Využití metabolomiky k popisu patofyziologie, která je základem progrese diabetického onemocnění ledvin

Sho Hasegawa^1,2& Reiko Inagi¹

Abstraktní

Účel recenze Diabetikledvinachoroba(DKD), hlavní příčina konečného stádialedvinachoroba, je výsledkem změn metabolické sítě vledvina. Metabolomika je proto účinným nástrojem pro pochopení její patofyziologie, nalezení klíčových biomarkerů a vývoj nové léčebné strategie. V tomto přehledu shrnujeme aplikaci metabolomiky na výzkum DKD.

Nejnovější poznatky Změny v renálním energetickém metabolismu včetně akumulace cyklu trikarboxylových kyselin a metabolitů glukózy jsou pozorovány v časném stádiu DKD a nakonec vedou k mitochondriální dysfunkci u pokročilé DKD. Nerovnováha mitochondriálního štěpení a fúze a dysregulované přeslechy organel mohou přispět k tomuto procesu. Metabolomika navíc identifikovala několik uremických toxinů včetně derivátů fenylsulfátu a tryptofanu jako slibné biomarkery, které zprostředkovávají progresi DKD.

Souhrn Nedávné pokroky v metabolomice objasnily roli dysregulovaného energetického metabolismu a uremických toxinů v patofyziologii DKD. Integrace dat multi-omics poskytne další informace pro identifikaci kritických ovladačů DKD.

Klíčová slovaDiabetikledvinachoroba. Metabolomika. Mitochondrie. Přeslechy organel. Uremictoxin. Biomarker

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche herbadeserticola bráníledvinanemoc, klikněte sem a získejte vzorek

Úvod

Diabetikledvinachoroba(DKD) je komplikací diabetes mellitus a jednou z hlavních příčin konečného stadialedvinachoroba(ESKD) [1]. Vzhledem k tomu, že patofyziologie DKD je komplexní, multifaktoriální a heterogenní, je obtížné vyvinout účinné terapeutické strategie. V posledních letech prokázaly inhibitory sodno-glukózového kotransportéru 2 (SGLT2) v několika klinických studiích silnou ochranu proti progresi DKD [2–6]. Inhibitory SGLT2 snižují spotřebu energie v proximálních tubulech tím, že zabraňují reabsorpci filtrované glukózy, což naznačuje dysregulovaný energetický metabolismus vledvinamůže hrát přímou roli v progresi DKD.

Metabolom je úplný soubor malých molekul nalezených v biologickém vzorku a odráží fenotyp biologických aktivit [7]. Systematická analýza metabolitů se nazývá metabolomika. DKD je způsobena změnami metabolické sítě vledvina, čímž se metabolomika stala účinným nástrojem pro pochopení její patofyziologie, nalezení klíčových biomarkerů a vývoj nové léčebné strategie [8]. V tomto přehledu shrnujeme aplikaci metabolomiky se zaměřením na roli dysregulovaného energetického metabolismu a uremických toxinů v progresi DKD.

Dysregulovaný energetický metabolismus a mitochondriální dysfunkce v DKD

Mitochondrie jsou centry výroby energie. Energetické substráty včetně glukózy, aminokyselin a mastných kyselin vstupují do cyklu trikarboxylových kyselin (TCA) (obr. 1). Cyklus TCA zásobuje elektronový transportní řetězec redukovanými formami nikotinamidadenindinukleotidu (NADH) a flavinadenindinukleotidu (FADH2). Elektronový transportní řetězec, řada elektronových transportérů (komplex I–IV) ve vnitřní mitochondriální membráně, přenáší elektrony z NADH a FADH2 do molekulárního kyslíku. Protonový gradient mezi mitochondriální matricí a mezimembránovým prostorem generovaný během tohoto procesu využívá adenosintrifosfát (ATP) syntetáza k výrobě energie. Tento proces se nazývá mitochondriální dýchání nebo oxidativní fosforylace (OXPHOS).

Mitochondrie jsou hojné v proximálních tubulárních buňkáchledvinykvůli vysokému množství energie potřebné pro reabsorpci glukózy a sodíku. Vzhledem k tomu, že metabolické změny v renálních tkáních vyvolané hyperglykémií a dyslipidémií hrají kritickou roli v progresi DKD, je metabolomika účinnou strategií pro komplexní pochopení dynamiky mitochondrií a energetického metabolismu vledvina[7].

