Echinakosid chrání před 6-mitochondriální dysfunkcí indukovanou hydroxydopaminem a zánětlivými reakcemi v buňkách PC12 prostřednictvím snížení produkce ROS

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Yue-Hua Wang,1,2 Zhao-Hong Xuan,3 Shuo Tian,1 a Guan-Hua Du1,2

Parkinsonova nemoc (PD) je neurodegenerativní porucha charakterizovaná progresivní ztrátou dopaminergních (DA) neuronů v substantia nigra. Mitochondriální dysfunkce a zánětlivé reakce se účastní mechanismu poškození buněk u PD. 6-Hydroxydopamin (6-OHDA), analog dopaminu, konkrétně poškozuje dopaminergní neurony.Echinakosid(ECH) je fenylethanoidní glykosid izolovaný ze stonkůCistanche salsa, ukazující řadu neuroprotektivních účinků v předchozích studiích. Tato studie měla prozkoumat jeho účinek proti 6-OHDA-indukované neurotoxicitě a možné mechanismy v buňkách PC12. Výsledky ukázaly, že 6-OHDA snížil životaschopnost buněk, snížil oxidačně-redukční aktivitu, snížil potenciál mitochondriální membrány a vyvolal apoptózu zprostředkovanou mitochondriemi ve srovnání s neošetřenými buňkami PC12. Nicméně,echinakosidléčba významně zmírnila tyto změny vyvolané 6-OHDA. navícechinakosidtaké může významně zmírnit zánětlivé reakce vyvolané 6-OHDA. To ukázal další výzkumechinakosidmohl snížit 6-OHDA-indukovanou produkci ROS v buňkách PC12. Tyto výsledky naznačují, že základní mechanismusechinakosidproti 6-neurotoxicitě vyvolané OHDA se může podílet na zmírnění mitochondriální dysfunkce a zánětlivých reakcí snížením produkce ROS.

1. Úvod

Parkinsonova nemoc (PD)je neurodegenerativní onemocnění charakterizované pomalu progresivní degenerací dopaminových neuronů v substantia nigra pars compacta [1]. Ačkoli jsou neuropatologické znaky PD dobře popsány, etiologie zůstává stále nedefinovaná. Je pozoruhodné, že několik pozorování naznačuje, že mitochondriální dysfunkce se účastní patogeneze PD a degenerace dopaminergních neuronů [2, 3]. Mitochondrie obsahují mnoho redoxních enzymů a přirozeně se vyskytující neúčinnost oxidativní fosforylace vytváří reaktivní formy kyslíku (ROS) [4]. V poslední době přibývající důkazy ze studií na lidech a zvířatech naznačují, že neuronální zánět také významně přispívá k neuronální ztrátě u PD [5].

6-Hydroxydopamin (6-OHDA) je specifický pro dopaminergní neurony v intrastriatálních modelech hlodavců a v některých buňkách [6–11]. Buňka PC12 se stala oblíbeným buněčným modelem pro výzkum PD, protože tato buněčná linie má mnoho charakteristik DAergických neuronů. Byl použit jako in vitro model pro studium PD a pro stanovení účinku ochranných a terapeutických látek. Echinakosid (obrázek 1) je fenylethanoidový glykosid izolovaný a čištěný ze stonkůCistanche salsa[12], parazitická rostlina původem ze severozápadní Číny, která se používá jako pokusný základní mechanismus působení echinakosidu proti poškození v buňkách PC12 vyvolaném 6-OHDA.

2. Materiály a metody

2.1. Materiály. Echinakosid byl získán z Národního institutu pro kontrolu potravin a léčiv (Peking, Čína). RPMI-1640 a fetální bovinní sérum byly získány od Gibco

(Grand Island, NY, USA). 6-OHDA, MTT, 2,7-dichlordihydrofluorescein diacetát, propidium jodid (PI) a resazurin byly zakoupeny od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). ATP bioluminiscenční testovací souprava byla získána od Promega (Madison, USA). 5,5,6,6 -tetrachlor-1,1,3,3 -tetraethyl benzimidazolyl karbocyanin jodid (JC-1) testovací sada byla získána od Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen, Jiangsu, Čína). Cytochrome C ELISA kit a fluorogenní substrát Ac-DVD-AMC byly získány od Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Soupravy IL-1 a IL-6 ELISA byly získány od společnosti Boster Bio-engineer limited company (Wuhan, Čína). Čtečka mikrodestiček Spectramax M5 byla zakoupena od společnosti Molecular Devices (Sunnyvale, CA, USA).

