Účinnost a mechanismy vláknité směsi Angelica Sinensis Cistanche pro úlevu od zácpy

Abstraktní:Zácpaje rozšířené onemocnění, které může významně ovlivnit kvalitu života lidí a zvýšit některá související rizika onemocnění. V této studii byl vytvořen myší model achronické zácpy s použitím loperamid hydrochloridu. Myším byla podána žaludeční sondou sloučenina Angelica sinensis Cistanche Fiber Compound, kterou tvoří Dang Gui [Angelica sinensis (Oliv.) Diels],Rou Cong Rong (Cistanche deserticolaY.C.Ma), pšeničná vláknina a nízkomolekulární xylan ve vysoké dávce (3,6 g·kg-1, 30násobek doporučené dávky pro člověka) a nízké dávce (0,6 g·kg{{8} }, 5krát doporučená dávka pro člověka) po dobu 14 dnů. Studie hodnotila terapeutickou účinnost sloučeniny pozorováním fekální morfologie, měřením obsahu vody a prováděním experimentů s pohyblivostí tenkého střeva. Dále byly provedeny testy ELISA (enzyme-linked immunosorbent assays) k vyhodnocení sérových hladin gastrointestinálních hormonů včetně motilinu (MTL), gastrinu (GAS), zánětlivých faktorů interleukinu-1 (IL-1) a faktoru nekrózy nádorů - (TNF-). Histopatologické vyšetření s barvením H&E bylo použito k vyhodnocení poškození tkáně tlustého střeva. Kromě toho byly provedeny Western blot a imunohistochemické experimenty, aby se zkoumaly hladiny exprese aquaporinu-3 (AQP3) a c-Kit v tlustém střevě. Výsledky naznačují, že sloučenina Angelica sinensis Cistanche Fiber Compound by mohla zlepšit morfologii stolice, zvýšit obsah vody ve stolici a zvýšit rychlost průchodu tenkým střevem u myší. Kromě toho došlo k významnému zvýšení sérových hladin gastrointestinálních hormonů a významnému snížení hladin zánětlivých faktorů. Zlepšení histopatologického poškození tlustého střeva bylo doprovázeno výrazným snížením exprese proteinu AQP3 vodního kanálu tlustého střeva a významným zvýšením exprese c-Kit. Tyto výsledky společně naznačovaly přítomnost vztahu dávka-odpověď. Tato zjištění ukazují, že sloučenina Angelicasinensis Cistanche Fiber Compound účinně zmírňuje zácpu u myší. Jeho působení je spojeno s regulací exprese proteinu AQP3 ac-Kit vodního kanálu tlustého střeva spolu s modulací sérových zánětlivých faktorů a gastrointestinálních hormonů. Tento experiment byl schválen Etickým výborem pro experiment na zvířatech Jinan University.

klíčová slova:zácpa; střevní lubrikace a úleva od zácpy; funkční potraviny; dvojtečka; tradiční čínská medicína

JAK DLOUHO TRVÁ, NEŽ CISTANCHE PŮSOBÍ?

Zácpajeběžné gastrointestinální onemocnění. The global prevalence of constipation in the elderly (>60 let) je 18,9 %[1] a prevalence je často vyšší u žen[2]. Vyznačuje se obtížemi při vyprazdňování a častou zácpou. redukce a tvrdnutí stolice atd., což vede k fyzickému nepohodlí a gastrointestinální dysfunkci, a dokonce vyvolává nebo zhoršuje gastrointestinální onemocnění, kardiovaskulární onemocnění [3] atd., což vážně ovlivňuje kvalitu života. Předpisy tradiční čínské medicíny jsou široce používány ke zlepšení zácpy a mají dobré a jednoznačné klinické účinky [4,5]. Vláknitá sloučenina Angelica a Cistanche deserticola použitá v této studii je připravena z Cistanche deserticola, Angelica sinensis, pšeničné vlákniny a xylooligosacharidů. Cistanche deserticola a Angelica sinensis jsou dvě běžně používané tradiční čínské léky v laxativech, které mají vliv na regulaci střevních funkcí a zlepšení zácpy. [6-9], dvě tradiční čínské léky mají stejný původ jako léky a potraviny v mé zemi. Jejich společným použitím lze dosáhnout efektu doplnění čchi a krve a harmonizace jin a jang. Pšeničná vláknina je bohatá na nerozpustnou a rozpustnou vlákninu, která může podporovat střevní peristaltiku a vyprazdňování a často se používá jako pomocný lék k léčbě zácpy; xylo-oligosacharid je funkční oligosacharid, který může regulovat střevní flóru, a tím stimulovat střevní peristaltiku. , zvýšit vlhkost výkalů [10], kombinovat čtyři příchutě a léčit hlavní příčinu onemocnění. Cílem této studie bylo vyhodnotit účinnost této vláknité sloučeniny angeliky a cistanche deserticola na myši se zácpou a prozkoumat její možný mechanismus účinku.

