Empagliflozin zmírňuje příznaky diabetu a renální tubulární dysfunkce u potkaního modelu diabetu se zvětšenou ledvinou (DEK)

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Ajaka Domon¹, Kentaro KatayamaID¹, Touko Sato², Yuki Tochigi¹, Hiroyuki Tazaki², Hiroetsu SuzukiID^1*

Abstraktní

Pozadí: Inhibitory sodno-glukózového kotransportéru 2 (SGLT2) jsou široce používány ke snížení hyperglykémie. Tato studie zkoumala účinky inhibitoru SGLT2, empagliflozinu, na hyperglykémii u nového potkaního modelu diabetu 2. typu bez obezity se zvětšenouledviny(DEK). Methods: Male DEK rats with non-fasting blood glucose concentrations ≤300 mg/dl and >300 mg/dl byly klasifikovány jako nediabetické a diabetické. Skupiny nediabetických (kontrolní) a diabetických (DM-cont) potkanů ​​byly krmeny standardní potravou po dobu 12 týdnů, zatímco další skupina diabetických (DM-empa) potkanů ​​byla krmena standardní potravou obsahující empagliflozin (300 mg/kg/den) po dobu 12 týdnů. . Byla měřena glykémie, tělesná hmotnost, glukózová tolerance, příjem potravy a vody, objem moči, biochemické parametry plazmy a moči a hustota kostních minerálů a jejichledvinya pankreas byly histologicky analyzovány. Výsledky: Léčba empagliflozinem snížila koncentraci glukózy v krvi a příjem potravy u diabetických potkanů, ale inhibovala ztrátu otěží adeps a vedla k nárůstu tělesné hmotnosti. Empagliflozin zmírnil polyurii a polydipsii, ale zvýšil plazmatické koncentrace celkového cholesterolu, sodíku a celkového proteinu na normální úroveň. Empagliflozin také významně snížil vylučování proteinů a elektrolytů močí a obnovil minerální hustotu kostí a plazmatické koncentrace valinu a isoleucinu na normální hodnoty. Navíc dilatace renálních tubulů aledvinazvětšení nebyly utlumeny ve skupině DM-empa. Závěr: Odpověď potkanů ​​DEK na empagliflozin se lišila od reakce jiných diabetických zvířecích modelů, což naznačuje, že potkani DEK mají jedinečné vlastnosti pro studium a hodnocení mnohočetných biologických účinků inhibitorů SGLT2. Tato zjištění také naznačují, že empagliflozin by mohl zlepšit systémový metabolismus a zlepšitledvinovéfunkce tubulu vdiabetikpodmínky.

Cistanche tubulosa zabraňujeledvinanemoc, klikněte sem a získejte vzorek

Úvod

Celosvětová prevalence diabetu mellitu (DM) stále roste a počet pacientů se odhaduje na 700 milionů do roku 2045 [1]. Asi 90–95 procent těchto pacientů má DM 2. typu, který se vyznačuje progresivním snižováním sekrece inzulinu s inzulinovou rezistencí nebo bez ní [2] a je hlavním rizikovým faktorem renálních a kardiovaskulárních onemocnění [3]. DM 2. typu je hlavní příčinou konečného selhání ledvin (ESRD) s diabetickou nefropatií, nazývanou také diabetickáledvinaonemocnění, která jsou zodpovědná za ESRD u 20–40 procent těchto pacientů [4]. Pacienti s ESRD potřebují k udržení normálního stavu dialýzu nebo transplantaci ledvinyfunkce ledvin. Tyto postupy představují sociální a ekonomickou zátěž pro společnost i jednotlivce a také ovlivňují kvalitu života pacientů [5]. Je proto třeba vyvinout úsilí k prevenci nebo zlepšení DM a diabetické nefropatie [6].

Inhibitory sodno-glukózového kotransportéru 2 (SGLT2) jsou novou třídou antidiabetik, které působí nezávisle na endogenním inzulínu [7]. Inhibitory SGLT2 snižují koncentrace glukózy v krvi inhibicí reabsorpce glukózy v proximálních renálních tubulech [7]. Inhibitory SGLT2 mají také příznivé účinky na renální a kardiovaskulární komplikace DM [8–10] a také zlepšují metabolismus [11], přičemž všechny tyto účinky jsou částečně nezávislé na jejich hypoglykemizujících účincích. Inhibitory SGLT2 navíc zlepšují renální výsledky u pacientů bez DM s chronickým onemocněnímledvinanemoci [12]. Účinky inhibitorů SGLT2, včetně renálních výsledků, se však u pacientů liší [13]. Tyto variace pravděpodobně odrážejí rozdíly v mnoha faktorech, včetně genetické predispozice, metabolického stavu, hemodynamiky a životního stylu.