2.2. Buněčná kultura a léčba. Buňky PC12 byly pěstovány v RPMI-1640 doplněném o 10 procent koňského séra a 5 procent fetálního hovězího séra. Podmínky byly udržovány na 37 °C ve zvlhčené atmosféře obsahující 5 procent CO2 [19]. Buňky byly umístěny do 96-jamkových destiček v hustotě 2 x 105 buněk/ml. Po 80% konfluenci byly buňky preinkubovány s různými koncentracemi echinakosidu v médiu RPMI-1640 bez séra po dobu 1 hodiny. Poté byl do jamek přidán 6-OHDA v konečné koncentraci 100 M a inkubován pro další. Po ošetření byly pod mikroskopem pozorovány morfologické změny. Životaschopnost buněk byla hodnocena testem MTT [19]. Stručně, po ošetření byl do každé jamky přidán MTT v konečné koncentraci 0,5 mg/ml a inkubováno po dobu 4 hodin při 37 °C.

2.3. Morfologické změny a test životaschopnosti buněk PC12. Po ošetření byly morfologické změny pozorovány pod mikroskopem. Životaschopnost buněk byla hodnocena testem MTT [19]. Stručně, po ošetření byl do každé jamky přidán MTT v konečné koncentraci 0,5 mg/ml a inkubován po dobu 4 hodin při 37 °C. Poté byl supernatant odstraněn a formazanový produkt byl rozpuštěn ve 100 1 dimethylsulfoxidu za míchání po dobu 15 minut na třepačce mikrotitračních destiček a absorbance byla odečtena při 570 nm pomocí čtečky mikrodestiček Spectramax M5. Doplňková a alternativní medicína založená na důkazech

2.4. Intracelulární stanovení hladiny ATP. Buněčná hladina ATP byla měřena pomocí ATP bioluminiscenční testovací soupravy podle pokynů výrobce. Luminiscence byla monitorována na čtečce mikrodestiček v luminiscenčním režimu po přidání 100 1 luciferinu a luciferázy [20].

2.5. Měření oxidačně-redukční aktivity mitochondrií pomocí resazurinu. Po ošetření byl do jamek přidán resazurin v konečné koncentraci 5 M a intenzita fluorescence byla zkoumána při excitaci 530 nm a emisi 590 nm [21].

2.6. Měření potenciálu mitochondriální membrány JC-1. Potenciál mitochondriální membrány byl měřen pomocí testovací soupravy JC-1 podle pokynů výrobce. Po ošetření bylo kultivační médium odstraněno a naplněno roztokem JC-1 po dobu 15 minut při 37 °C ve tmě. Intenzita fluorescence poměru červená/zelená byla stanovena při excitaci 490 nm a emisi 530 nm (zelené fluorescenční monomery) a 590 nm (červené fluorescenční agregáty) [22].

2.7. Kvantifikace uvolňování cytochromu C. Hladiny cytosolového cytochromu C byly měřeny pomocí soupravy ELISA podle pokynů výrobce [23]. Stručně řečeno, po ošetření byly buňky lyžovány a centrifugovány při 1000 g po dobu 15 minut a poté byl supernatant shromážděn jako cytoplazmatická frakce a použit pro měření uvolňování cytochromu C.

2.8. Stanovení aktivity kaspázy-3. Aktivita Caspase-3 byla provedena podle odkazů s úpravou [24]. Stručně, po ošetření byl do každé jamky přidán lyzační pufr a následovala centrifugace při 12 000 g po dobu 10 minut. Aktivita kaspázy-3 byla testována ve výsledných supernatantech měřením proteolytického štěpení fluorogenního substrátu Ac-DVD-AMC s excitační vlnovou délkou 380 nm a emisní vlnovou délkou 460 nm.

2.9. Test průtokové cytometrie v buňkách PC12. Po ošetření byly buňky trypsinizovány, dvakrát promyty PBS, centrifugovány při 1000 ot./min po dobu 5 minut a poté fixovány 70% ethanolem přes noc při 4 °C. Buňky byly odstředěny a dvakrát promyty PBS, resuspendovány v PBS (obsahujícím 50 g/ml RNázyA), barveny PI v konečné koncentraci 10 M po dobu 30 minut při teplotě místnosti ve tmě a odečteny v průtokovém cytometru při 488 nm excitace [10].

