buňkách B16F10 použito 200 nM -MSH k indukci produkce melaninu v buňkách B16F10 [16]. RT-PCR v reálném čase hladin exprese genů TYRP1, TYRP2, TYR a MITF, což jsou markery, které jsou zvýšeny ošetřením -MSH, byla stanovena ošetřením cykloheterofylinem v buňkách B16F10 ošetřených -MSH. Buňky B16F10 byly ošetřeny cykloheterofylinem a exprese markeru byla potvrzena pomocí RT-PCR v reálném čase. V důsledku toho bylo potvrzeno, že exprese TYRP1, TYRP2, TYR a MITF byly významně sníženy ve skupině léčené cykloheterofylinem ve srovnání se skupinou léčenou -MSH. Konkrétně v experimentální skupině léčené 10 ug/ml cykloheterofylinu se exprese genů TYRP1, TYRP2, TYR a MITF snížila o 53,3, 26,6, 58 a 34 procent, v daném pořadí (obrázek 3). V experimentální skupině léčené 1 ug/ml cykloheterofylinu bylo potvrzeno, že exprese markerů byla významně snížena a exprese genů TYRP1 a TYRP2 byla podobně snížena ve skupině léčené cykloheterofylinem v dávce 0,1 ug/ml.

Po potvrzení, že léčba cykloheterofylinem snížila hladinu exprese mRNA markeru souvisejícího s melanogenezí, byla potvrzena rychlost produkce melaninového pigmentu, aby se určilo, zda byla produkce melaninového pigmentu v B16F10 buňkách podstatně snížena (obrázek 4). . Buněčné linie B16F10 ošetřené cykloheterofylinem v koncentracích 10, 1 a 0,1 ug/ml, v daném pořadí, byly sklizeny a byl potvrzen stupeň produkce melaninu. V důsledku toho bylo potvrzeno, že produkce melaninového pigmentu byla významně snížena cykloheterofylinem v koncentracích 10 a 1 ug/ml (obrázek 4A). Navíc bylo potvrzeno, že produkce melaninového pigmentu ve stavu léčeném cykloheterofylinem byla snížena ve srovnání s kontrolní skupinou (obrázek 4B). Když bylo přidáno 10 a 1 ug/ml cykloheterofylinu, rychlost produkce melaninového pigmentu se snížila o 44,6 a 37,8 procent, v daném pořadí, což bylo významně sníženo ve srovnání s kontrolní skupinou (obrázek 4B). Tyto výsledky mají tendenci být v souladu s experimentálními výsledky RT-PCR v reálném čase na hladinách exprese mRNA markerů spojených s melanogenezí.

Antioxidanty, jako je kyselina askorbová, jsou známy jako důležitý bělící materiál, který inhibuje syntézu melaninových pigmentů redukcí DOPAchinonu, meziproduktu během procesu výroby eumelaninu, na L-DOPA [16,17]. U cykloheterofylinu byly také popsány antioxidační účinky [11,12]. Ukázalo se, že cykloheterofylin může být účinný při bělení s tímto antioxidačním účinkem. V důsledku potvrzení antioxidačního účinku in vitro prostřednictvím tohoto testu vychytávání radikálů DPPH bylo potvrzeno, že má antioxidační účinek srovnatelný s účinkem kyseliny askorbové, což je pozitivní kontrola při vysoké koncentraci cykloheterofylinu (obrázek 5). V budoucnu by měl být proveden další výzkum antioxidačních účinků cykloheterofylinu v melanocytech a exprese antioxidačních enzymů, jako je kataláza, SOD1, SOD2 a SOD3.

