Účinky kyseliny perfluorooktanové na střevní mikroflóru a mikrobiální metabolity u myší C57BL/6JⅡ

2. Materiály a metody

2.1. Zvířata

Čtyřtýdenní samci myší C57BL/6J bez specifického patogenu byli zakoupeni od Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). Myši konzumovaly pitnou vodu ad libitum. Zařízení pro zvířata na University of Georgia bylo udržováno na 22 ◦C a 40-70% vlhkosti v cyklu světlo:tma 12:12 h. Před experimentem expozice PFOA bylo pět myší umístěno v jedné kleci a myši měnily klece náhodně jednou týdně po dobu čtyř týdnů. Expozice PFOA začala, když bylo myším osm týdnů a doba expozice trvala čtyři týdny. Na začátku experimentu byly myši náhodně přiřazeny do skupiny vystavené PFOA nebo kontrolní skupiny (n=10 myší v každé skupině), s jednou myší v jedné kleci. PFOA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) byl podáván myším prostřednictvím pitné vody. Konečná koncentrace PFOA v pitné vodě byla 1 část na milion (ppm). Dávka byla zvolena na základě naší předchozí studie [24]. Kontrolní myši konzumovaly pitnou vodu bez přidání PFOA. Protokol pro zvířata byl schválen Institutional Animal Care and Use Committee, University of Georgia (kód protokolu: A2014 10-014-Y2-A1).

KLIKNĚTE NA domácí léky na zácpu

2.2. Extrakce metabolitů

Extrakce metabolitů byla provedena tak, jak bylo popsáno dříve [25]. Stručně, 20 ul každého vzorku séra bylo extrahováno 225 ul methanolu. Vzorky byly vortexovány po dobu 10 sekund. Poté bylo k výše uvedeným vzorkům přidáno 750 ul methyl-terc-butyletheru (MTBE) a 188 ul vody, aby se vyvolalo oddělení fází. Vzorky byly třepány při 4 °C po dobu 6 minut, následovala centrifugace při 14,000× g po dobu 2 minut. Extrakční rozpouštědlo bylo odplyněno a předchlazeno na -20 ◦C. Horní nepolární fáze (350 ul) byla shromážděna a odpařena do úplného sucha pomocí koncentrátoru Labconco Centrivap (Labconco, Kansas, MO, USA). Pro vzorky jater a stolice bylo k 10 mg každého vzorku přidáno 225 ul methanolu a 750 ul LMTBE. Vzorky byly homogenizovány pomocí aGenoGrinder 2010 (SPEX SamplePrep, Metuchen, NJ, USA) při rychlosti 1500 otáček za minutu po dobu 30 °C, poté byly vortexovány a třepány při 4 °C po dobu 6 minut. Poté bylo ke vzorkům přidáno 188 ul vody a následovala centrifugace při 14,000×g po dobu 2 minut. Horní nepolární fáze (350 ul) byla shromážděna a odpařena do úplného sucha. Vysušené vzorky byly poté resuspendovány v 60 ul 4:1 acetonitrilu a vodě (v/v) s vnitřními standardy. Vzorky byly vortexovány, následovala sonikace po dobu 5 minut a centrifugace při 14, 000 x g po dobu 2 minut. Supernatant byl odebrán pro analýzu LC-MS.

2.3. Necílené profilování metabolismu

Necílené metabolomické profilování bylo provedeno, jak bylo popsáno dříve [25]. Systém Vanquish UHPLC (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) byl použit pro separaci metabolitů pomocí Acquity UPLC BEH Amide kolony (150 mm × 2,1 mm × 1,7 µm), která byla spojena s Acquity VanGuard BEH Amide pre- kolona (5 mm x 2,1 mm x 1,7 um, Waters, Milford, MA, USA). Voda kvality LC-MS (100%) s 10mM mravenčanem amonným a 0,125% kyselinou mravenčí (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO , USA) byla použita jako mobilní fáze A. Mezitím byl jako mobilní fáze B použit poměr 95:5 acetonitril: voda (v/v) obsahující 10 mM mravenčan amonný a 0,125 % kyseliny mravenčí. Gradient začínal se 100 % B při 0– 2 min, 70 % Bat 7,7 min, 40 % B v 9,5 min a 30 % B v 10,25 min, následované 100 % B v 12,75–16,75 min. Průtok byl udržován na 0,4 ml/min. Spektra byla shromážděna v pozitivním módu elektrosprejové ionizace (ESI) s použitím Q-Exactive HF (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Rozsah hmotnosti byl nastaven od m/z 60 do 900 s režimem závislým na datech pro získávání MS/MS spekter. Necílená metabolomická nezpracovaná data byla nejprve převedena na soubory ABF pomocí převodníku ABF (https://www.reifycs.com/AbfConverter/ (přístup 6. července 2022)). Pro identifikaci a kvantifikaci metabolitů byla použita MSDIAL verze 5.1.0.1 [26]. Ke zlepšení seznamů vlastností kvality pomocí označení funkcí pro další zpracování dat byl použit nástroj pro optimalizaci seznamu vlastností hmotnostního spektra (MS-FLO) [27]. Knihovny doby uchování m/za Fiehn HILIC MS/MS spektr databáze v MassBank Severní Ameriky byly použity pro identifikaci metabolitů.