Nedávno jsme založili nový kmen potkanů ​​s DM 2. typu bez obezity s rozšířenýmiledvina(DEK) od LEA. PET-pet kongenní kmen. U kmene DEK asi 50 procent mužů vykazuje diabetes do 30. týdne věku. Tyto diabetické krysy vykazovaly progresivní snižování plazmatické koncentrace inzulínu v důsledku ztráty pankreatických buněk, zvýšeného renálního parenchymu a výrazného zvětšeníledvinys dilatací renálních tubulů [14]. DEK potkani také vykazovali snížení plazmatických koncentrací celkového cholesterolu (TCHO), celkového proteinu a albuminu [14]. Tyto histologické a metabolické vlastnosti jsou jedinečné pro potkany DEK, odlišují tento model od jiných zvířecích modelů diabetu a naznačují, že potkani DEK by mohli být užiteční pro studium farmakologických účinků antidiabetických léků naledvinya metabolismus. Tato studie proto hodnotila účinky inhibitoru SGLT2, empagliflozinu na ledviny a systémový metabolismus DEK potkanů.

Materials and methods Animals Blood samples were obtained from the tail veins of non-fasting male DEK rats (total n = 33), and glucose concentrations were measured with GLUCOCARD PlushCare (Arkray Inc., Kyoto, Japan). Male DEK rats with non-fasting blood glucose concentrations≤300 mg/dl and >300 mg/dl byly klasifikovány jako nediabetické a diabetické [14]. Všechny krysy byly udržovány za běžných podmínek, včetně cyklu světlo:tma 14:10 h, pokojové teploty 20 ± 2 °C a relativní vlhkosti 50 ± 10 procent. Všechny studie na zvířatech byly schváleny Výborem pro péči o zvířata a použití Nippon Veterinary and Life Science University a byly provedeny v souladu s pokyny Výboru pro péči o zvířata a použití NipponVeterinary and Life Science University.

Male rats with blood glucose concentrations >300 mg/dl ve věku 15–20 týdnů u kmene DEK byly náhodně rozděleny do skupiny s empagliflozinovou dietou (DM-empa) (n=5) a skupiny se standardní dietou (DM-cont) (n {{6} }) do 2–3 týdnů po rozvoji DM. Samci potkanů ​​s non DM (hladina glukózy v krvi byla stále nižší než 300 mg/dl ve věku 30 týdnů) v kmeni DEK byli definováni jako kontrola (n=12). Kontrolní a DM-cont skupiny měly ad libitum přístup k vodě a standardní stravě (CR-LPF, Oriental Yeast Co., Ltd., Tokio. Japan) po dobu 12 týdnů, zatímco krysy ve skupině DM-empa měly ad libitum přístup k vodě a standardní dieta plus empagliflozin (300 mg/kg; Eli Lilly Japonsko; Kobe, Japonsko). Dávka empagliflozinu byla navržena s odkazem na předchozí zprávy [15, 16]. Koncentrace glukózy v krvi mimo lačno, tělesná hmotnost a příjem potravy byly měřeny týdně. Všechny krysy byly usmrceny po 12 týdnech a jejichledvinabyly odebrány vzorky slinivky břišní a krve. Stanovili jsme humánní koncové body pro všechna zvířata, která snížila tělesnou hmotnost o 25 procent nebo vykazovala příznaky spojené s vážným onemocněním. V této studii však nebyli žádní potkani vykazující tak závažné snížení tělesné hmotnosti a nemocného stavu.

Orální test glukózové tolerance (OGTT)

Orální glukózové toleranční testy (OGTT) byly provedeny den po 12týdenním léčebném období, jak je popsáno [14]. Ve stručnosti, krysy byly nalačno po dobu 16 hodin a orálně jim byly podávány 2 g/kg tělesné hmotnosti (BW). Krev byla odebrána z ocasní žíly a koncentrace glukózy byly měřeny 0, 30, 60, 120, 180 a 240 minut po zavedení glukózy. Vzorky krve byly také odebrány z jugulární žíly v anestezii isofluranem kontrolované anestezií pro malá zvířata (TK-7, Biomachinery, Chiba, Japonsko) v 0, 30 a 60 minutách po nanesení glukózy, smíchané s heparinem a odstředěny po dobu 15 minut při 4˚C, aby se získala plazma. Plazmatické koncentrace inzulínu byly měřeny pomocí soupravy LBIS Rat Insulin ELISA Kit (RTU) (Shibayagi, Gunma, Japonsko).

Měření renálních parametrů

Během 12. týdne byli potkani umístěni individuálně v metabolických klecích po dobu 24 hodin a byl měřen objem moči a objem pitné vody [14]. Koncentrace kreatininu (Cre), močovinového dusíku (UN), vápníku (Ca), Na-K-Cl a glukózy (Glu) v moči byly měřeny pomocí Dri Chem 3500V (FUJIFILM, Tokio, Japonsko). Koncentrace proteinů v moči byly měřeny pomocí Protein Assay Rapid Kit Wako II (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Tokio, Japonsko). Krev byla odebrána z kaudální duté žíly v anestezii isofluranem a plazmatické koncentrace UN, albuminu (Alb), celkového proteinu (TP), celkového cholesterolu (Tcho), Ca a Na K-Cl byly měřeny pomocí Dri-Chem 3500V. Plazmatická koncentrace Cre byla měřena pomocí FUJIFILM VET Systems Co., Ltd. (Tokio, Japonsko). Clearance kreatininu (Ccre), glukózy (Cglu), vápníku (Cca), sodíku (Can), draslíku (Ck) a chlóru (Ccl) byly vypočteny pomocí vzorce:

Clearance (Cx) (ml/min/kg)=[koncentrace moči (mg/dl nebo mEq/l) × objem moči (ml/min)] / plazmatická koncentrace (mg/dl nebo mEq/l) / tělesná hmotnost (kg).