Sharma a kol. analyzovali močový metabolom pacientů s pokročilou DKD a zjistili, že 13 metabolitů bylo u pacientů s DKD významně nižší než u zdravých kontrol [9]. Většina ze 13 metabolitů byla lokalizována nebo transportována do mitochondrií, což naznačuje, že mitochondriální dysfunkce byla spojena s progresí DKD. Ve skutečnosti byla exprese peroxisomového proliferátorem aktivovaného receptor-gama koaktivátoru 1 (PGC1) a cytochromu c snížena v renálních tkáních pacientů s DKD. Kromě toho bylo v exozomech moči získaných od pacientů s DKD méně mitochondriální DNA než v exozomech získaných od zdravých kontrol [9].

Mitochondriální dysfunkce je běžnou charakteristikou ve vývojichronickýledvinachoroba(CKD) (obr. 1). Transkriptomová analýza člověkaledvinavzorky od pacientů s CKD odhalily, že defektní oxidace mastných kyselin (FAO) hrála klíčovou roli ve vývoji fibrózy ledvin [10]. Nedávno jednobuněčné sekvenování RNA fibrotických modelů myší ledviny objasnilo, že narušený energetický metabolismus (FAO a OXPHOS) spojený se špatnou buněčnou diferenciací proximálních tubulů je kritickou hnací silou fibrózy ledvin [11]. Naproti tomu počínající DKD je odlišná od pokročilé DKD z hlediska renálního energetického metabolismu (obr. 1). Li a kol. analyzovali metabolity moči v 6., 8., 10., 12. a 16. týdnu u db/db a kontrolních myší [12]. Koncentrace meziproduktů cyklu TCA, jako je citrát a sukcinát, v moči byly na konci 16. týdne u db/db myší nižší než u kontrol.

Tyto meziprodukty cyklu TCA však vykazovaly postupné zvyšování od 6. týdne do 12. týdne, což naznačuje, že cyklus TCA byl aktivní v časném stadiu DKD. Navíc analýza metabolického toku s izotopově značenou glukózou, pyruvátem a mastnou kyselinou (palmitát) odhalila, že TCA cyklus, glykolýza a toky FAO v renálních tkáních byly vyšší u db/db myší než u kontrolních myší [13].

Zůstává otázkou, kdy a jak zvýšený renální metabolický tok v časném stadiu diabetu nakonec vede k mitochondriální dysfunkci pozorované u pokročilé DKD. Několik studií naznačuje, že akumulace cyklu TCA a meziproduktů glykolýzy jsou toxické a přímo způsobují poškození ledvin. Například sukcinát, meziprodukt cyklu TCA, je ligandem receptoru GPR 91 spřaženého s G proteinem a přispívá ke zvýšení krevního tlaku [14–16] a poškození mitochondrií indukovanému NADPH oxidázou 4 (Nox4) [17, 18] prostřednictvím aktivace systémů renin-angiotenzin-aldosteron. Navíc bylo prokázáno, že fumarát, další metabolit cyklu TCA, se hromadí v ledvinových tkáních myší F1 Akita částečně kvůli Nox4-indukované downregulaci exprese fumaráthydroxylázy, která stimuluje stres endoplazmatického retikula (ER), matrix gen exprese a profibrotická signalizace v ledvinách [19]. Navíc akumulace glukózových metabolitů sorbitolu, methylglyoxalu a diacylglycerolu může vyvolat progresi onemocnění ledvin. Podle proteomických údajů o glomerulech od pacientů s diabetem byly enzymy související s glykolýzou vyšší u jedinců s prodlouženým diabetem, ale bez onemocnění ledvin, než u pacientů s DKD [20]. U těchto pacientů byla upregulována zejména exprese a aktivita pyruvátkinázy M2 (PKM2), která katalyzuje poslední krok glykolýzy. Ve studiích na zvířatech se u podocytově specifických Pkm2-knockout myší s diabetem vyvinula vážná glomerulární poranění. Kromě toho farmakologická aktivace Pkm2 zvrátila hyperglykémií vyvolané zvýšení metabolitů glukózy spolu s prevencí mitochondriální dysfunkce a glomerulárních poškození.

