Echinakosid působí protinádorově u rakoviny jater
Mar 31, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Wen Li*, Jing Zhou, Yajie Zhang, Jing Zhang, Xue Li, Qiao Yan, Jiabing Han a Fangdi Hu*
Abstraktní
Pozadí:Echinakosid (ECH) je hlavní účinnou látkou přípravku Cistanches Herba, o kterém je známo, že má terapeutické účinky na metastatické nádory. Účinky ECH na rakovinu jater jsou však stále nejasné. Tato studie měla zkoumat účinky ECH na agresi buněk rakoviny jater.
Metody:Dva typy buněk rakoviny jater Huh7 a HepG2 byly ošetřeny různými dávkami ECH v různých časech a gradientech. Testy MTT a tvorby kolonií byly použity ke stanovení účinků ECH na životaschopnost buněk Huh7 a HepG2. K detekci účinků léčby ECH na invazi, migraci, apoptózu a buněčný cyklus buněk Huh7 a HepG2 byly použity testy Transwell a testy průtokové cytometrie. Analýza Western blot byla použita k detekci účinků ECH na hladiny exprese TGF- 1, smad3, smad7, proteinů souvisejících s apoptózou (kaspáza-3, kaspáza-8) a Cyto C v buňkách rakoviny jater. Vztah mezi miR-503-3p a TGF- 1 byl detekován pomocí bioinformatické analýzy a luciferázového reportérového testu.
Výsledek:Výsledky ukázaly, že ECH inhibovala proliferaci, invazi a migraci buněk Huh7 a HepG2 způsobem závislým na dávce a čase. Navíc jsme zjistili, že ECH způsobila apoptózu buněk Huh7 a HepG2 blokováním buněk v S fázi. Dále bylo zjištěno, že exprese miR-503-3p je snížena v tkáních jaterních nádorů, ale léčba ECH zvýšila expresi miR-503-3p v buňkách Huh7 a HepG2. Kromě toho jsme zjistili, že TGF{10}} byl identifikován jako potenciální cíl miR-503-3p. ECH podpořila aktivaci signální dráhy TGF- 1/Smad a zvýšila hladiny exprese Bax/Bcl-2. Kromě toho by ECH mohla spustit uvolňování mitochondriálního Cyto C a způsobit reakci stupně kaspáz.
Závěry:Tato studie prokazuje, že ECH vykazuje protinádorovou aktivitu prostřednictvím miR{0}}p/TGF- 1/Smad osy u rakoviny jater a poskytuje bezpečné a účinné protinádorové činidlo pro rakovinu jater.
klíčová slova: Echinakosid, rakovina jater, apoptóza, MiR-503-3p, TGF- 1/smad
Cistanche je bezpečný a účinný protinádorový prostředek pro rakovinu jater.
Úvod
Karcinom jater je jedním z nejčastějších maligních nádorů s vysokou incidencí a incidence karcinomu jater rychle roste [1]. Hepatektomie je nejlepším způsobem léčby rakoviny jater u pacientů v raných stádiích [2]. Většina pacientů má však po operaci recidivu a metastázy. Míra 5-letého přežití je pouze asi 3–5 procent [2]. Proto jsou naléhavě zapotřebí nové terapeutické přístupy a činidla.
V posledních několika letech se vývoj léků proti rakovině a výzkum fytochemikálií začaly věnovat etnofarmakologii [3, 4]. Velké množství klinických a experimentálních studií prokázalo, že lékové monomery mohou inhibovat proliferaci, metastázy buněk hepatocelulárního karcinomu, indukovat apoptózu a diferenciaci rakovinných buněk [5]. Cistanches Herba je rostlina patřící do čeledi rostlin, která je v Číně tradiční medicínou a je známá jako "pouštní ženšen" [6]. Cistanches Herba je bohatá na druhy chemických složek a výzkumníci doma i v zahraničí z ní izolovali více než sto sloučenin, včetně fenyletanolových glykosidů, lignanů, cykloalifatických terpenů, cukrů, aminokyselin atd. [7]. Echinacoside (ECH) je hlavní složkou Cistanches Herba a je také obecně považován za její hlavní účinnou látku [6]. V posledních letech studie prokázaly, že ECH může být novou léčebnou možností u agresivních nebo široce metastatických nádorů [8]. Studie zjistily, že ECH může inhibovat rakovinu slinivky břišní, leukémii, rakovinu žaludku, rakovinu endometria a mnoho dalších nádorů [9]. Neexistuje však žádná zpráva o účinku ECH na progresi rakoviny jater.