Frakční vylučování glukózy (FEglu), vápníku (FEca), sodíku (FEna), draslíku (FEk) a chlóru (FEcl) bylo vypočteno pomocí vzorce:

Vylučování frakcí (FEx) ( procento )=Cx (ml/min/kg) / Ccre (ml/min/kg) × 100.

Koncentrace jaterní vazby na mastné kyseliny (L-FABP) v moči byla měřena pomocí soupravy Mouse/Rat FABP1/L-FABP (R&D Systems, Inc., MN, USA)

Histologie, imunofluorescence a výpočet inzulin-pozitivní oblasti

Zvířata byla usmrcena předávkováním pentobarbitalem sodným po 12 týdnech léčby. TheledvinyZ každého usmrceného potkana byly odebrány a zváženy slinivky břišní. Vzorky tkání byly fixovány 4% paraformaldehydem ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS), zalité v parafínu podle standardních postupů a nařezány na tloušťku 1 μm nebo 4 μm pro periodické barvení – Schiff (PAS) a imunofluorescenční barvení. Renální tubulární dilatace byla hodnocena, jak bylo popsáno dříve [17]. Bylo hodnoceno deset náhodných nepřekrývajících se 40x zvětšených polí kůry ledvin a juxtamedulární oblasti. Tubulární dilatace byla hodnocena na stupnici {{10}}–3, přičemž 0, 1, 2 a 3 značí 0,<5, 5–10,="" and="">10 dilated tubules per field, respectively. Pancreas sections were blocked with 3% bovine serum albumin (BSA) in PBS and incubated overnight at 4˚C with guinea pig anti-insulin polyclonal antibody (1: 100, Abcam K. K., Tokyo, Japan) or mouse anti-glucagon polyclonal antibody (1: 200, Abcam K.K.). The sections were rinsed with PBS and incubated for one hour at room temperature with Alexa Fluor 488 conjugated goat anti-guinea pig IgG antibody (1: 1000, Life Technologies, Carlsbad, CA) or Alexa Fluor 568 conjugated donkey anti-mouse IgG antibody (1: 1000, Life Technologies). After rinsing in PBS, the sections were mounted with ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI (Life Technologies, Carlsbad, CA). Images were acquired with a Biozero BZ-X800 all-in-one fluorescence microscope, (KEYENCE, Tokyo, Japan). Islet areas and insulin-positive areas were measured in >Bylo vypočteno 10 řezů ostrůvků na krysu s použitím softwaru Image J a procento plochy pozitivní na inzulín na plochu ostrůvku.

Kostní denzitometrická analýza femurů

Stehenní kosti byly vyříznuty ze čtyř utracených non-DM kontrolních, tří DM-cont a tří DM-empa potkanů ​​po 12týdenním léčebném období a skenovány systémem micro-CT (Latheta LCT-100, Aloka, Tokio, Japonsko) . Minerální hustota kostí (BMD, mg/cm3) a minerální obsah kostí (BMC, mg) byly vypočteny pomocí softwaru Latheta.

Plynová chromatografie-hmotnostní spektrometrie (GC-MS) analýza aminokyselin v plazmě

Vzorky plazmy byly získány od 30-týdenních kontrolních potkanů ​​a od 27–32 týdnů starých potkanů ​​DM cont a DM-empa po 12-týdenním období léčby. Vzorky plazmy byly ošetřeny soupravou Phenomenex EZ: fast AA analysis kit (Phenomenex, Torrance, CA), s norvalinem použitým jako vnitřní standardy [18]. GCMS-QP2010Plus a software řešení GCMS (Shimadzu, Kyoto, Japonsko) byly použity pro analýzu GC-MS [19].

Statistická analýza

Výsledky, prezentované jako průměr ± standardní chyba (SE), byly porovnány ve dvou skupinách pomocí dvoustranných studentských t-testů a ve více skupinách pomocí Tukey-Kramerových testů. P-hodnota < 0,05="" byla="" považována="" za="" statisticky="">