Akumulace cyklu TCA a metabolitů glukózy v renálních tkáních by tedy mohla být terapeutickým cílem v časném stadiu DKD. Tato hypotéza byla dále potvrzena metabolomovou analýzou BTBR ob/ob myší naší skupinou, ve které jsme zjistili, že inhibitory SGLT2 zvrátily akumulaci metabolitů cyklu TCA a snížily oxidační stres v renálních tkáních [21]. K tomuto metabolickému efektu dochází hlavně proto, že inhibitory SGLT2 snižují potřebu energie v proximálních tubulech snížením reabsorpce glukózy a sodíku.

Potenciální přínosy snížení toku cyklu TCA během raného stadia DKD pozorované ve studiích na zvířatech podporují hypotézu, že metabolické přeprogramování inhibitory prolylhydroxylázy indukovatelného faktoru hypoxie (HIF-PH), novými terapeutickými činidly pro renální anémii [22], může zmírnit škodlivé účinky metabolické zátěže u pacientů s počínající DKD. V hypoxickém prostředí se aktivuje HIF a indukuje metabolické přeprogramování z cyklu TCA na glykolýzu, aby se snížila spotřeba kyslíku každou buňkou. Protože inhibitory HIFPH indukují aktivaci HIF v normoxickém prostředí, metabolické přeprogramování může zvrátit akumulaci metabolitů cyklu TCA. V našich studiích na zvířatech byla odhalena transkriptomová a metabolomová analýza renálních tkání

že inhibitory HIF-PH působí proti změnám renálního metabolismu, ke kterým dochází v časných stádiích DKD. Akumulaci cyklu TCA a metabolitů glukózy bylo zabráněno podáváním inhibitorů HIF-PH. Tato metabolická změna byla navíc spojena se zlepšením renálních patologických abnormalit, jako je glomerulární hypertrofie a ztluštění bazální membrány [23]. Naše výsledky nemohou být potvrzeny v klinických podmínkách, protože inhibitory HIF-PH jsou terapeutická činidla používaná pro renální anémii a podávaná pouze u anemických pacientů s pozdním stadiem DKD. Naše studie však naznačuje, že metabolické přeprogramování směrem ke snížení cyklu TCA a akumulace metabolitů glukózy může sloužit jako potenciální zásah, který se zaměřuje na dysregulovaný metabolismus ledvinové energie v časných stádiích DKD.

Přestože jsou zapotřebí další studie k objasnění přesného mechanismu, jak dysregulovaný energetický metabolismus u počínající DKD vede k mitochondriální dysfunkci u pokročilé DKD, jedním z možných mechanismů je nerovnováha mezi mitochondriálním štěpením a fúzí v diabetickém stavu (obr. 1). Mitochondrie neustále mění svou morfologii opakovaným štěpením a fúzí, které jsou regulovány různými molekulami, jako je protein příbuzný dynaminu (Drp1), protein mitochondriálního štěpení 1 (Fis1), mitofusin 1 (Mfn1), mitofusin 2 (Mfn2) a mitochondriální OPA1 dynaminu podobná GTPáza (OPA1). Zvýšení mitochondriálního štěpení je pozorováno v proximálních tubulech DKD ve spojení s poklesem membránového potenciálu, sníženou produkcí ATP a buněčnou apoptózou [24]. Wang a kol. ukázaly, že mitochondriální štěpení je indukováno náborem Drp1 do mitochondrií v podocytech DKD, což je částečně zprostředkováno Rho-asociovanou protein kinázou 1 obsahující spirální spirálu (ROCK1). Delece ROCK1 v podocytech potlačila mitochondriální štěpení a progresi DKD [25]. Mitochondriální štěpení však nemusí být pouze zhoršujícím faktorem, ale také adaptivní reakcí na metabolický stres vyvolaný diabetem. Wang a kol. odhalili, že delece Drp1 v játrech chrání myši před dietou vyvolanou obezitou a metabolickým zhoršením [26]. Mitochondriální štěpení je tedy považováno za kompenzační reakci proti metabolickému stresu a mitochondriální dysfunkce by nastala, když kompenzace dosáhne limitu. Existuje možnost, že metabolické přeprogramování směrem ke snížení cyklu TCA a metabolismu glukózy v diabetickém stavu by mohlo snížit mitochondriální zátěž a zmírnit potřebu adaptivních reakcí včetně mitochondriálního štěpení.