MiRNA hrají klíčovou roli v post-transkripční regulaci genové exprese (10). Rozsáhlé studie ukázaly, že miRNA úzce souvisí s rakovinou jater [11] a roztroušenou sklerózou. MiR-503-3p je nově objevená miRNA, která se podílí na proliferaci, migraci a invazi nádorových buněk [12]. Jeho funkce u rakoviny jater je však nejasná. V současné době je výzkum miRNA downstream cílových genů v relativně zralém stadiu, ale mnoho cílových genových lokusů zůstává neobjeveno. Dráha přenosu signálu TGF- 1/Smad3 je zvláště důležitá pro tumorigenezi a vývoj [13]. Bylo zjištěno, že v modelu hepatomu byla aktivována dráha TGF- 1/Smad3, což naznačuje, že dráha TGF- 1/Smad3 hrála významnou roli ve vývoji rakoviny jater [14]. Vysoká exprese dráhy TGF- 1/Smad3 je považována za jeden z klíčových důvodů výskytu rakoviny jater [15]. Aby bylo možné dále prozkoumat základní mechanismus, který zprostředkovával účinky ECH na rakovinu jater, byla zkoumána dráha miRNA/TGF- 1/Smad3.
V této studii jsme hodnotili účinky ECH na progresi buněk rakoviny jater a zjistili jsme, že ECH vykazuje protinádorovou aktivitu prostřednictvím osy miR-503-3p/TGF- 1/Smad u rakoviny jater, a poskytuje bezpečné a účinné protinádorové činidlo pro rakovinu jater.
cistanche tcmje protirakovinná.
Metody a materiály
Materiály
Echinacoside (ECH) (purity>98 procent, monohydrát) byl získán od Hetian Dichen sashing Pharmaceutical Development Co., Ltd (Xinjiang, Čína). Strukturní vzorec byl znázorněn na obr. 1.
Buněčná kultura a transfekce
Buněčné linie lidské rakoviny jater Huh7 a HepG2 byly zakoupeny od FENGHUISHENGWU (Hunan, Čína). Buňky byly kultivovány v DMEM médiu doplněném 10% fetálním bovinním sérem (FBS, Gibco, USA) při 37 stupních v 5% C02 buněčném inkubátoru. MiR-503-3p mimic a miR-NC byly získány od Shanghai Gene Pharmaceutical Co., Ltd. (Shanghai, Čína). Všechny transfekce byly provedeny za použití činidla Lipofectamine 2000 (Invitrogen) podle pokynů výrobce. Po dalších 24–48 hodinách byly transfekované buňky shromážděny a zpracovány pro další studie.
Luciferázový reportérový test
Celková RNA byla extrahována z buněk a TGF- byl amplifikován pomocí WT a MUT primerů. Fragment TGF- 1 byl vložen do pGL3-Bashc luciferázového reportérového vektoru s názvem TGF- -WT-Luc. Vazebná oblast 1 a miR-503-3p byla mutagenizována za vzniku mutantního plasmidu označeného jako TGF- 1-Mut-Luc. TGF 1-WT-Luc a TGF- 1-Mut-Luc byly kotransfekovány do buněk s miR-503-3p mimikem a pRLTK. Buňky byly odebrány 6 hodin po transfekci. Ke stanovení luciferázové aktivity byla použita souprava Dual-Luciferase Reporter Assay Kit (Promega, Madison, WI, USA).
Test buněčného růstu
Buňky Huh7 a HepG2 (2 x 105) byly umístěny do 96-jamkových destiček. Buňky byly poté ošetřeny ECH po dobu 24, 36 a 48 hodin. Poté bylo do každé jamky přidáno 10 ml roztoku MTT a buňky byly inkubovány po dobu 4 hodin. Poté bylo do jamek přidáno 150 ul DMSO. Absorbance při 570 nm byla měřena čtečkou ELISA (Aoweiya, Peking, Čína).
Tvorba kolonie
Z transfekovaných buněk byla připravena jednobuněčná suspenze a kultivována v inkubátoru po dobu 7 dnů. Po odstranění média byly buňky barveny Wrightovým barvivem po dobu 5 minut a poté barveny roztokem barviva Giemsa a roztokem pufru Sorensen fosfomolybdenan (1:9) po dobu 10 minut. Po promytí byly kolonie spočítány pod mikroskopem.