Výsledek

Obecné stavy spojené s diabetem

Týdenní měření příjmu potravy ukázala, že odhadovaný průměrný denní příjem potravy byl mírně vyšší ve skupině DM-cont než ve skupině DM-empa (36,9±1,5 g vs. 34,3±1.0 g). Odhadovaná denní dávka empagliflozinu ve skupině DM-empa byla 23,7±0,7 mg/kg tělesné hmotnosti (BW). Empagliflozin dramaticky snížil koncentraci glukózy v krvi den po zahájení léčby, ze 404,6±36,3 mg/dl na 143,8±14,6 mg/dl), přičemž hladina glukózy v krvi ve skupině DM-empa byla významně nižší než u DM -kont. skupina během 12-týdenního léčebného období (obr. 1A). Tato hladina u DM-empa se podobala normální kontrole s normální stravou (147.{{40}}±1,2 mg/dl) [14]. BW se postupně zvyšovalo s věkem ve skupině DM-empa, ale ne ve skupině DM-cont (obr. 1B), přičemž konečná BW po 12 týdnech byla 444,6±18,0 g u DM empa a 372,3±26,4 g u DM- pokračovací skupina. Ve stejném věku byla tělesná hmotnost kontrolní skupiny přibližně 533,4±9,8 g [14]. V souladu s nárůstem tělesné hmotnosti zůstaly otěže adeps (1,4±0,2 g) ve skupině s DM-empa, ale ne ve skupině s DM-cont.

Již dříve bylo prokázáno, že postižení potkani DEK vykazují závažnou glukózovou intoleranci, žádnou sekreci inzulínu v reakci na zatížení glukózou a ztrátu buněk [14]. Zkoumali jsme, zda empagliflozin zlepšuje glukózovou toleranci a sekreci inzulínu a zabraňuje ztrátě buněk. Hladina glukózy v krvi po 16 hodinách hladovění byla významně nižší ve skupině DM-empa než ve skupině DMcont, stejně jako hladina glukózy v krvi 60–240 minut po zatížení glukózou (obr. 1C). Časově podmíněná změna glykémie v OGTT u DM-empa se téměř podobala změně u nediabetických kontrolních potkanů ​​kmene DEK [14]. Nicméně glukózou indukovaná sekrece inzulínu se nevyskytla v žádné skupině (obr. 1D). Imunofluorescenční barvení inzulínu v pankreatických ostrůvcích neukázalo žádné nebo slabé inzulínové signály ve skupině s DM-cont a téměř 100 procent pozitivních signálů u kontrolních potkanů, zatímco slabý inzulínový signál, zahrnující 24,2 ± 3,5 procenta na plochu ostrůvku, byl pozorován u tří potkanů ​​v DM-empa skupina (obr. 2).

Metabolické a renální parametry a kostní denzitometrie

Měření metabolických parametrů po 12týdenním léčebném období ukázalo, že příjem potravy byl významně nižší ve skupině s DM-empa než ve skupině s DM-cont jak v relativních (obr. 3A), tak v absolutních (obr. S1) hodnotách. Navíc příjem vody (obr. 3B, obr. S1) a objem moči (obr. 3C, obr. S1) byly asi o 50 procent nižší ve skupině DM-empa než ve skupině s DM-cont.

Na konci 12-týdenního léčebného období byly plazmatické koncentrace Tcho, Cre, Alb, TP a Na významně nižší v DM-cont než v kontrolní skupině, přičemž většina z těchto snížení DM-cont skupina vykazující částečné zotavení ve skupině DM-empa. Zejména plazmatické koncentrace Tcho, TP a Na byly významně vyšší ve skupině DM-empa než ve skupině s DM-cont, ačkoli všechny tyto koncentrace byly nižší u DM-empa než v kontrolní skupině. Plazmatické hladiny Alb a Cre byly také vyšší ve skupině DM-empa než ve skupině DM-cont, ale tyto rozdíly nebyly statisticky významné (tabulka 1). Exkrece glukózy, UN, Ca, Na, K, Cl a proteinu močí byly významně vyšší v DM-cont než v kontrolní skupině, přičemž většina z těchto zvýšení byla zmírněna ve skupině DM-empa. Zejména močové exkrece Glu, UN, Na, K a Cl byly významně nižší u DM-empa než ve skupině DM-cont, ačkoli všechny tyto exkrece byly významně vyšší u DM-empa než v kontrolní skupině. . Zvýšené vylučování Ca a proteinu močí bylo také zmírněno ve skupině DM-empa, bez signifikantního rozdílu mezi DM-empa a kontrolní skupinou (tabulka 2). Kromě Ccre, který se mezi těmito třemi skupinami významně nelišil, byly všechny zkoumané clearance a exkrece frakcí významně vyšší v DM-cont než v kontrolní skupině (tabulka 3). Kromě toho, kromě Cglu a FEglu, které zůstaly vyšší ve skupině DM-empa, byla většina těchto zvýšení ve skupině DM-cont zmírněna ve skupině DM-empa. Zejména Cca, Cna a Ccl byly významně nižší ve skupině DM-empa než ve skupině s DM-cont, ale zůstaly vyšší ve skupině DM-empa než v kontrolní skupině (tabulka 3).