Materiály a metody

Experimentální zvířata: 40 samců myší Kunming třídy bez specifických patogenů (SPF), ve věku 4 až 5 týdnů, bylo zakoupeno od společnosti Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., číslo licence SCXK (Guangdong) 2021-0011, The okolní teplota je 22 ± 2 stupně, vlhkost je 50 % ± 10 % a denní a noční cyklus je 12 h/12 ​​h. Experimentální protokoly a postupy byly v souladu s etickými zásadami používání zvířat a péče o ně a byly schváleny Etickou komisí pro experimentování na zvířatech Jinan University.

Testovaná látka: přípravek z vláken Angelica sinensis a Cistanche deserticola se vyrábí z Angelica Sinensis a Cistanche deserticola, které se extrahují vodou, zahustí, vysuší a rozdrtí, čímž se získá suchý prášek pasty (výtěžek pasty je 52,95 %). Suchá pasta se smíchá s pšeničnou vlákninou a xylo-oligosacharidem pro pozdější použití. Angelica sinensis (číslo šarže 230404CP108) a Cistanche deserticola (číslo šarže 230303CP109) byly zakoupeny od společnosti Hebei Wanxiu Pharmaceutical Co., Ltd. a byly testovány, aby vyhovovaly vydání čínského lékopisu z roku 2020. Xylo-oligosacharidy byly zakoupeny od Shandong Bailong Chuangyuan Biotechnology Co., Ltd. Číslo šarže je 20210829026 a kontrola je v souladu s GB/T35545; pšeničná vláknina pochází od J. Rettenmaier & Söhne GmbH + Co KG a číslo šarže je 07501230126. Na základě dospělého 60 kg je doporučená dávka směsi vlákniny anděliky a cistanche pro člověka 7,118 g·d-1 , z toho dávka pšeničné vlákniny je 3,5 g·d-1. Kompatibilita této sloučeniny je andělika: cistanche: pšeničná vláknina: xylooligosacharidy=2:2:3:2 (dávka kousků odvaru vychází ze surové drogy). Vezměte 30násobek doporučené dávky pro člověka ve skupině s vysokou dávkou a 5násobek doporučené dávky pro člověka ve skupině s nízkou dávkou, respektive 3,6 a 0,6 g·kg-1·d-1. Připravte suspenzi s čistou vodou, dobře promíchejte a odstavte.

Léčiva a činidla Loperamid hydrochlorid (loperamid, LOP), specifikace: Každá tableta obsahuje loperamid hydrochlorid

Amin 2 mg, 12 kapslí/krabička, číslo šarže produktu: MIJ3102, zakoupeno od Xi'an Janssen Pharmaceutical Co., Ltd.; Mosaprid citrátové tablety (Quali), specifikace: Každá tableta obsahuje 5 mg mosaprid citrátu, 24 tablet/krabička, číslo šarže produktu: 25220603, zakoupeno od Lunan Beite Pharmaceutical Co., Ltd.; prášek aktivního uhlí, specifikace: hnědý prášek 200 mesh, číslo šarže A805337, zakoupený od Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.; arabská guma, specifikace: prášek, číslo šarže A108975, zakoupeno od Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.