3. Materiály a metody

3.1. Experimentální materiály a buněčné kultury

Buněčná linie B16F10 byla zakoupena od Korean Cell Line Bank (Korea) a buněčným kultivačním médiem bylo 10% fetální bovinní sérum (FBS, SFBU-0500, Equitech-bio, Kerrville, TX, USA) v Dulbeccově modifikovaném Eagleově médiu (DMEM , LM 001–05, Welgene, Gyeongsan-si, Korea), a bylo přidáno 1 procento penicilinu/streptomycinu (Gibco, 15140–122, Waltham, MA, USA). Buňky byly kultivovány v inkubátoru při 37 ◦C a 5 procentech CO2 [16]. Cykloheterofylin použitý v tomto experimentu byl extrahován z Artocarpus heterophyllus za použití DMSO a zakoupen od ChemFaces Co. (CFN97748, Wuhan, Čína, čistota větší nebo rovna 98 procentům).

3.2. Cell Viability Assay

životaschopnost byla hodnocena pomocí roztoku CCK-8 (souprava pro počítání buněk; EZ−3000, EZ-Cytox, Seoul, DoGen). Buněčné linie B16F10 byly nasazeny do kultivačního média v hustotě 2 x 104 buněk/96jamkové destičky. Po 24 hodinách byl přidán cykloheterofylin (CFN97748, Chemfaces). Buněčná linie B16F10 ošetřená cykloheterofylinem byla inkubována 24 hodin a roztok CCK-8 byl přidán po dobu 30 minut v inkubátoru při 37 °C. Absorbance byla měřena při 450 nm pomocí čtečky mikrodestiček (Epoch, Winooski, VT, USA, BioTek) a životaschopnost buněk byla vypočtena na základě absorbance kontrolní skupiny bez buněk [16].

3.3. DPPH test

3.4. Aktivita houbové tyrosinázy in vitro

3.5. Kvantitativní reverzní transkripčně-polymerázová řetězová reakce v reálném čase (Q-RT-PCR)

Celková RNA byla izolována pomocí Trizolu (15596018, Carlsbad, CA, USA, Thermo Fisher Scientific). Koncentrace RNA byla stanovena spektrofotometricky (BioTek). Čtyři mikrogramy RNA byly reverzně transkribovány do cDNA pomocí soupravy pro reverzní transkripci ReverTra Ace® (Toyobo, FSQ101, Osaka, Japonsko). Reverzní transkripce byla zastavena přidáním pufru Tris–EDTA (pH 8,0) k celkovému objemu 200 ul roztoku cDNA. Sady TaqMan® Gene Expression Assay byly zakoupeny od Applied Biosystems. Q-RT-PCR byly provedeny podle pokynů výrobce. Stručně, 20 ul směsi Q-PCR obsahovalo 10 ul 2x TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 1 ul 20x Taqman expresního testu (Applied Biosystems) a 50 ng cDNA. Směs Q-PCR reagovala při 95 °C po dobu 20 s a 40krát cyklická reakce (95 °C po dobu 1 s a 60 °C po dobu 20 s) se systémem StepOnePlus (Applied Biosystems). Genová identifikační čísla pro TaqMan expresní test použitý v Q-RT-PCR analýzách jsou uvedena v tabulce 1. Lidský GAPDH (Applied Biosystems) byl použit pro normalizaci variací v množství cDNA z různých vzorků.

3.6. Melaninový soutěžní test

Pro měření množství melaninového pigmentu byla Hosoiova metoda částečně modifikována [17]. Celkem 1 x 105 buněk B16F10 bylo naočkováno do 60mm misky pro tkáňové kultury. Po kultivaci buněk po dobu 24 hodin bylo přidáno 200 nM hormonu stimulujícího melanocyty (-MSH; M4135, Sigma-Aldrich) a cykloheterofylin (10, 1, 0,1 ug/ml) po dobu 72 hodin v každé koncentraci. Po odstranění kultivačního média bylo přidáno 200 ul roztoku NaOH (1N; S8045, Sigma-Aldrich) a inkubováno při 60 °C po dobu 2 hodin, aby se rozpustil melanin. Absorbance byla měřena spektrofotometrem (405 nm, Epoch). Jako pozitivní kontrola bylo použito 100 ug/ml arbutinu (A4256, Sigma-Aldrich). Inhibice produkce melaninového pigmentu byla vyjádřena jako procento množství melaninu produkovaného za podmínek ošetření -MSH. Bylo provedeno nezávisle provedením tří nezávislých experimentů.