Femorální BMD byla významně nižší ve skupině DM-cont než v kontrolní skupině, přičemž bylo zjištěno, že empagliflozin obnovuje femorální BMD ve skupině DM-empa (tabulka 4). BMC měla tendenci být vyšší ve skupině DM-empa než ve skupině DM-cont, ale rozdíl nebyl statisticky významný (tabulka 4)

Patologie ledvin

Postižení potkani DEK vykazovali progresivní zvětšení ledvin s dilatovanými tubuly [14]. Léčba empagliflozinem sice dramaticky snížila hladinu glukózy v krvi, ale nesnížila

hmotnost ledvin, která byla podobná ve skupinách DM-empa a DM-cont (2,35±0.08 g vs. 2,24 ±0,08 g). Histologické vyšetření ukázalo, že závažná dilatace byla výrazná v renálních tubulech juxtamedulárních oblastí u potkanů ​​DM-cont i DM-empa (obr. 4A). Empagliflozin nezmírnil dilataci v renálních tubulech (obr. 4B a 4C). V souladu s tím byla exkrece L-FABP močí, biomarker renálního tubulárního poškození [20], vyšší u DM-cont a DM-empa ve srovnání s kontrolou a nebyl žádný rozdíl mezi DM-cont a DM-empa ( obr. 4D a 4E). Jak bylo uvedeno dříve [14], u kontrolních, DM-cont a DM-empa se nevyskytla žádná typická glomerulární léze, jako je hypertrofie (obr. 4F).

GC-MS analýza aminokyselin v plazmě

Metabolic profiling using PLS-DA multivariate analysis showed differences in amino acid status among the control, DM-cont, and DM-empa groups (S2 Fig). The loading plot corresponded to a score plot consisting of 24 amino acids (S2 Fig). The variable influences on projection (VIP) parameters are shown in S2 Fig. Amino acids colored red had VIP >1 and were considered to have a relatively high impact for separating these groups. Moreover, statistical analysis of amino acids showed a VIP >1.

Plazmatický sarkosin měl tendenci být vyšší v DM-cont než v kontrolní skupině, přičemž empagliflozin dále zvyšoval plazmatický sarkosin. Naproti tomu plazmatický tryptofan měl tendenci být nižší v DM-cont než v kontrolní skupině, přičemž empagliflozin dále snižoval plazmatický tryptofan (tabulka 5). Hladiny glycinu v plazmě byly podobné v DM-cont a kontrolních skupinách, ale byly významně vyšší v DM-empa než v ostatních dvou skupinách. Koncentrace glutaminu a ornithinu byly významně nižší v DM-cont než v kontrolní skupině a nebyly obnoveny léčbou empagliflozinem. Ve srovnání s kontrolní skupinou byla plazmatická kyselina -aminomáselná významně nižší ve skupině s DM-cont, přičemž empagliflozin dále snižoval její koncentraci. Plazmatické koncentrace valinu a isoleucinu byly významně vyšší v DM-cont než v kontrolní skupině, přičemž tyto koncentrace byly obnoveny na kontrolní úroveň léčbou empagliflozinem.

Diskuse

Inhibitory SGLT2 snižují hladinu glukózy v krvi způsobem nezávislým na inzulinu a vykazují renoprotektivní účinky u pacientů s DM 2. typu i na několika zvířecích modelech [8, 12, 21–23]. Většina studií na zvířatech s inhibitory SGLT2 byla provedena u obézních zvířat s DM 2. typu [22, 24–28]. Mnoho pacientů s DM 2. typu, zejména v Asii, však není obézních [29]. Účinky inhibitorů SGLT2 na pacienty s renálními lézemi nebo neobézním diabetem zůstávají nejasné [29, 30]. Tato studie zkoumala účinky empagliflozinu na metabolismus, renální funkce a histopatologii u DEK potkanů, což je nový neobézní diabetický potkaní model s predispozicí ke zvětšení ledvin [14]. Ve srovnání s diabetickými zvířecími modely s obézními se fenotyp diabetických potkanů ​​DEK vyznačoval progresivním snižováním plazmatické koncentrace inzulínu v důsledku ztráty pankreatických buněk spíše než inzulínovou rezistencí, takže diabetické potkany DEK vykazovaly snížení tělesné hmotnosti a tuku s progrese DM. Diabetičtí potkani DEK navíc vykazovali zvýšený renální parenchym a výrazné zvětšení ledvin s dilatací renálních tubulů [14].

Inhibitory SGLT2 podporují využití tuku, svalů a aminokyselin jako zdrojů energie [31–33], čímž snižují tukovou hmotu a tělesnou hmotnost u obézních lidí a zvířat [28, 34, 35]. U neobézních diabetických hlodavců léčených inhibitory SGLT2 byl také pozorován úbytek tukové hmoty a snížení přírůstku hmotnosti [31]. Navíc jak lidé, tak hlodavci léčení inhibitory SGLT2 vykazovali kompenzační hyperfagii k udržení jejich energetické a nutriční rovnováhy [27, 32, 36]. V této studii léčba empagliflozinem snížila hladiny glukózy v krvi u potkanů ​​DEK během 24 hodin, přičemž tyto nižší koncentrace se udržely během 12-týdenního léčebného období, podobně jako v jiných studiích s inhibitory SGLT2 [15, 24]. Na rozdíl od předchozích zjištění [27, 28, 36] jsme zjistili, že léčba empagliflozinem snížila příjem potravy a zmírnila ztrátu otěží adeps a inhibici přírůstku BW. Tento neočekávaný výsledek byl pravděpodobně spojen se zlepšením energetické bilance. Zpočátku bylo vylučování glukózy močí významně nižší u DM-empa než u DM-cont potkanů, ačkoli výrazně vyšší Cglu ve skupině DM empa bylo výsledkem úplné inhibice reabsorpce glukózy, přičemž FEglu bylo téměř 100 procent. Toto zjištění bylo dále podpořeno signifikantním snížením vylučování UN močí, parametru proteinového katabolismu, navzdory normální hladině BUN ve skupině DM-empa [37]. Navíc zvýšení plazmatického TP a snížení proteinu v moči ve skupině DM-empa ukázaly, že empagliflozin zlepšil retenci proteinů. Retence a využití glukózy a návrat z katabolického do asimilovaného stavu u potkanů ​​léčených empagliflozinem může být způsoben jeho úspěšnou kontrolou hladin glukózy v krvi.