Absolutní etanol (Tianjin Damao Chemical Reagent Factory, 64-17-5); persíran amonný (Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd., A6295-500g); Tris-Base (FD2010), 5× nanášecí pufr (FD002), -aktinová protilátka (FD0060), kozí anti-králičí sekundární protilátka (FDR007), kozí anti-myší sekundární protilátka (FDM007) a ECL color development kit (FD8020) všechny byly zakoupeny od Hangzhou Fude Biotechnology Co., Ltd.; RIPA lyzační pufr (Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd., P0013B); 4% paraformaldehyd (Biosharp Company, BL539A); Immunohistochemistry kit (Jiangsu KGI Biotechnology Co., Ltd., KGOS60); bicinchoninová kyselina (BCA) souprava pro kvantifikaci proteinů (Thermo Fisher Scientific, SLZ60212); motilin (MTL), gastrin (GAS) a zánětlivé faktory interleukin-1 (IL-1), tumor nekrotizující faktor (tumor necrosis factor-, TNF-) ELISA kit (Shanghai Enzyme Biotechnology Co., Ltd YJ201829, YJ037432, YJ002095, YJ301814); protilátka proti aquaporinu 3 (aquaporin 3, AQP3) (Affinity Company, AF5222); c-Kit protilátka (Cell Signaling Technology, 3074S).

Přístroj: Super čistý vodoměr (Millipore Company, USA, Milli Q); Elektronická váha (Sartorius, Německo)

Společnost, BS224S); Elektronické analytické váhy (Shanghai Benpu Instrument Technology Co., Ltd., FA2204N); Vysokorychlostní chlazená odstředivka (Sigma Company, Německo, 3K15); Čtečka mikrodestiček (Thermo Company, USA, Multiskan Mk 3); Parafinový mikrotom (Leica, Německo) Company, RM2255); Kovová lázeň s konstantní teplotou (Shanghai Yiheng Technology Co., Ltd., TU-100C); Plně automatický rychlý mlýnek vzorků (Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd., JXFSTPRP-24); Přístroj pro elektroforézu (Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd., DYY-6}C); skenovací mikroskop (Precipoint Company, Precipoint M8); chemiluminiscenční zobrazovací systém (Shanghai Tianneng Technology Co., Ltd., Tanon 5200).

Seskupení a vytvoření modelu: 40 myší bylo adaptivně chováno po dobu 5 dnů a poté náhodně rozděleno do negativních kontrolních skupin.

(kontrola), modelová skupina (LOP), skupiny s vysokou a nízkou dávkou sloučeniny (LOP+PF-H, OP+PF-L), pozitivní kontrolní skupina (mosaprid citrát, LOP+MOS). Každý den od 9 do 1 0 ráno bylo všem skupinám kromě negativní kontrolní skupiny podáváno 10 mg·kg-1 loperamid hydrochloridu žaludeční sondou, aby se vytvořil model zácpy u myší, a negativní kontrolní skupině byla podána stejné množství čisté vody sondou. Od 14 do 15 hodin byla skupině s vysokou dávkou a skupině s nízkou dávkou podávána sloučenina 3,6 a 0,6 g·kg-1 a pozitivní kontrolní skupině byl podán mosaprid citrát (MOS) 5 mg·kg{{{{101} 19}}.

negativní kontrolní skupině a modelové kontrolní skupině byla sondou podávána stejná množství čisté vody po dobu 14 po sobě jdoucích dnů.

Stav a charakteristiky výkalů myší byly pozorovány a zaznamenávány během období drogové intervence. Byl zaznamenán základní stav a výkaly myší v každé skupině.

Postavy, vážíme 3x týdně a upravíme dávkování. Ve dnech 3, 7, 10 a 14 po podání byly od každé myši odebrány 3 až 4 pelety čerstvého trusu, okamžitě zváženy a zaznamenány jako vlhká hmotnost, vysušeny v sušárně a zaznamenány jako suchá hmotnost a fekální vlhkost. obsah byl vypočítán. Vypočítejte obsah fekální vlhkosti (%)=(vlhká hmotnost – suchá hmotnost)/vlhká hmotnost × 100 %.