Je zajímavé, že mitochondriální fúzní protein Mfn2 se hluboce podílí na tvorbě kontaktních míst organel mezi ER a mitochondriemi [27] nazývaných mitochondriální asociované membrány (MAM) (obr. 1). Nedávné studie objasnily, že MAM udržují buněčnou homeostázu regulací transportu lipidů a kalciové signalizační transdukce mezi ER a mitochondriemi [28]. Přeslechy organel mezi ER a mitochondriemi by tedy mohly mít důležitou roli v mitochondriální homeostáze včetně rovnováhy štěpení a fúze. Rozluštění interakce mezi metabolickým stresem, mitochondriální homeostázou a přeslechy organel by poskytlo důležité poznatky o tom, jak dysregulovaný energetický metabolismus u počínající DKD vede k mitochondriální dysfunkci u pokročilé DKD.

cistanche stopka přínosy pro ledviny

Uremický toxin jako biomarkery a patologické Faktory v DKD

Vylučování odpadních látek močí se během progrese CKD postupně snižuje. Odpadní látky, které nepříznivě působí na lidský organismus, se nazývají uremické toxiny. Protože většina uremických toxinů jsou metabolity produkované z obsahu potravy střevní mikroflórou [29], metabolomika je silnou strategií k pochopení změn v hladinách uremických toxinů v průběhu onemocnění ledvin, včetně DKD. Niewczasetal analyzoval plazmatické metabolomické profily pacientů s diabetem 2. CKD. Některé plazmatické metabolity včetně p-kresolsulfátu (derivát aminokyseliny), pseudouridinu (derivát nukleotidu) a myo-inositol (derivát sacharidů) byly identifikovány jako uremické soluty spojené s progresí do ESKD po úpravě renálních funkcí a kontrola glukózy v krvi [30]. Kromě toho analyzovali sérové ​​metabolomické profily pacientů s diabetem 1. typu a CKD. Sérové ​​hladiny 7 metabolitů včetně tryptofanu a derivátů tyrosinu byly spojeny s poklesem renálních funkcí a dobou do ESKD, nezávisle na relevantních klinických kovariátech [31]. Ačkoli je obtížné posoudit, zda jsou příčinou nebo výsledkem zvýšené uremické toxiny, nedávná studie naznačuje, že fenylsulfát, jeden z derivátů tyrosinu, je prediktivním markerem a také zprostředkovává progresi DKD [32]. Hladiny fenylsulfátu vykazovaly významnou korelaci s 2-letou progresí albuminurie u diabetických pacientů s mikroalbuminurií. Kromě toho inhibice tyrosinfenol-lyázy, bakteriálního enzymu zodpovědného za produkci fenolu z tyrosinu, snížila hladiny albuminu v moči ve studiích na zvířatech, což naznačuje, že střevní mikroflóra by mohla být terapeutickým cílem.

Deriváty tryptofanu jsou považovány za další slibný terapeutický cíl proti progresi DKD. Sérová hladina kynureninu produkovaného tryptofanem byla spojena se zjevnou proteinurií u DKD [33]. S poklesem funkce ledvin u pacientů s diabetem 2. typu bylo pozorováno zvýšení sérových hladin kynureninu a snížení sérových hladin tryptofanu [34]. Korstanje a kol. ukázali, že glomerulární exprese kynurenin 3-mono-oxygenázy (KMO) byla u pacientů s diabetem snížena [35]. KMO je enzym, který katalyzuje hydroxylaci kynureninu. Ztráta KMO tedy vede ke zvýšení kynureninu a kyseliny kynurenové. Vzhledem k tomu, že KMO knockout myši vykazovaly vymazání chodidel a proteinurii, kynureninová dráha může mít důležitou roli v progresi onemocnění ledvin u pacientů s diabetem.