Transwell test
Testy migrace a invaze byly provedeny v komůrkách Transwell (Costar, Badhoevedorp, Te Nether lands) potažených nebo bez Maribel (BD Biosciences) na horním povrchu membrány {{0}}μm (velikost pórů). Pro migrační test byly transfekované buňky Huh7 a HepG2 resuspendovány ve 200 ul média DMEM bez séra a nasazeny do horních komůrek. Pro test invaze byl na membrány horních komůrek předem potažen Matrigel (30 ug/jamka) a další kroky byly stejné jako u testu migrace. Po inkubaci 24 hodin byly buňky, které migrovaly nebo pronikly přes membránu na spodní povrch, fixovány ethanolem a obarveny 0,2% krystalovou violetí. Nakonec byly buňky pozorovány a spočítány v pěti náhodných polích pomocí mikroskopu.
Analýza buněčného cyklu
Buňky Huh7 a HepG2 byly nasazeny do 6-jamkových destiček v hustotě 1×105 buněk/ml. Buňky byly shromážděny po ošetření ECH po dobu 0, 24, 48 hodin. K buňkám Tese byl poté přidán 1 ml ledu předem chlazeného 75% ethanolu, fixovaného na 20 stupňů po dobu 2 hodin. Poté byly buňky přidány s PI barvícím roztokem a inkubovány ve tmě po dobu 15 minut. Buněčný cyklus byl poté analyzován průtokovou cytometrií.
Analýza apoptotických buněk
Buňky byly umístěny do 6-jamkových destiček v hustotě 5 x 105 buněk/jamku. Po odběru byly buňky odstředěny a bylo přidáno 195 ul vazebného roztoku Annexin V-FITC, aby se buňky resuspendovaly. Dále bylo přidáno 5 μl Annexinu V-FITC a 10 μL barvícího roztoku propidium jodidu. Buňky byly inkubovány ve tmě a poté umístěny do ledové lázně.
Cistanche chrání játra.
Kvantitativní reverzní transkripční PCR (qRT‑PCR)
Celkové RNA byly extrahovány činidlem TRIzol (Haigene, Haerbin, Čína). Pro qRT-PCR byl použit systém Te viiA™ 7 PCR v reálném čase. RNA byla reverzně transkribována do cDNA pomocí soupravy BeyoRT™ First Strand cDNA Synthesis Kit (Beyotime Institute of Biotechnology). U6 byl použit jako endogenní kontrola [16]. Sekvence primerů byly následující:
miR-503-3p: vpřed: 5′-CTGATGGTTAAGAGAATGT-3′,
miR-503-3p: reverzní: 5′-GTCCTTGGACATCCGGGCCG-3′,
U6: vpřed: 5′-GACAGATTCGGTCTGTGGCAC-3′,
U6: zadní strana: 5′-GATTACCCGTCGGCCATCGATC-3′.
Western blot analýza
Transfekované buňky byly shromážděny a celkové proteiny byly extrahovány. Koncentrace proteinu byly stanoveny pomocí soupravy BCA Protein Assay Kit. Vzorky proteinů byly odděleny 10% SDS-PAGE a přeneseny na polyvinylidenfluoridovou membránu. Membrána byla poté inkubována s anti-TGF- 1 (1:1000, Shifeng, Šanghaj, Čína), SMAD3 (1:1000, Shifeng, Šanghaj, Čína), SMAD 7 (1:1000, Shifeng, Shanghai, Čína), Bcl-2 (1:1000, Shifeng, Šanghaj, Čína), Bax (1:1000, Shifeng, Šanghaj, Čína), Cyto C (1:1000, Shifeng, Šanghaj, Čína), kaspáza{ {19}} (1:1000, Shifeng, Šanghaj, Čína), kaspáza-8 (1:1000, Shifeng, Šanghaj, Čína) a anti{25}}aktinová protilátka (1:1000, Shifeng, Šanghaj , Čína) přes noc. Membrána byla inkubována s anti-králičí sekundární protilátkou (1:1000, Shifeng, Shanghai, Čína) [17].
