Konjugát dendrimer-tesaglitazar indukuje fenotypový posun mikroglií a zvyšuje -amyloidní fagocytózu† Část 2

Biologické testy in vitro

Buněčná kultura. BV2 myší mikrogliální buněčná linie byla získána z Children's Hospital of Michigan Cell Culture Facility.

V posledních letech vědci zjistili, že buněčná kultura úzce souvisí s lidskou pamětí. Studie ukázaly, že prostřednictvím studia buněčné kultury lze objevit molekulární mechanismy v procesu paměti a učení, a tím zlepšit lidské kognitivní schopnosti a paměť.

Buněčná kultura označuje proces umístění biologických buněk do kultivačního média obsahujícího základní živiny pro růst a reprodukci za podmínek in vitro. Buňky jsou základními jednotkami života a buněčná kultura poskytuje vědcům platformu pro studium buněčného chování a životních aktivit. Prostřednictvím studia buněk vědci objevili mnoho informací o růstu neuronů a synaptických spojeních. Tato zjištění mohou nejen pomoci lidem lépe porozumět tomu, jak mozek funguje, ale také pomoci vyvinout nové léčebné postupy a léky.

Výzkumy posledních let ukázaly, že buněčná kultura úzce souvisí i s lidskou pamětí. Vědci zjistili, že tvorba a udržování lidské paměti vyžaduje hodně molekulární regulace a dodávání signálů. Tyto mechanismy přenosu signálu a regulace mají mnoho podobností s mechanismy v buněčné kultuře. Studiem přenosu signálu a regulačních mechanismů v buněčné kultuře mohou vědci lépe porozumět lidské paměti a mechanismům učení.

Některé studie navíc také ukázaly, že buněčná kultura může určitými způsoby zlepšit lidskou paměť a schopnost učení. Například pomocí metody zvané „elektrická stimulace“ lze stimulovat aktivitu buněk a spojení mezi neurony, a tím zlepšit lidské kognitivní schopnosti a účinky učení. Přestože je tato metoda stále ve stádiu laboratorního výzkumu, očekává se, že se v budoucnu stane novou kognitivní tréninkovou metodou.

Stručně řečeno, existuje úzké spojení mezi buněčnou kulturou a lidskou pamětí. Prostřednictvím studia buněk můžeme lépe porozumět lidskému kognitivnímu mechanismu a mechanismu paměti a také pomoci vyvinout nové léčebné metody a metody kognitivního tréninku. Těšme se na přínos technologie buněčných kultur lidstvu v budoucnu! Je vidět, že potřebujeme zlepšit paměť a Cistanche může výrazně zlepšit paměť, protože Cistanche má antioxidační, protizánětlivé účinky a účinky proti stárnutí, které mohou pomoci snížit oxidační a zánětlivé reakce v mozku, a tím chránit zdraví mozku. nervový systém. Kromě toho může Cistanche také podporovat růst a opravu nervových buněk, čímž zlepšuje konektivitu a funkci neuronových sítí. Tyto účinky mohou pomoci zlepšit paměť, schopnost učení a rychlost myšlení a mohou také zabránit výskytu kognitivní dysfunkce a neurodegenerativních onemocnění.

Klikněte na vědět doplňky pro posílení paměti

Buňky BV2 byly kultivovány v médiu Dulbecco's Modified EaglesMedium (DMEM) s 10% teplem inaktivovaným fetálním hovězím sérem (HI FBS) a 1% penicilinem/streptomycinem (P/S) při 37 stupních a 5% C02.

Jakmile buňky dosáhly konfluence v kultivační baňce, byly buňky pasážovány do nové baňky s použitím 0,05% kyseliny trypsin-ethylendiamintetraoctové (EDTA). Pro experimenty byly buňky BV2 nasazeny v DMEM s 5% HIFBS a 1% P/S. O 24–48 hodin později byly buňky stimulovány 100 ng ml-1 (300 EU ml-1) LPS po dobu 3 hodin, aby se buňkám umožnilo vstoupit do prozánětlivého (M1) fenotypu, který simuluje neurozánětlivé prostředí přítomné u mnoha neurologických onemocnění.

Buňky byly poté společně ošetřeny LPS a buď volným Tesa nebo D-Tesa v různých koncentracích pro 48 rukou, poté byly supernatant a buňky shromážděny pro zpracování. Buňky nikdy neošetřené LPS (bez LPS) a buňky ošetřené pouze LPS po celou dobu (pouze LPS) sloužily jako kontrolní skupiny. Volné zásobní roztoky Tesa a D-Tesa byly sterilizovány pomocí poly(ethersulfonů) 0,2 um filtrů.