V budoucnu bude důležitá síťová analýza pomocí multi-omických dat od pacientů. Saito a kol. identifikovali myší dvojitý minutový 2 homolog (MDM2) jako klíčový faktor v patofyziologii DKD integrací svých dat o metabolomech v moči s veřejně dostupnou databází interakcí mezi lidskými proteiny a proteiny [36]. Ve skutečnosti byla exprese genu MDM2 významně snížena v renálních tkáních pacientů s DKD ve srovnání s kontrolami. Navíc podocytově specifické a tubulární Mdm2-knockout myši vykazovaly závažnou glomerulární a tubulární dysfunkci. Integrace omických informací tedy může být dobrou strategií pro identifikaci kritických faktorů ovlivňujících onemocnění ledvin. V ideálním případě by pro komplexní pochopení patofyziologie DKD měla být shromážděna multiomická data ze stejné kohorty pacientů.

Zlepšitledvinafunkcea zmírnit diabetické onemocnění ledvin scistanche herba

Závěry

Nedávné pokroky v metabolomice objasnily roli dysregulovaného energetického metabolismu a uremických toxinů v patofyziologii DKD. Je třeba poznamenat, že energetický metabolický stav ledvin se mezi časným a pozdním stádiem DKD liší.

Rozluštění interakce mezi metabolickým stresem, mitochondriální homeostázou a přeslechy organel v ledvinách je nezbytné pro další pochopení energetické metabolické dynamiky během progrese DKD. Ačkoli metabolomika identifikovala několik uremických toxinů včetně fenylsulfátu a derivátů tryptofanu jako slibné biomarkery, které zprostředkovávají progresi DKD, síťová analýza pomocí multi-omických dat poskytne další informace pro nalezení kritických faktorů ovlivňujících onemocnění ledvin.

FinancováníDivize patofyziologie CKD, University of Tokyo, je finančně podporována Kyowa Kirin. Tato práce byla podpořena výzkumným pracovníkem Grant-in-Aid pro Japonskou společnost na podporu vědy (JSPS) (grant JSPS KAKENHI 19J11928 pro SH), grantem pro začínající vědce (grant JSPS KAKENHI 21K16159 pro SH) , Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (grant JSPS KAKENHI 18H02727 a 21H02824 pro RI), MSD Life Science Foundation (pro SH), The Cell Science Research Foundation (pro SH), Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders ( do RI) a Kyowa Kirin (do RI).

Otevřený přístupTento článek je licencován podle Creative Commons Attribution 4.{1}} Mezinárodní licence, která umožňuje použití, sdílení, adaptaci, distribuci a reprodukci na jakémkoli médiu nebo formátu, pokud uvedete příslušné jméno původního autora (autorů) ) a zdroj, uveďte odkaz na licenci Creative Commons a uveďte, zda byly provedeny změny. Obrázky nebo jiný materiál třetích stran v tomto článku jsou zahrnuty v licenci Creative Commons k článku, pokud není uvedeno jinak v kreditní hranici k materiálu. Pokud materiál není součástí článku

Licence Creative Commons a vaše zamýšlené použití není povoleno zákonnými předpisy nebo překračuje povolené použití, budete muset získat povolení přímo od držitele autorských práv.

kde mohu koupit kůru cistanche:do obchodu Wecistanche

Reference

Dokumenty zvláštního zájmu, které byly nedávno zveřejněny, byly označeny jako:

1. Nichols GA, Deruaz-Luyet A, Hauske SJ, Brodovicz KG. Souvislost mezi odhadovanou rychlostí glomerulární filtrace, albuminurií a rizikem kardiovaskulárních hospitalizací a mortalitou ze všech příčin u pacientů s diabetem 2. typu. J Diabetes Comlicat. 2018;32(3):291–

2. Wanner C, Inzucchi SE, Lachin JM, Fitchett D, von Eynatten M, Mattheus M a kol. Empagliflozin a progrese onemocnění ledvin u diabetu 2. typu. N Engl J Med. 2016;375(4):323–34.

3. Neal B, Perkovic V, Mahaffey KW, de Zeeuw D, Fulcher G, Erondu N, et al. Canagliflozin a kardiovaskulární a renální příhody u diabetu 2. typu. N Engl J Med. 2017;377(7):644–57.

4. Perkovic V, Jardine MJ, Neal B, Bompoint S, Heerspink HJL, Charytan DM, et al. Kanagliflozin a renální výsledky u diabetu 2. typu a nefropatie. N Engl J Med. 2019;380(24):2295–306.

5. Wiviott SD, Raz I, Bonaca MP, Mosenzon O, Kato ET, Cahn A, et al. Dapagliflozin a kardiovaskulární výsledky u diabetu 2. N Engl J Med. 2019;380(4):347–57.