Bylo prokázáno, že inhibitory SGLT2 zvyšují objem moči, přičemž zvýšení tubulární reabsorpce kompenzuje ztráty tělesných tekutin a elektrolytů [21, 25, 38]. Ihned po zahájení léčby inhibitory SGLT2 je proto objem moči zvýšen, ale dlouhodobá léčba může snížit objem moči i příjem vody [38, 39]. Přestože hladina Cre v plazmě byla významně nižší u DM-cont a DM-empa než v kontrolní skupině, Ccre se významně nelišila mezi kontrolní skupinou, DM-cont a DM-empa skupinami. Protože u DEK-DM potkanů ​​nebyly žádné zjevné důkazy o glomerulární hypertrofii [14], glomerulární hyperfiltrace se u DM-cont mohla objevit jen stěží nebo byla mírná. Navíc zvětšená ledvina se zvýšeným parenchymem může mít zvýšený počet nefronů, což naznačuje, že zvětšená ledvina u DM-cont i DM-empa může souviset se sníženými hladinami Cre v plazmě. Snížený objem moči ve skupině s DM-empa proto mohl být důsledkem zlepšení reabsorpce vody v renálních tubulech, nikoli snížené rychlosti glomerulární filtrace. Celkově bylo zvýšené vylučování elektrolytů močí ve skupině DM-cont zeslabeno ve skupině DM empa, což ukazuje, že snížené plazmatické koncentrace elektrolytů ve skupině DM-cont byly oslabeny léčbou empagliflozinem prostřednictvím zlepšení renální tubulární funkce. Tato hypotéza byla podpořena konzistentním snížením jejich clearance se sníženým vylučováním frakcí ve skupině DM-empa.

Bylo popsáno, že inhibitory SGLT2 mají škodlivé účinky na kost [31, 40]. Protože osteoporóza je běžnou komplikací DM, porovnávali jsme BMD a BMC ve třech skupinách potkanů. BMD a BMC byly významně nižší ve skupině DM-cont než v kontrolní skupině, ale tato snížení byla zmírněna ve skupině DM-empa. Navíc tato zvýšení BMD a BMC ve skupině DM-empa byla doprovázena snížením vylučování Ca močí. Protože hladiny Ca v plazmě jsou přísně regulovány, nebyly mezi kontrolní skupinou, skupinou DM-cont a DM-empa žádné významné rozdíly v hladinách Ca v plazmě. Tato zjištění naznačují, že negativní bilance Ca ve skupině DM-cont může být kompenzována mobilizací a z kosti do oběhu, přičemž tento stav je částečně zmírněn zlepšenou renální tubulární funkcí Ca ve skupině DM-empa.

Útlum hypoproteinémie ve skupině DM-empa mohl být důsledkem zlepšení proteinurie. Ačkoli glomerulární hyperfiltrace a hypertrofie nebyly jasně prokázány ve skupině DM-cont, snížená hladina glukózy v krvi může snížit glomerulární filtraci Alb. Navíc zlepšení tubulární reabsorpce proteinů a aminokyselin mohlo přispět k syntéze plazmatických proteinů v játrech. Postižení potkani DEK se vyznačují nízkou plazmatickou koncentrací Tcho [14]. Protože zvýšená produkce Alb je doprovázena zvýšenou produkcí Tcho v játrech [41], vyšší plazmatické hladiny Tcho u skupiny DM-empa mohou být spojeny se zvýšenou produkcí Alb v játrech. To může být důsledkem zvýšených dodávek aminokyselin a energie souvisejících se zlepšením retence bílkovin a energetické rovnováhy.