D-Tesa byl rozpustný v buněčném médiu. Tesa byla solubilizována použitím dimethylsulfoxidu (DMSO) v konečné koncentraci nižší než 0,1 % (v/v). Cytotoxicita, test oxidu dusnatého a TNF-ELISA. Pro test cytotoxicity byly buňky ošetřeny tak, jak je popsáno výše v 96-jamkové destičce, a poté byla cytotoxicita volné Tesa a D-Tesa hodnocena testem MTT podle pokynů výrobce.

Pro test oxidu dusnatého byly buňky ošetřeny, jak je popsáno výše, v 12-jamkových destičkách, a poté byly shromážděny supernatanty z ošetřených buněk a okamžitě byly kvantifikovány hladiny oxidu dusnatého podle protokolu výrobce pro Griessovo činidlo.

Pro TNF-ELISA byly buňky ošetřeny, jak je popsáno výše, v 12-jamkových destičkách, a poté byly supernatanty z ošetřených buněk shromážděny a skladovány při -80 stupních, dokud nebyly připraveny pro další zpracování.

Poté byly vzorky rozmraženy na ledu a byla provedena TNF-ELISA podle protokolu výrobce. Pro tyto studie byly D-Tesa i volná Tesa sonikovány a vortexovány, dokud nebyly obě zcela rozpustné. Pro solubilizaci volné Tesa byla nejprve rozpuštěna v DMSO před zředěním, kde konečná koncentrace DMSO byla pod 0,1 % (obj./obj.) pro všechny volné vzorky Tesa.

Protože D-Tesa byl rozpustný v médiu pro buněčnou kulturu, DMSO se do těchto vzorků nepřidával. Pro allin vitro studie bylo aplikováno ekvivalentní množství volného nebo konjugovaného léčiva na buňky ve skupinách volných Tesa i D-Tesa.

Kvantitativní real-time PCR (qRT-PCR). Buňky byly ošetřeny, jak je popsáno výše, v 12-jamkových destičkách a po odebrání supernatantu byly buňky shromážděny v reagentu Invitrogen™ TRIzol™ (od Fisher Scientific) a RNA byla extrahována podle protokolu výrobce. Koncentrace a čistota výsledné RNA byly analyzovány pomocí Nanodrop.

Ekvivalentní množství RNA z každého vzorku byla převedena na cDNA podle protokolu výrobce pro High CapacitycDNA Reverse Transscription Kit (od Applied Biosystems by Thermo Fisher Scientific).

Výsledná cDNA byla použita pro analýzu qRT-PCR s použitím zeleného činidla FAST-SYBR a podle protokolu výrobce. Hodnoty Ct byly vypočítány strojem a data byla analyzována za použití 2-AACtmetody.

Pro každý odlišný marker byla vypočtena hodnota ACt odečtením ACt pro skupinu bez LPS od ACt pro každý vzorek. Hodnota ACt byla hodnota Ct pro zájmový gen mínus Ct pro GAPDH pro každý daný vzorek.

Jakmile byl pro všechny skupiny vypočítán 2−ΔΔCt, byly všechny normalizovány na skupinu bez LPS, čímž byla u skupiny bez LPS získána relativní hladina exprese 1.0 pro všechny markery. Dopředné a zpětné sekvence primerů byly použity pro qRT -PCR jsou uvedeny v tabulce níže. Všechny sekvence jsou zapsány od 5′→3′.

Kromě toho byly od společnosti BIORAD zakoupeny komerčně dostupné primery pro iNOS/Nos2 (qmmuCID0023087), TLR4 (qmmuCID0023548), CD206/Mrc1 (qmmuCID0012670), TGF- 1 (qmmuCID0017340} ILSO1CID0017345}), 2CIDSO1 (qmmuced0024846), CD36 (qmmucid0014852), Ide(qmmuced0049796), MMP9 (qmmucid0021296), CCL1 (qmmuced0038249), TLR8 (qmmuced0039837), CDqmmucid{0608q, CDqm606q 404) a PPAR (qmmucid0018821). Test fagocytózy.

Vliv volných Tesa a D-Tesa na fagocytózu -amyloidu byl stanoven pomocí dříve uvedené metody.47 Stručně řečeno, mouka HiLyte™ 488-označená -amyloid1–42 (od Anaspec Inc.) byla rozpuštěna v DMSO (konečná koncentrace DMSO pod 0,5 % (v/v)) a zředěny na 5 ug ml-1 v PBS.