2.10. Měření hladiny IL-1 a IL-6 pomocí testu ELISA. Médium kultivovaných buněk PC12 bylo po ošetření shromážděno a koncentrace IL-1 a IL-6 byly měřeny komerčně dostupnými soupravami ELISA podle protokolu výrobce.

2.11. Stanovení úrovně intracelulárního reaktivního kyslíku. Po inkubaci s 6-OHDA byly buňky naplněny 10M H2DCFH-DA po dobu 30 minut při 37 °C ve tmě. Intenzita fluorescence DCF byla měřena při excitaci

Vlnová délka komplementární a alternativní medicíny založené na důkazech 495 nm a emisní vlnová délka 530 nm na čtečce mikrodestiček [25].

2.12. Statistická analýza. Všechna data jsou vyjádřena jako průměr ± SD. Statistická analýza výsledků byla provedena jednocestnou analýzou rozptylu (ANOVA), následovanou testem. Statistická významnost byla přijata v <>

3. Výsledky

3.1. Účinek echinakosidu na morfologii a životaschopnost buněk v buňkách PC12 poškozených 6-OHDA. Jak je znázorněno na obrázku 2(A), životaschopnost buněk PC12 neměla žádný významný rozdíl při koncentraci 0.1~10 M echinakosidu pro

24 hodin Jak je znázorněno na obrázku 2(B), do 24 hodin po ošetření samotným 6-OHDA prodělala většina buněk PC12 morfologické změny, jako je tvorba puchýřů na membráně a smršťování buněk. Společné ošetření echinakosidem chránilo buňky před poškozením 6-OHDA. Test MTT ukázal, že ošetření buněk PC12 samotným 6-OHDA vedlo k přibližně 25procentnímu snížení přežití buněk během 24 hodin, zatímco společné ošetření {{10}},1M, 1M, a 10 M echinakosidu vykazovaly snížení 6-OHDA-zprostředkované cytotoxicity (vše < 0,01,="" obrázek="">

3.2. Účinek echinakosidu na dysfunkci mitochondrií indukovanou 6-OHDA v buňkách PC12. Hladiny ATP v buňkách byly významně sníženy po 24hodinové inkubaci s 100M 6-OHDA, zatímco souběžná léčba 10M echinakosidem zmírnila 6-OHDA-zprostředkovaný pokles ATP anabolické změny v buňkách PC12 . Výsledky ukázaly, že společná léčba 1 Mand 10 M echinakosidu by mohla významně zmírnit zhoršení oxidačně-redukční aktivity mitochondrií vyvolané 6-OHDA (jak < 0,05,="" tak="" obrázek="">

Jak je znázorněno na obrázku 3(c), léčba 1 00 M 6- OHDA po dobu 24 hodin vedlo k významnému snížení potenciálu mitochondriální membrány ve srovnání s neošetřenou skupinou ( < {="" {11}}.01).="" pokles="" mitochondriálního="" membránového="" potenciálu="" indukovaný="" 6-ohda="" byl="" však="" významně="" zmírněn="" společnou="" léčbou="" 0,1="" m,="" 1="" m="" a="" 10="" m="" echinakosidu="" (vše=""><>

3.3. Anti-mitochondriemi zprostředkovaná apoptóza echinakosidu v buňkách PC12 proti 6-OHDA neurotoxicitě. Výsledky ukázaly, že expozice 6-OHDA vedla ke zvýšení cytosolového cytochromu C o 167 procent oproti neléčené skupině ( < 0.{{10}}1).="" echinakosid="" v="" dávce="" 0,1="" m,="" 1="" m="" a="" 10m="" by="" mohl="" významně="" snížit="" uvolňování="" cytochromu="" c="" do="" cytosolu="" indukované="" 6-ohda="">< 0,05,="">< 0,01="" a="">< 0,01,="" resp.,="" obrázek="">