3.7. Statistická analýza

4. závěr

UV záření, se kterým se setkáváme v každodenním životě, má prospěšné funkce, jako je syntéza a sterilizace vitaminu D, ale v jiných aspektech způsobuje ztrátu elasticity kůže, vrásky, pigmentaci, erytém, zánět atd., a to řetězovou reakcí reaktivních forem kyslíku [18, 19]. Kromě toho exogenní stárnutí způsobené vnějšími faktory, jako je UV, brání funkci normálních tkání a regeneraci, když je tkáň poškozena v důsledku redukce a poškození základních buněk v živém těle [20,21].

Prostřednictvím této studie bylo možné potvrdit vhodnou koncentraci cykloheterofylinu k léčbě buněk B16F10. Bylo potvrzeno, že koncentrace 10 µg/ml neovlivnila životaschopnost buněk, jak ukazuje obrázek 1. Výsledky měření inhibičního účinku enzymu tyrosinázy na aktivitu potvrdily, že koncentrace cykloheterofylinu 10, 1, a 0,1 ug/ml významně snížilo aktivitu enzymu tyrosinázy (obrázek 2). Kromě toho bylo potvrzeno, že cykloheterofylin významně snížil expresi markerů (TYRP1, TYRP2, TYR a MITF gen) ve srovnání se stavem léčeným -MSH (obrázek 3). Navíc bylo potvrzeno, že cykloheterofylin snižuje množství syntézy melaninu v buňkách B16F10 (obrázek 4). Na základě těchto výsledků vykazuje cykloheterofylin potenciál jako nový kandidát na bělení.

Tato studie je první, která potvrzuje inhibiční účinek cykloheterofylinu na syntézu melaninu a naznačuje možnost inhibice stárnutí kůže způsobeného UV zářením. Kromě toho se zdají být nezbytné další hloubkové jeho účinky na signální mechanismy buněk B16F10, na signální systémy zapojené do bělení a na různé antioxidační enzymy přítomné v melanocytech.

Reference

1. Bonaventura, J.; Domingues, MJ; Larue, L. Buněčné a molekulární mechanismy řídící migraci melanocytů a melanomových buněk. Pigment Cell Melanoma Res. 2013, 26, 316–325. [CrossRef] [PubMed]

2. Gilchrest, BA; Eller, MS DNA fotopoškození stimuluje melanogenezi a další fotoprotektivní reakce. J. Investig. Dermatol. Symp. Proč. 1999, 4, 35–40. [CrossRef] [PubMed]

3. Sugumaran, M. Srovnávací biochemie eumelanogeneze a ochranné role fenoloxidázy a melaninu u hmyzu. Pigment Cell Res. 2002, 15, 2–9. [CrossRef] [PubMed]

4. Ito, S.; Wakamatsu, K. Kvantitativní analýza eumelaninu a pheomelaninu u lidí, myší a jiných zvířat: Srovnávací přehled. Pigment Cell Res. 2003, 16, 523–531. [CrossRef]

5. Yoon, YM; Bae, SH; An, SK; Choe, YB; Ahn, KJ; An, IS Účinky ultrafialového záření na kůži a signální dráhy kožních buněk. Kor. J. Aesthet. Cosmetol. 2013, 11, 417–426.