Po ošetření buněk přípravkem Tesa a D-Tesa podle schématu ošetření uvedeného výše byl na buňky aplikován roztok -amyloidu po dobu 2 hodin. Poté byly buňky třikrát promyty Hankovým vyváženým solným roztokem s dvojmocnými kationty (vápník a hořčík), odstraněny z jamek pomocí trypsinu a resuspendovány v pufru FACS (od Invitrogen).

Vzorky byly uloženy na ledu a okamžitě byly spuštěny na průtokovém cytometrickém stroji Sony Cell Sorter SH800 a data byla analyzována pomocí souvisejícího softwaru.

Brána byla nastavena pomocí buněk neošetřených fluorescenčním -amyloidem a uvedené výsledky jsou procenta buněk z každé skupiny, které vykazovaly fluorescenci nad fluorescencí pozadí.

Pro každou skupinu byla také uvedena průměrná intenzita fluorescence (MFA) HiLyte™ 488-značeného -amyloidu. Tento test byl proveden v duplikátech. Statistics. Všechna uvedená data jsou výsledkem tří samostatných experimentů, z nichž každý byl proveden trojmo, pokud není uvedeno jinak. Ke statistikám byly použity GraphPad Prism 5 a Microsoft Excel.

Byly provedeny dvoustranné, párové Studentovy t-testy s BonferroniCorrection. Ke stanovení odlehlých hodnot byl použit Grubbsův test. K vykreslení dat byl použit GraphPad Prism 5 pro Windows (San Diego, CA). Uvedená data jsou průměr + SEM.

Výsledky a diskuse

Syntéza a charakterizace D-Tesa

Aby bylo umožněno cílené intracelulární dodání do aktivovaných mikrogliálních buněk v mozku, byl Tesa kovalentně konjugován na povrch G4-PAMAM-OH se štěpitelnými esterovými vazbami mezi léčivem a dendrimer-linkerem (obr. 1).

V prvním kroku se Tesa (1) nechala reagovat s tetramethylenglykolazidem (TEG-azid) (2) za vzniku Tesa-TEG-azidu (3), který má esterovou vazbu mezi léčivem a linkerem (obr. 1A).

HPLC sloučeniny (3) ukázala retenční čas 13,4 minuty s čistotou vyšší než 99 % (obr. S1B†). Hmotnostní spektrum (3) ukázalo pík 610,13 [M + 1]+ odpovídající molekulové hmotnosti Tesa-TEG-azidu, což dále potvrzuje tvorbu produktu (obr. S2†). Odděleně se dendrimer G4-PAMAM-OH (4) nechal reagovat s kyselinou 5-hexinovou za použití esterifikační reakce za vzniku D-YNE (5) (obr. 1B).

Nakonec byly Tesa-TEG-azid (3) a D-YNE (5) zreagovány vysoce účinnou měď-katalyzedazid-alkinovou cykloadicí (CuAAC) click reakcí za vzniku D-Tesa (6) (obr. 1B).48 1H NMR potvrdila úspěšnou syntézu všech meziproduktů a konečného produktu; D-Tesa (6) obsahoval charakteristické píky protonů dendrimeru a lékového linkeru demonstrující úspěšnou syntézu D-Tesa (obr. 2A).

NMR konečného konjugátu D-Tesa odhalilo, že ke každému dendrimeru bylo připojeno průměrně deset molekul Tesa. HPLC potvrdila úspěšnou kovalentní konjugaci, protože D-Tesa vykazovala posun od D-YNE i TesaTEG-azidu (obr. 2B a S1†).

Tesa má špatnou rozpustnost ve vodě, odhadovaná na 0,0035 mg ml-1,49 Konjugace onhydroxylového dendrimeru Tesa zlepšila jeho rozpustnost ve vodě o několik řádů oproti tomuto odhadu. D-Tesa byla rozpustná ve vodě při 22 mg ml-1, a protože Tesa obsahuje ~19 % hmoty D-Tesa, bylo rozpuštěno 4,2 mg ml-1 ekvivalentu Tesa (obr. 3A).

Zvýšená rozpustnost, kterou poskytuje dendrimer, zvyšuje snadnost formulace a odstraňuje potřebu potenciálně toxických pomocných látek.50 Všechny tyto výhody doplňují vynikající schopnost dendrimeru dodávat volné léky přes BBB do mikroglií in vivo a potenciálně snižovat dávka potřebná k dosažení terapeutického účinku.18–28 A konečně, D-Tesa měla průměrnou velikost 7,75 ± 0,29 nm (obr. S3†) a zeta-potenciál 2.86 ± 0,38 mV (měření N=5 a N=3).