Aktivita kaspázy{{0}} se zvýšila asi 3.{2}}krát ve srovnání s neléčenou skupinou po 6-expozici OHDA ( < 0.01="" ).="" naproti="" tomu="" společná="" léčba="" 1="" m="" a="" 1="" 0="" m="" echinakosidu="" vykázala="" významný="" pokles="" aktivity="" kaspázy-3="" ve="" srovnání="" s="" buňkami="" ošetřenými="" 6-ohda="" (obě="">< 0,05="" a="" obrázek="" 4(="" b)).pi="" je="" membránová="" permeabilita="" a="" je="" obecně="" vyloučena="" z="" životaschopných="" buněk.="" běžně="" se="" tedy="" používá="" k="" identifikaci="" mrtvých="" buněk="" v="" populaci.="" výsledky="" ukázaly,="" že="" míra="" apoptózy="" byla="" významně="" zvýšena="" po="" 24hodinové="" inkubaci="" se="" 100="" m="" 6-ohda,="" zatímco="" společná="" léčba="" 1="" a="" 10="" m="" echinakosidem="" významně="" snížila="" apoptózu="" indukovanou="" 6-ohda="">< 0,05,="">< 0,01,="" resp.="" obrázek="">

3.4. Protizánětlivý účinek echinakosidu v buňkách PC12 indukovaný 6-OHDA. Výsledky ukázaly, že 6-expozice OHDA vedla ke zvýšení hladiny IL-1 ve srovnání s neléčenou skupinou ( < 0.05;="" obrázek="" 4(a)).="" nicméně="" 10="" m="" echinakosidu="" by="" mohlo="" významně="" snížit="" uvolňování="" il-1="" vyvolané="" 6-ohda="">< 0,05;="" obrázek="">

Úroveň IL{{0}} byla také významně zvýšena ve srovnání s neléčenou skupinou (< 0.01).="" společná="" léčba="" 0,1,="" 1="" a="" 10="" m="" echinakosidu="" však="" všechna="" významně="" snížila="" uvolňování="" il-6="" ve="" srovnání="" s="" buňkami="" ošetřenými="" 6-ohda="" (jak="">< 0,05,="" tak="" obrázek="">

3.5. Vliv ECH na produkci ROS indukovanou 6-OHDA v buňkách PC12. Buňky ošetřené 6-OHDA vykázaly významný nárůst (asi 1,{6}}násobek) intracelulárního ROS ve srovnání s neošetřenými buňkami (< 0.01).="" tento="" nárůst="" byl="" významně="" zmírněn="" společnou="" inkubací="" s="" 0.1,="" 1="" a="" 10="" m="" echinakosidem="">< 0.05,="">< 0.01="" a="">< 0.01,="" resp.;="" obrázek="" 6)="">

4. Diskuze

Echinakosid je jednou z hlavních složek fenylethanoidních glykosidů extrahovaných ze známého tradičního echinakosidu, který má antiapoptotické a neuroprotektivní vlastnosti u neurodegenerativních onemocnění [18]. Studie in vivo uvedla, že echinakosid měl neuroprotektivní účinky a zlepšil chování u myšího modelu dopaminergního poškození neuronů vyvolaného MPTP, zatímco další výzkum odhalil, že echinakosid indukoval downregulaci aktivace kaspázy-3 a kaspázy-8 v MPP plus -indukovaná apoptóza neuronů cerebelárních granulí [16]. Jiná studie in vivo uvádí neuroprotektivní účinky echinakosidu na striatální dopaminergní neurony poškozené 6-OHDA [17]. Nicméně buněčné a molekulární mechanismy, které jsou základem těchto akcí, nejsou plně pochopeny, zejména pro jejich vliv na mitochondriální funkci a zánětlivé reakce. Naše současná studie tedy zkoumala účinky echinakosidu na mitochondriální funkci a zánětlivé reakce, aby objasnila jeho mechanismus proti PD. Výsledky za prvé ukázaly, že echinakosid významně zmírnil 6-OHDA-indukovanou neurotoxicitu v buňkách PC12 prostřednictvím ochrany mitochondriální funkce a protizánětlivého účinku.

Mitochondriální dysfunkce se již dlouho podílí na smrti nigrostriatálních dopaminergních neuronů u Parkinsonovy choroby a jejích experimentálních modelů [26]. Mitochondrie se hluboce podílejí na produkci reaktivních forem kyslíku (ROS) prostřednictvím elektronových nosičů dýchacího řetězce u neurodegenerativních onemocnění [27]. Široká škála ROS vzniká v průběhu normálního metabolismu v biologických systémech, ale jejich akumulace mimo něj

požadované množství může potenciálně poškodit lipidy, proteiny a nukleové kyseliny.

6-OHDA, analog katecholaminu, způsobuje specifickou degeneraci neuronů substantia nigra. Neurotoxicita vyvolaná 6-OHDA je částečně způsobena produkcí ROS [28–32].