statistické metody
Data byla prezentována jako průměr ± standardní odchylka (SD). Všechny statistické analýzy byly provedeny pomocí softwaru SPSS 13.0. Pro srovnání byl použit studentův t-test. p-hodnota < 0.05="" byla="" považována="" za="">
Výsledek
Vliv ECH na aktivitu a proliferaci lidských jaterních rakovinných buněk
Ke zkoumání účinku ECH na funkci lidských jaterních rakovinných buněk byl proveden MTT test a výsledky ukázaly, že buněčná životaschopnost HepG2 (obr. 2a) a Huh7 (obr. 2b) se postupně snižovala se zvyšováním dávky a časem Léčba ECH ve srovnání s kontrolní skupinou (p < 0.01).="" po="" 48="" hodinách="" expozice="" ech="" byla="" životaschopnost="" buněk="" nejnižší,="" proto="" byla="" pro="" další="" experiment="" vybrána="" expozice="" ech="" po="" dobu="" 48="" hodin.="" výsledky="" testu="" tvorby="" kolonií="" ukázaly,="" že="" počet="" kolonií="" buněk="" hepg2="" (obr.="" 2c)="" a="" huh7="" (obr.="" 2d)="" postupně="" klesal="" působením="" ech="" v="" závislosti="" na="" dávce="" ve="" srovnání="" s="" kontrolní="" skupinou="" (p="">< 0="" 0,01,="" p="">< 0,001).="" tyto="" výsledky="" ukazují,="" že="" ech="" hraje="" důležitou="" roli="" v="" buněčné="" aktivitě="" a="" proliferaci="">
Účinky ECH na migraci a invazi lidských buněk rakoviny jater
K dalšímu zkoumání účinku ECH na funkci lidských buněk rakoviny jater byla detekována migrace a invaze buněk. Jak je znázorněno na obr. 3a, b, ve srovnání se skupinou bez léčby ECH byla migrace a invaze buněk Huh7 a HepG2 po léčbě ECH významně snížena v závislosti na dávce (p<0.01,><0.001), suggesting="" that="" ech="" inhibited="" the="" migration="" and="" invasion="" of="" huh7="" and="" hepg2="">
ECH regulovala distribuci a apoptózu lidských buněk rakoviny jater
Za účelem prozkoumání účinku ECH na apoptózu buněk rakoviny jater byla provedena průtoková cytometrie. Jak je znázorněno na obr. 4a, ve srovnání s kontrolní skupinou bylo procento buněk Huh7 a HepG2 ve fázi G0/G1 významně sníženo po léčbě ECH v závislosti na dávce (p<0.01), and="" the="" percentage="" of="" huh7="" and="" hepg2="" cells="" in="" the="" s="" phase="" was="" gradually="" increased="" after="" ech="" treatment="" in="" a="" dose-dependent="" manner=""><0.01), but="" there="" was="" no="" change="" of="" the="" percentage="" of="" huh7="" and="" hepg2="" cells="" in="" g2/m="" phase="" after="" ech="" treatment="" (p="">0.05), což ukazuje, že ECH způsobila zástavu S fáze buněk Huh7 a HepG2. Navíc se zvyšováním dávky ECH se rychlost apoptózy buněk Huh7 a HepG2 postupně zvyšovala ve srovnání s kontrolní skupinou (obr. 4b, str.<0.01,><0.001). these="" results="" indicated="" that="" ech="" induced="" the="" apoptosis="" of="" huh7="" and="" hepg2="">
Účinky ECH na dráhu TGF‑ 1/Smad
Je známo, že signální dráha TGF{0}}/Smad se dobře podílí na buněčné apoptóze. Abychom prozkoumali mechanismus ECH-indukované apoptózy v buňkách HepG2. Byla detekována exprese signální dráhy TGF- 1/Smad. Ve srovnání s kontrolní skupinou jsme zjistili, že léčba ECH významně snížila hladiny exprese TGF- 1 a Smad3 na úrovni mRNA (obr. 5a) i proteinu (obr. 5b) a významně zvýšila expresi Smad7 způsobem závislým na dávce na úrovni mRNA i proteinu (str<0.01,><0.001). these="" results="" indicated="" that="" ech="" inhibited="" the="" activation="" of="" the="" tgf-β1/smad="" signaling="">
TGF‑1 byl přímým cílem miR‑503‑3p