6. Heerspink HJL, Stefansson BV, Correa-Rotter R, Chertow GM, Greene T, Hou FF a kol. Dapagliflozin u pacientů s chronickým onemocněním ledvin. N Engl J Med. 2020;383(15):1436–46.

7. Kalim S, Rhee EP. Přehled renální metabolomiky. Kidney Int. 2017;91(1):61–9.

8. Darshi M, Van Espen B, Sharma K. Metabolomika u diabetického onemocnění ledvin: odhalení biochemie tichého zabijáka. Am J Nephrol. 2016;44(2):92–103.

9. Sharma K, Karl B, Mathew AV, Gangoiti JA, Wassel CL, Saito R a kol. Metabolomika odhaluje signaturu mitochondriální dysfunkce u diabetického onemocnění ledvin. J Am Soc Nephrol. 2013;24(11):1901–12.

10. Kang HM, Ahn SH, Choi P, Ko YA, Han SH, China F, et al. Defektní oxidace mastných kyselin v renálních tubulárních epiteliálních buňkách má klíčovou roli ve vývoji fibrózy ledvin. Nat Med. 2015;21(1):37–46.

11. Dhillon P, Park J, Hurtado Del Pozo C, Li L, Doke T, Huang S a kol. Jaderný receptor ESRRA chrání před onemocněním ledvin spojením metabolismu a diferenciace. Cell Metab. 2021;33(2): 379–94 e8. V jednobuněčné RNA sekvenační analýze myších modelů CKD vykazovaly FAO a OXPHOS v proximálních tubulech nejsilnější asociaci s diferenciací a onemocněním proximálních tubulárních buněk, což potvrzuje kritickou roli energetického metabolismu v progresi CKD.

12. Li M, Wang X, Aa J, Qin W, Zha W, Ge Y a kol. GC/TOFMS analýza metabolitů v séru a moči odhaluje metabolickou poruchu cyklu TCA u db/db myší zapojených do diabetické nefropatie. Am J Physiol Ren Physiol. 2013;304(11): F1317–24.

13. Sas KM, Kayampilly P, Byun J, Nair V, Hinder LM, Hur J a kol. Tkáňově specifické metabolické přeprogramování řídí tok živin u diabetických komplikací. JCI Insight. 2016;1(15):e86976.

14. He W, Miao FJ, Lin DC, Schwandner RT, Wang Z, Gao J a kol. Meziprodukty cyklu kyseliny citronové jako ligandy pro sirotčí receptory spojené s G-proteinem. Příroda. 2004;429(6988):188–93.

15. Toma I, Kang JJ, Sipos A, Vargas S, Bansal E, Hanner F a kol. Sukcinátový receptor GPR91 poskytuje přímé spojení mezi vysokými hladinami glukózy a uvolňováním reninu v myších a králičích ledvinách. J Clin Invest. 2008;118(7):2526–34.

16. Peti-Peterdi J. Vysoké uvolňování glukózy a reninu: role sukcinátu a GPR91. Kidney Int. 2010;78(12):1214–7.

17. de Cavanagh EM, Inserra F, Ferder M, Ferder L. Od mitochondrií k nemoci: role systému renin-angiotensin. Am J Nephrol. 2007;27(6):545–53.

18. Lee DY, Wauquier F, Eid AA, Roman LJ, Ghosh-Choudhury G, Khazim K, et al. Nox4 NADPH oxidáza zprostředkovává peroxynitrit-dependentní odpojení endoteliální syntázy oxidu dusnatého a exprese fibronektinu v reakci na angiotenzin II: úloha mitochondriálních reaktivních forem kyslíku. J Biol Chem. 2013;288(40): 28668–86.

19. You YH, Quach T, Saito R, Pham J, Sharma K. Metabolomics odhaluje klíčovou roli fumarátu při zprostředkování účinků NADPH oxidázy 4 u diabetického onemocnění ledvin. J Am Soc Nephrol. 2016;27(2):466–81.

20. Qi W, Keenan HA, Li Q, Ishikado A, Kannt A, Sadowski T, a kol. Aktivace pyruvátkinázy M2 může chránit před progresí diabetické glomerulární patologie a mitochondriální dysfunkce. Nat Med. 2017;23(6):753–62.