Homeostáza rozvětvených aminokyselin (BCAA) je do značné míry určována katabolickou aktivitou BCAA ve tkáních [42], přičemž defekty v homeostáze BCAA jsou považovány za index inzulinové rezistence nebo diabetického stavu [43–45]. Naše GC-MS analýza aminokyselin ukázala, že plazmatické koncentrace valinu a isoleucinu u DM-empa potkanů ​​byly stejné jako u nediabetických kontrolních potkanů, což naznačuje, že léčba empagliflozinem zlepšila proteinový katabolismus a diabetické stavy. Kromě toho jsme pozorovali, že zvýšení hladiny glycinu v plazmě specifické pro empagliflozin bylo spojeno se zlepšením diabetu. Je zajímavé, že nízká hladina glycinu v plazmě byla pozorována u lidského diabetu [46] a bylo zjištěno, že podávání glycinu vyvolává antioxidační a renoprotektivní účinky u potkanů ​​s diabetem vyvolaným streptozotocinem [47]. Vyšší hladiny glycinu v plazmě mohou být proto spojeny se zmírněním oxidačního stresu a diabetické nefropatie u diabetických pacientů a experimentálních zvířat léčených empagliflozinem. Plazmatické hladiny aminokyselin jsou ovlivněny jejich využitím tkáněmi a orgány v celém těle a závisí na anabolických a katabolických podmínkách. Jsou zapotřebí další studie, aby se zjistilo, jak změny v hladinách těchto a dalších aminokyselin souvisí s metabolickým stavem.

Inhibitory SGLT2 vykazují renoprotektivní účinky tím, že potlačují několik procesů spojených s onemocněním ledvin, jako je albuminurie a zvýšená hmotnost ledvin [15, 24, 48, 49]. Dilatace renálních tubulů a proteinurie jsou markery poškození ledvin souvisejícího s diabetem [50]. Empagliflozin však nebyl schopen potlačit dilataci renálních tubulů a zvýšené vylučování L-FABP močí v našem potkaním modelu, ale významně zlepšil tubulární funkci. Tento rozpor naznačoval, že zlepšení tubulární funkce spojené s empagliflozinem bylo výsledkem menších nebo sekundárních účinků, které nebyly doprovázeny organickými změnami v renálních tubulech. Alternativně, protože tubulární dilatace s poraněním a zvýšená hmotnost ledvin byly zachovány v normoglykemických podmínkách u postižených DEK potkanů, tyto změny mohly být spíše genetickými rysy souvisejícími s diabetem u DEK potkanů ​​než sekundárními k hyperglykémii.

Přestože se inhibitory SGLT2 zaměřují na renální tubuly, o účincích těchto látek na celkové změny funkce renálních tubulů je známo jen málo, kromě toho, že glomerulární hypertrofie zahrnuje tubulární kotransport sodíku s glukózou [13, 22, 24]. Studie účinků inhibitorů SGLT2 na tubulární funkci ukázaly, že reabsorpce vody byla nejen potlačena osmotickou diurézou, ale byla zvýšena upregulací aquaporinu a transportéru močoviny dosud neurčeným mechanismem [21, 25]. Renální tubulární epiteliální buňky diabetických pacientů jsou ovlivňovány nejen osmotickým tlakem glukózy přítomné v tubulární tekutině, ale také přebytkem glukózy a sodíku vstřebaného do buněk prostřednictvím SGLT2. V poslední době byl oxidační stres v renálních tubulech považován za důležitý pro progresi diabetické nefropatie (DN) a ipragliflozin vykazoval renoprotektivní účinky prostřednictvím prevence nadprodukce ROS v renálních tubulech [51]. Přestože u postižených potkanů ​​DEK nebyla zjištěna žádná závažná progrese DN, oxidativní stres může narušit tubulární funkci. V současné době neexistuje jednotný konsenzus o účincích inhibitorů SGLT2 na tubulární funkci, což naznačuje potřebu dalších studií k objasnění mechanismu, kterým empagliflozin zlepšuje tubulární funkci u DEK potkanů.

Bylo zjištěno, že inhibitory SGLT2 zachovávají buněčnou hmotu u modelů DM 1. typu a obézních DM 2. typu [52, 53]. Ve skupině DM-empa jsme detekovali buňky se slabými inzulínovými signály, ale žádné buňky ve skupině DM-cont. OGTT však vykazovala mírné zlepšení glukózové tolerance bez sekrece inzulínu ve skupině DM-empa. Vzhledem k tomu, že empagliflozin má krátký poločas asi 8 hodin, snížené hladiny glukózy v krvi pozorované po 16hodinovém hladovění a zlepšení glukózové tolerance nebyly způsobeny účinky zbytkového empagliflozinu. Tato zjištění tedy naznačují, že dlouhodobé podávání empagliflozinu může zlepšit metabolismus glukózy a mírně snížit hladinu glukózy v krvi po jednorázovém zatížení glukózou způsobem nezávislým na inzulínu.

Závěrem lze říci, že výsledky této studie naznačují, že empagliflozin zlepšuje systémový metabolismus a renální tubulární funkci u potkanů ​​DEK, ačkoli podrobné mechanismy, které jsou základem jedinečné reakce těchto zvířat na empagliflozin, zůstávají nejasné. Tato zjištění také naznačují, že DEK potkani jsou užitečným modelem pro studium a hodnocení mnohočetných biologických účinků inhibitorů SGLT2 u diabetu.

Reference

1. Mezinárodní diabetologická federace. IDF Diabetes Atlas 9. vyd. Brusel, Belgie 2019.

2. Americká diabetická asociace. Klasifikace a diagnostika diabetu. Část 2. Standardy lékařské péče u diabetu-2019. Péče o diabetes. 2019; 42 (Suppl 1): S13–S28.