Navíc online predikční nástroj Starbase v2. ukázaly, že TGF- 1 byl potenciálním cílem miR-503-3p (obr. 6a). Výsledky testu luciferázového reportérového genu ukázaly, že luciferázová aktivita buněk HepG2 a Huh7 kotransfekovaných miR-503-3p mimikem a TGF- 1-WT byla významně snížena, ale nikoli buněk kotransfekovaných miR{ {10}}p mimic a TGF- 1-MUT (obr. 6b, str<0.01). similarly,="" the="" luciferase="" activity="" of="" hepg2="" and="" huh7="" cells="" co-transfected="" with="" mir-503-3p="" inhibitor="" and="" tgf-β1-="" mut="" was="" signifcantly="" increased,="" but="" not="" the="" cells="" co-transfected="" with="" mir-503-3p="" inhibitor="" and="" tgf-β1-wt="" (fig.="" 6c,=""><0.01). furthermore,="" the="" expression="" levels="" of="" tgf-β1="" were="" signifcantly="" reduced="" in="" the="" mir-503-3p="" mimic="" group="" compared="" with="" that="" in="" the="" nc="" group="" (fig.="" 6d,=""><0.01), but="" signifcantly="" increased="" in="" the="" mir-503-3p="" inhibitor="" group="" (fig.="" 6d,=""><0.05). these="" results="" suggested="" that="" tgf-β1="" was="" a="" direct="" target="" of="" mir-503-3p.="" to="" further="" investigate="" whether="" mir-503-3p="" mediated="" the="" effect="" of="" ech="" on="" liver="" cancer,="" the="" expression="" of="" mir-503-3p="" was="" detected="" in="" liver="" cancer="" tissues="" and="" it="" showed="" that="" the="" expression="" levels="" of="" mir-503-3p="" were="" decreased="" in="" liver="" cancer="" tissues="" compared="" with="" that="" in="" normal="" liver="" tissues="" (fig.="" 6f,=""><0.01). moreover,="" the="" expression="" levels="" of="" mir503-3p="" were="" further="" decreased="" in="" metastasis="" liver="" cancer="" tissues="" than="" that="" in="" nonmetastatic="" liver="" cancer="" tissues="" (fig.="" 6g,=""><0.01). the="" expression="" levels="" of="" mir-503-3p="" in="" hepg2="" and="" huh7="" cells="" were="" gradually="" increased="" after="" ech="" exposure="" (fig.="" 6e,=""><0.05,><0.01). taken="" together,="" these="" results="" suggest="" that="" mir-503-3p/tgf-β1="" may="" mediate="" the="" effect="" of="" ech="" on="" liver="">
Vliv ECH na aktivity cytochromu C a kaspáz
Jak je znázorněno na obr. 7a, ve srovnání s kontrolní skupinou jsme zjistili, že léčba ECH vyvolala významný pokles úrovní exprese Bcl-2 v závislosti na dávce (p<0.01,><0.001), while="" the="" expression="" levels="" of="" bax="" were="" signifcantly="" increased="" in="" a="" dose-dependent="" manner=""><0.01,><0.001). it="" was="" demonstrated="" that="" bcl-2="" and="" bax="" were="" involved="" in="" ech-induced="" apoptosis="" in="" hepg2="" and="" huh7="" cells.="" in="" addition,="" the="" expression="" levels="" of="" cyto="" c,="" caspase-8,="" and="" caspase-3="" were="" signifcantly="" increased="" in="" hepg2="" and="" huh7="" cells="" (fig.="" 7b,=""><0.01,><0.001), indicating="" that="" the="" release="" of="" cyto="" c="" and="" the="" activation="" of="" caspase-8="" and="" caspase-3="" were="" involved="" in="" ech-induced="" apoptosis="" in="" hepg2="" and="" huh7="">
Diskuse
Chirurgická resekce je hlavní léčebnou metodou u pacientů s karcinomem jater a četnost recidiv a metastáz po resekci jater je vysoká [18, 19]. V této studii jsme zjistili, že ECH má určitý inhibiční účinek na nádory jater a poskytuje bezpečné a účinné protinádorové činidlo pro rakovinu jater. Klinická praxe prokázala, že tradiční čínská medicína dokáže účinně zmírnit klinické příznaky pacientů s rakovinou jater [20]. U ECH studie prokázaly, že ECH má antioxidační, antidepresivní, protizánětlivé, antivirové, protinádorové a antibakteriální účinky [21, 22]. U kolorektálního karcinomu může ECH indukovat apoptózu nádorových buněk up-regulací kaspázy-3 a štěpením enzymů opravujících DNA, aby vyvolala oxidaci DNA [23]. V této studii jsme poprvé zjistili, že ECH vykazuje protinádorovou aktivitu prostřednictvím osy miR 503-3p/TGF- 1/Smad u rakoviny jater.