OHDA vede k neuronální smrti ovlivněním funkce mitochondrií, včetně snížení produkce ATP, narušení metabolismu ROS a indukce apoptózy [10, 33, 34]. V této studii naše výsledky také ukázaly, že 6-OHDA poškodil mitochondriální oxidačně-redukční funkci, snížil potenciál mitochondriální membrány, indukoval mitochondriemi zprostředkovanou apoptózu a zvýšil produkci ROS v buňkách PC12.

Resazurin je fluorescenční indikátor, který je pouze mezistupněm mezi konečnou redukcí molekulárního kyslíku a cytochromoxidázou. Oxidačně-redukční potenciál resazurinu proto umožňuje téměř úplné fungování dýchacího řetězce, což poskytne přesnější a citlivější indikaci mitochondriální funkce. JC-1 je sonda citlivá na membránový potenciál, která se lokalizuje do vnitřní mitochondriální membrány, kde tvoří buď monomery (zelená) nebo agregáty (červená) na základě potenciálu mitochondriální membrány. Resazurin a JC-1 jsou tedy cennými analytickými nástroji pro zkoumání mitochondriální funkce [35]. Tato studie ukázala, že snížení mitochondriální oxidačně-redukční aktivity a potenciálu mitochondriální membrány může hrát důležitou roli v 6-OHDA-indukované dopaminergní neurotoxicitě. Náš výsledek také ukázal mitochondriální oxidačně-redukční aktivitu a mitochondriální membránový potenciál. Tyto výsledky ukazují, že zlepšení mitochondriální dysfunkce může být lepším způsobem, jak zpomalit progresivní dopaminergní neurodegeneraci běžně spojenou s PD.

Obecně se uznává, že buněčná apoptóza indukovaná 6-OHDA je zprostředkována mitochondriální dysfunkcí, která se vyznačuje uvolňováním cytochromu C a aktivací kaspázy-3 [36]. Apoptotický stimul spouští uvolňování cytochromu C z mitochondrií do cytosolu, kde následně aktivuje kaspázu-3 a další downstream kaspázy. V této studii výsledky ukázaly, že buňky PC12 vystavené 100 uM 6-OHDA zvýšily uvolňování cytochromu C a kaspáza závisle inhibovala uvolňování cytochromu C a aktivaci kaspázy- 3. Tyto výsledky naznačují, že echinakosid by mohl inhibovat mitochondriemi zprostředkovanou apoptózu snížením uvolňování cytochromu C z mitochondrií do cytosolu a aktivace kaspázy-3.

Zánět je neuropatologickým rysem parkinsonských mozků a také v experimentálních modelech onemocnění. Terapeutické strategie zaměřené na snížení zánětu a inhibici produkce těchto zánětlivých faktorů mohou být slibnou neuroprotektivní strategií pro léčbu Parkinsonovy choroby a souvisejících stavů [37]. Několik studií provedených také v mozkomíšním moku a během posmrtné analýzy u pacientů s Parkinsonovou chorobou odhalilo zvýšené hladiny cytokinů, jako je interleukin-1 (IL-1) a interleukin-6 (IL{{4} }), což naznačuje aktivaci aprozánětlivé odpovědi[38, 39]. V této studii výsledky ukázaly, že expozice 100 Mof6-OHDA indukovaného uvolňování IL-1 a IL{10}} v buňkách PC12. Léčba echinakosidem by však mohla v závislosti na dávce inhibovat uvolňování IL-1 a IL-6 vyvolané 6-OHDA. Výsledky naznačují, že snížení zánětlivých reakcí se také účastní mechanismů echinakosidu proti 6-OHDA-indukované neurotoxicitě.

Závěrem lze říci, že výsledky tohoto výzkumu ukázaly, že echinakosid byl schopen blokovat 6-OHDA-indukovanou neurotoxicitu v buňkách PC12 a mechanismy mohou souviset s mitochondriální ochranou a protizánětlivostí prostřednictvím snížení produkce ROS. Informace poskytnuté touto prací budou užitečné k objasnění mechanismu působení echinakosidu na anti-PD. Dospělo se k závěru, že echinakosid může být slibnou terapeutickou možností pro prevenci a léčbu PD.

Střet zájmů

Autoři neuvedli žádný střet zájmů

Poděkování

Tato práce byla podpořena granty od National Natural Science Foundation of China (81473383) a National Science and Technology Major Project (2012ZX09103101-078; 2013ZX09103-001-008; a 2013ZX09102106).