3. Zheng Y, Ley SH, Hu FB. Globální etiologie a epidemiologie diabetes mellitus 2. typu a jeho komplikací. Nat Rev Endocrinol. 2018; 14(2):88-98.

4. Lin CC, Li CI, Liu CS, Lin WY, Lin CH, Yang SY, a kol. Vývoj a validace modelu predikce rizika pro terminální onemocnění ledvin u pacientů s diabetem 2. typu. Sci Rep. 2017; 7(1):10177.

5.Valderra´bano F, Jofre R, Lo´pez-Go´mez JM. Kvalita života u pacientů s terminálním onemocněním ledvin. Am J Kidney Dis. 2001; 38(3):443–64.

6. Hala PM. Prevence progrese diabetické nefropatie. Diabetes Spectr. 2006; 19(1): 18–24.

7. Hsia DS, Grove O, Cefalu WT. Aktualizace inhibitorů kotransportérů sodíku a glukózy-2 pro léčbu diabetes mellitus. Curr Opin Endokrinol Diabetes Obes. 2017; 24(1):73–79.

8. Perkovic V, Jardine MJ, Neal B, Bompoint S, Heerspink HJL, Charytan DM, et al. Kanagliflozin a renální výsledky u diabetu 2. typu a nefropatie. N Engl J Med. 2019; 380(24):2295–2306.

9. Sarafidis PA, Tapas A. Empagliflozin, kardiovaskulární výsledky a mortalita u diabetu 2. typu. N Engl J Med. 2016; 374(11):1092.

10. Wiviott SD, Raz I, Bonaca MP, Mosenzon O, Kato ET, Cahn A, et al. Dapagliflozin a kardiovaskulární výsledky u diabetu 2. N Engl J Med. 2019; 380(4):347–357.

11. Brown E, Rajeev SP, Cuthbertson DJ, Wilding JPH. Přehled mechanismu účinku, metabolického profilu a hemodynamických účinků inhibitorů kotransportérů sodíku a glukózy-2. Diabetes Obes Metab. 2019; 21 Suppl 2:9–18.

12. Heerspink HJL, Stefansson BV, Chertow GM, Correa-Rotter R, Greene T, Hou FF a kol. Zdůvodnění a protokol randomizované kontrolované studie Dapagliflozin a prevence nežádoucích účinků u chronického onemocnění ledvin (DAPA-CKD). Transplantace nefrolového číselníku. 2020; 35(2):274–282.

13.Bae JH, Park EG, Kim S, Kim SG, Hahn S, Kim NH. Účinky inhibitorů sodno-glukózového kotransportéru 2 na renální výsledky u pacientů s diabetem 2. typu: Systematický přehled a metaanalýza randomizovaných kontrolovaných studií. Sci Rep. 2019; 9(1):13009.

14. Domon A, Katayama K, Tochigi Y, Suzuki H. Charakterizace nového modelu neobézních potkanů ​​s diabetem 2. typu se zvětšenými ledvinami. J Diabetes Res. 2019; 2019:8153140. PMID: 31467929

15. Vallon V, Gerasimova M, Rose MA, Masuda T, Satriano J, Mayoux E, et al. Inhibitor SGLT2 empagliflozin snižuje renální růst a albuminurii v poměru k hyperglykémii a zabraňuje glomerulární hyperfiltraci u diabetických myší Akita. Am J Physiol Renální Physiol. 2014; 306(2): F194–204.

16. Vickers SP, Cheetham SC, Headland KR, Dickinson K, Grempler R, Mayoux E, et al. Kombinace inhibitoru sodno-glukózového kotransportéru-2 empagliflozinu s orlistatem nebo sibutraminem dále zlepšuje redukci tělesné hmotnosti a glukózovou homeostázu u obézních potkanů ​​krmených kafeteriální dietou. Diabetes Metab Syndr Obes. 2014; 7:265–75.

17. Glastras SJ, Chen H, The R, McGrath RT, Chen J, Pollock CA, et al. Myší modely diabetu, obezity a souvisejících onemocnění ledvin. PLoS One. 2016; 11(8):e0162131.

18.Badawy AA, Morgan CJ, Turner JA. Aplikace soupravy pro analýzu aminokyselin Phenomenex EZ:faast™ pro rychlé stanovení koncentrací tryptofanu v plazmě a jeho konkurentů vychytávání mozkem pomocí plynové chromatografie. Aminokyseliny. 2008; 34(4):587-96.

19. Michishita M, Saito N, Nozawa S, Furumoto R, Nakagawa T, Sato T a kol. Profilování metabolitů v buňkách tvořících sféru z buněčných linií adenokarcinomu mléčné žlázy psů pomocí plynové chromatografie-hmotnostní spektrometrie. J Vet Med Sci. 2019; 81(9):1238–1248.

20. Kamijo-Ikemori A, Sugaya T, Kimura K. Protein vázající mastné kyseliny v moči při onemocnění ledvin. Clin Chim Acta. 2006; 374(1–2):1–7.