Mezibuněčnou fázi buněčného cyklu eukaryotických buněk lze rozdělit na G1, S a G2. Regulační body buněčného cyklu v různých obdobích jsou regulovány různými regulačními faktory [24]. Tato studie zjistila, že procento buněk Huh7 a HepG2 ve fázi G0/G1 a G2/M bylo sníženo a procento buněk ve fázi S se zvýšilo po ECH, což naznačuje, že ECH způsobila zastavení fáze S Huh7 a HepG2 buněk. Nerovnováha apoptózy je jedním z hlavních mechanismů lidských nádorů. Bylo popsáno, že protinádorová chemoterapeutická léčiva obecně indukují apoptózu rakovinných buněk a kontrolují progresi rakoviny. V naší studii jsme také zjistili, že ECH by mohla indukovat apoptózu buněk rakoviny jater způsobem závislým na dávce, což naznačuje, že indukce apoptózy rakovinných buněk může být jedním ze základních mechanismů ECH u rakoviny jater.
MiRNA hrají klíčovou roli v regulaci proliferace, cyklu, apoptózy, migrace HCC buněk prostřednictvím interakcí s různými signálními cestami a molekulami [25, 26]. Například bylo zjištěno, že miR-26a je vysoce exprimován v normálních jaterních buňkách, ale v buňkách rakoviny jater je významně downregulován a inhibuje proliferaci [27]. Nadměrná exprese miR-503-3p indukuje apoptózu buněk rakoviny plic a inhibuje buněčnou invazi a migraci [28]. Velké množství studií navíc prokázalo, že signální dráha TGF- 1/Smad hraje klíčovou roli ve vývoji rakoviny jater [7]. Navíc, když rakovina jater pokračuje v progresi, uvádí se, že exprese TGF- 1 se postupně zvyšuje [29]. V této studii jsme zjistili, že ECH snížila TGF- 1 a Smad3 a zvýšila Smad7, což dokazuje, že ECH inhibovala aktivaci signální dráhy TGF- 1/Smad. V této studii jsme zjistili, že exprese miR-503-3p byla snížena v tkáních jaterního nádoru, ale léčba ECH zvýšila expresi miR-503-3p v buňkách Huh7 a HepG2. Kromě toho jsme zjistili, že TGF- 1 byl identifikován jako potenciální cíl miR-503-3p. ECH podpořila aktivaci signální dráhy TGF- 1/Smad a zvýšila hladiny exprese Bax/Bcl-2. Tyto výsledky naznačují, že signální dráha miR-503-3p/ TGF- 1/Smad může zprostředkovat účinky ECH na rakovinu jater. Je známo, že zvýšený poměr Bax/Bcl-2 může způsobit uvolnění Cyto C v mitochondriích do cytoplazmy. Cyto C interaguje s kaspázou-8 a tvoří apoptotické tělo, které následně rekrutuje a aktivuje kaspázu-3, což způsobuje kaskádu kaspáz a podporuje buněčnou smrt [30]. V této studii jsme zjistili, že ECH snižuje expresi Bcl-2 a zvyšuje expresi Bax, Cyto C, kaspázy-8 a kaspázy-3. Tyto výsledky naznačují, že ECH může do určité míry opravit mitochondriální poškození.
Závěr V této studii jsme zjistili, že léčba ECH inhibovala proliferaci, invazi a migraci a vyvolala apoptózu buněk rakoviny jater. Bylo zjištěno, že základní mechanismus léčby ECH na buňkách rakoviny jater souvisí se signální dráhou miR-503-3p/TGF- 1/Smad. Tato studie poskytne určitý experimentální základ pro výzkum ECH v oblasti protinádorové léčby. Stojí za zmínku, že tato studie je omezena nedostatkem pokusů na zvířatech. Proto naše budoucí studie provede experimenty na zvířatech, aby dále potvrdila naše zjištění.