6. Baek, YS; Ryu, YB; Curtis-Long, MJ; Ha, TJ; Rengasamy, R.; Yang, MS; Park, KH Tyrosinase inhibiční účinky 1,3- difenyl propanu od Brousonetia Kozinski. Bioorg. Med. Chem. 2009, 17, 35–41. [CrossRef]

7. Kim, HJ; Seo, SH; Lee, BG; Lee, YS Identifikace inhibitorů tyrosinázy z Glycyrrhiza uralensis. Planta Med. 2005, 71, 785–787. [CrossRef]

8. Han, NK; Park, CM; Kwon, JC; Joung, MS; Choi, JW Bělící účinek extraktu z Fagopyrum tataricum. J. Soc. Kosmetika. Sci. Korea 2014, 40, 179–186.

9. Kim, BY; Park, SH; Park, BJ; Kim, JJ Bělící účinek extraktu z Androsace umbellate. J. Soc. Kosmetika. Sci. Korea 2015, 41, 21–26.

10. Lin, CN; Lu, CM; Lin, HC; Fang, SC; Shieh, BJ; Hsu, MF Nové protidestičkové složky z rostlin Formosan moraceous. J. Nat. Prod. 1996, 59, 834-838. [CrossRef]

11. Wang, JP; Raung, SL; Tsao, LT; Hsu, MF; Lin, CN Blokáda proteinkinázy C se podílí na inhibici tvorby neutrofilního superoxidového aniontu pomocí cyklometersfylinu. Naunyn. Schmiedeberg Arch. Pharm. 1997, 355, 551–558. [CrossRef]

12. Ko, FN; Cheng, ZJ; Lin, CN; Teng, CM Scavenger a antioxidační vlastnosti prenylflavonů izolovaných z Artocarpus heterophyllus. Volný Radic. Biol. Med. 1998, 25, 160–168. [CrossRef]

13. Jantan, I.; Yasin, YH; Jamil, S.; Sirat, H.; Basar, N. Vliv prenylovaných flavonoidů a chalkonů izolovaných z druhů Artocarpus na agregaci krevních destiček v lidské plné krvi. J. Nat. Med. 2010, 64, 365–369. [CrossRef]

14. Huang, CH; Li, HJ; Wu, NL; Hsiao, CY; Lin, CN; Chang, HH; Hung, CF Fotoprotektivní účinky cykloheterofylinu proti UVA-indukovanému poškození a oxidačnímu stresu u lidských dermálních fibroblastů. PLoS ONE 2016, 11, e0161767. [CrossRef]

15. Shim, JH Účinky cykloheterofylinu proti stárnutí v dermálních fibroblastech ozářených UVA zářením. Kor. J. Pharmacogn. 2019, 50, 285–290.

16. Tomita, Y.; Seiji, M. Mechanismus inaktivace tyrosinázy u myšího melanomu. J. Dermatol. 1977, 4, 245–249. [CrossRef]

17. Panzella, L.; Ebato, A.; Napolitano, A.; Koike, K. Pozdní stadia melanogeneze: Zkoumání chemických aspektů a aplikačních příležitostí. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 1753. [CrossRef]

18. Talwar, HS; Griffiths, CE; Fisher, GJ; Hamilton, TA; Voorhees, JJ Snížené množství prokolagenů typu I a typu III v kůži dospělého člověka poškozeného světlem. J. Invest. Dermatol. 1995, 105, 285–290. [CrossRef]

19. Kim, J.; Lee, CW; Kim, EK; Lee, SJ; Park, NH; Kim, HS; Kim, HK; Char, K.; Jang, YP; Kim, JW Inhibiční účinek extraktu Gynura procumbens na expresi matrix-metaloproteinázy indukovanou UV-B v lidských dermálních fibroblastech. J. Enthnopharmacol. 2011, 137, 427–433. [CrossRef]

20. Kirkwood, TB Pochopení zvláštní vědy o stárnutí. Cell 2005, 120, 437–447. [CrossRef]

21. Jones, DL; Rando, TA Vznikající modely a paradigmata pro stárnutí kmenových buněk. Nat. Cell Biol. 2011, 13, 506–512. [CrossRef] [PubMed]

Další informace: david.deng@wecistanche.com WhatApp:{0}}