Stanovení hybné funkce tenkého střeva bylo provedeno podle experimentálních metod požadovaných referenční literaturou [11] a "Metodami pro testování a hodnocení funkčních funkcí zdravých potravin (2023 Edition)". Po poslední dávce byly myši v každé skupině nalačno a bez vody po dobu 16 hodin. Modelová skupina, vzorec sloučeniny Skupinám s vysokou a nízkou dávkou a pozitivní kontrolní skupině byla podána žaludeční sondou suspenze loperamid hydrochloridu (10 mg·kg-1) a negativní kontrolní skupině byla podána stejné množství čisté vody sondou. 0.5 h později byly skupinám s vysokou a nízkou dávkou sloučeniny a pozitivní kontrolní skupině podán inkoust (obsahující 5 %) obsahující odpovídající dávky testovaného vzorku (3,6 g·kg-1, 0,6 g·kg-1, resp. 5 mg·kg-1). (prášek aktivního uhlí, 10% arabská guma) a stejná množství inkoustu byla podávána negativním a modelovým skupinám. Zvířata byla usmrcena ihned po 0,5 hodině cervikální dislokací a byla změřena „celková délka tenkého střeva" a „délka postupu inkoustu". Vypočítejte rychlost posunu inkoustu=délka posunu inkoustu (cm)/celková délka tenkého střeva (cm) × 100 %.

K detekci hladin MTL, GAS, TNF- a IL-1 v séru byla odebrána krev z myších očních bulv, centrifugována při 4 stupních, 3 500 r·min-1 po dobu Po 10 minutách bylo odebráno horní sérum a MTL a GAS v myším séru byly stanoveny podle soupravy ELISA. a TNF-, IL-1.

H&E detekuje patologické změny v tkáni tlustého střeva. Tlusté střevo myší se promyje normálním fyziologickým roztokem a inkubuje se ve 4% paraformaldehydu.

Byly fixovány v aldehydu, zapuštěny rutinně po 24 hodinách, nakrájeny, vypáleny a obarveny H&E a patologické změny tkáně tlustého střeva byly pozorovány pod světelným mikroskopem.

K detekci exprese AQP3 a c-Kit v tkáni tlustého střeva byla použita imunohistochemická metoda. Tkáně tlustého střeva myší z každé skupiny byly odebrány.

Parafinové řezy, odparafinování, hydratace, získávání antigenu, blokování endogenní katalázy, blokování 2% kozím sérem, přidání protilátek AQP3 a c-Kit a inkubace přes noc při 4 stupních, fosfátem pufrovaný fyziologický roztok, PBS) po dobu 5 minut Kontrastní barvení hematoxylinem, gradient dehydratace ethanolu, průhlednost xylenu, uzavření neutrální gumy, skenování pod skenovacím mikroskopem a použití softwaru Image J k analýze výsledků.

Pro detekci exprese AQP3 a c-Kit v tkáni tlustého střeva byla použita metoda Western blot. Vezměte 10 mg zmrazené tkáně myšího tlustého střeva a umístěte ji do centrifugační zkumavky se 150 μl RIPA lyzačního pufru obsahujícího 1% inhibitor proteázy. K homogenizaci tkáně použijte rychlý mlýnek. , centrifugujte homogenát nízkoteplotní centrifugou při 10 000 r·min-1 po dobu 10 minut, odeberte supernatant, určete koncentraci proteinu metodou BCA proteinu kvantifikace, smíchejte s nanášecím pufrem, denaturujte protein a analyzovat výsledky podle každého vzorku. Bylo naneseno 30 ug proteinu, podrobeno SDS-PAGE elektroforéze, mokrému přenosu na membránu a poté blokováno 5% sušeným odstředěným mlékem při teplotě místnosti po dobu 1,5 hodiny, promyto třikrát TBST, primární protilátka umístěna na třepačku a inkubována přes noc 4 stupně, poté odstraněny a promyty TBST pufrem Promyjte 3krát roztokem, inkubujte se sekundární protilátkou po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti a poté 3krát promyjte TBST. K vyvolání barev se používá chemiluminiscenční pracovní roztok ECL a k vyvolání plně automatický chemiluminiscenční zobrazovací systém. K analýze výsledků se používá software Image J.

Statistické metody Všechny údaje zahrnuté v tomto experimentu jsou vyjádřeny ve formě průměru ± standardní odchylka. GraphPad Prism byl použit k vynesení experimentálních dat a srovnání mezi skupinami bylo provedeno pomocí jednocestné ANOVA nebo dvoucestné ANOVA; když byly rozdíly mezi skupinami statisticky významné, byla použita metoda nejméně významného rozdílu (LSD). ) Proveďte párová srovnání mezi skupinami a P < 0,05 se považuje za statisticky významný rozdíl.