2.4. Sekvenování genu 16S rRNA

Celková DNA byla extrahována ze vzorků stolice pomocí PowerSoil® DNA isolationkit (MO BIO Laboratories, Carlsbad, CA, USA), podle instrukcí výrobce. Primery 515F a 806R byly použity pro amplifikaci oblasti V4 16S rRNAgenu. normalizací a čárovým kódem. DNA byla sekvenována na soupravě IlluminaMiSeq v2 s 500 cykly. Údaje o sekvenování genu 16S rRNA byly analyzovány pomocí kvantitativních náhledů do mikrobiální ekologie (QIIME) II [28]. Stručně řečeno, nezpracovaná sekvenační data byla odšumována pomocí DADA2, následovaná výběrem operační taxonomické jednotky (OTU). Jako databáze byla použita SILVA (verze 138), trénovaná klasifikátorem založeným na scikit-learn Naïve-Bayes.

2.5. Statistická analýza

Velikost účinku lineární diskriminační analýzy (LEfSe) byla použita ke stanovení bakteriálních rodů, které s největší pravděpodobností vysvětlovaly rozdíly mezi PFOA a kontrolními skupinami [29]. Pro srovnání metabolitů byl použit Mann-Whitney U test k výpočtu p-hodnot mezi PFOA a kontrolními skupinami. Míra falešných objevů byla použita k opravě vícenásobných srovnání. Metabolity s p-hodnotou < 0.05 byly považovány za významné. Částečná diskriminační analýza metodou nejmenších čtverců (PLS-DA) a analýza obohacení dráhy byly provedeny pomocí MetaboAnalyst 5.0 [30]. MixOmics byl použit pro integrativní analýzu střevní mikroflóry a fekálních metabolitů – jedná se o integrativní rámec pro vícerozměrnou analýzu omických dat [31].

Přírodní bylinná medicína pro zmírnění zácpy-Cistanche

Cistanche je rod parazitických rostlin, který patří do čeledi Orobanchaceae. Tyto rostliny jsou známé pro své léčivé vlastnosti a po staletí se používají v tradiční čínské medicíně (TCM). Druhy Cistanche se vyskytují převážně v suchých a pouštních oblastech Číny, Mongolska a dalších částí Střední Asie. Rostliny cistanche jsou charakteristické svými masitými, nažloutlými stonky a jsou vysoce ceněny pro své potenciální zdravotní přínosy. V TCM se věří, že Cistanche má tonizující vlastnosti a běžně se používá k výživě ledvin, zvýšení vitality a podpoře sexuálních funkcí. Používá se také k řešení problémů souvisejících se stárnutím, únavou a celkovou pohodou. Zatímco Cistanche má dlouhou historii používání v tradiční medicíně, vědecký výzkum jeho účinnosti a bezpečnosti stále probíhá a je omezený. Je však známo, že obsahuje různé bioaktivní sloučeniny, jako jsou fenylethanoidní glykosidy, iridoidy, lignany a polysacharidy, které mohou přispívat k jeho léčivým účinkům.

Wecistanche'scistanche prášek, cistanche tablety, cistanche kapslea další produkty jsou vyvíjeny pomocípoušťcistanchejako suroviny, z nichž všechny mají dobrý vliv na zmírnění zácpy. Specifický mechanismus je následující: Předpokládá se, že Cistanche má potenciální přínos pro zmírnění zácpy na základě jeho tradičního použití a určitých sloučenin, které obsahuje. Zatímco vědecký výzkum konkrétně o účinku Cistanche na zácpu je omezený, předpokládá se, že má více mechanismů, které mohou přispět k jeho potenciálu zmírnit zácpu. Laxativní účinek:Cistanchese již dlouho používá v tradiční čínské medicíně jako lék na zácpu. Předpokládá se, že má mírný projímavý účinek, který může pomoci podpořit pohyby střev a vyvolat zácpu. Tento účinek lze přičíst různým sloučeninám v Cistanche, jako jsou fenylethanoidní glykosidy a polysacharidy. Zvlhčení střev: Na základě tradičního použití se má za to, že Cistanche má zvlhčující vlastnosti, konkrétně zaměřené na střeva. Podpora hydratace a lubrikace střev může pomoci změkčit nástroje a usnadnit průchod, a tím zmírnit zácpu. Protizánětlivý účinek: Zácpa může být někdy spojena se zánětem v trávicím traktu. Cistanche obsahuje určité sloučeniny, včetně fenylethanoidních glykosidů a lignanů, o kterých se předpokládá, že mají protizánětlivé vlastnosti. Snížením zánětu ve střevech může pomoci zlepšit pravidelnost stolice a zmírnit zácpu.