Uvolnění drogy

Navrhli jsme D-Tesa, aby uvolňoval Tesa intracelulárně v prostředí inendosomů/lysozomů aktivovaných mikroglií s nízkým pH a vysokou koncentrací esteráz. Již dříve jsme uvedli, že dendrimery PAMAM vstupují do buněk hlavně endocytózou ve fluidní fázi a vezikuly, které obsahují konjugáty, se transformují na lysozomy.51

D-Tesa jsme inkubovali při 37 stupních v pufru citrátu sodného (pH 5,5) v přítomnosti esteráz, abychom napodobili podmínky lysozomů, jak bylo provedeno dříve.52–54 Také jsme zkoumali uvolňování za podmínek, které napodobují plazmatické podmínky (fyziologický roztok pufrovaný fosfátem [PBS ] pufr, pH 7,4).

Za plazmatických podmínek se po 48 hodinách uvolní pouze asi 1,5 % Tesa a do 25. dne se uvolní méně než 20 % Tesa, což naznačuje stabilitu konjugátu v plazmě (obr. 3B).

Za lysozomálních podmínek se asi 60 % Tesa uvolní z D-Tesa během prvních 48 hodin a během 19 dnů se uvolní téměř 100 % Tesa. Tyto výsledky ukazují, že D-Tesa poskytuje trvalé, spouštěné uvolňování volného léčiva po dobu prvních dvou týdnů inkubovaných za fyziologicky relevantních lysozomálních podmínek.

Kromě toho je významné minimální uvolňování Tesa v podmínkách simulované plazmy (skupina pH 7,4) během prvních 48 hodin, protože toto je typická doba cirkulace G4-PAMAM-OH před clearance ledvin, sominimal Tesa bude pravděpodobně uvolněn z konjugáty, než se dostanou do mikroglie.24

D-Tesa snížil expresi M1 markerů a zvýšil M2 markery

Abychom vyhodnotili schopnost D-Tesa indukovat posun fenotypu M1 na M2, hodnotili jsme schopnost D-Tesa měnit expresi markerů M1 a M2 in vitro pomocí myší mikrogliální buněčné linie (BV2).

Buňky BV2 byly vytvořeny imortalizací myších mikrogliálních buněk a ukázalo se, že jsou vhodnou alternativou k buňkám primárních mikroglií ke studiu mikrogliální zánětlivé odpovědi.55,56 V našich experimentech, abychom napodobili neurozánětlivé prostředí přítomné u mnoha neurologických onemocnění, jsme mikroglii předem ošetřili 100 ng ml-1 (300 endotoxinových jednotek (EU) na ml) LPS po dobu 3 hodin.

Poté jsme buňky společně ošetřili LPS a buď volným Tesa nebo D-Tesa po dobu 48 hodin, a poté jsme odebrali vzorky. Buňky jsme ošetřili v koncentracích 1,5, 15 a 150 uM volného Tesa nebo D-Tesa na ekvivalentním lékovém základě.

Test MTT prokázal, že volný Tesaor D-Tesa v těchto koncentracích nezpůsobuje cytotoxicitu (obr. S4†). Pro stanovení nejúčinnější dávky přípravků Tesa a D-Tesa byla provedena počáteční studie stanovení dávky s přípravky Tesa a D-Tesa.

Léčba pomocí 1,5 a 15 µM volného Tesa a D-Tesadidu nemění sekreci oxidu dusnatého nebo TNF-, jak bylo stanoveno pomocí Griessova činidla a TNF-ELISA (obr. S5†). Na základě těchto výsledků jsme neanalyzovali tyto nižší koncentrace v našich testech qRT-PCR.

U mnoha neurodegenerativních onemocnění je jednou z hlavních neurotoxických funkcí prozánětlivých mikroglií M1 jejich sekrece reaktivních forem kyslíku (např. oxidu dusnatého), které přímo zabíjejí neurony.57,58 Následně bylo postulováno, že jednou z potenciálních terapeutických strategií by bylo snížení této krece těchto molekul.

Hodnotili jsme schopnost D-Tesa dosáhnout tohoto efektu. Po stimulaci LPS snížil D-Tesa hladiny mRNA sekretovaného oxidu dusnatého a indukovatelné syntázy oxidu dusnatého (iNOS) 3.7-násobně (p < 0,0001) a 2-násobně (p {{ 7}}.011), v tomto pořadí, ve srovnání s buňkami ošetřenými pouze LPS (pouze LPS) (obr. 4A a B).

Na druhou stranu, volná Tesa snížila vylučovaný oxid dusnatý mírněji (1,{1}}násobně, p=0,004) a nevedla k významnému snížení exprese iNOS mRNA (obr. 4A a B ).

D-Tesa byl mnohem účinnější než volný Tesain potlačující sekreci oxidu dusnatého. Dále, v závislosti na tom, zda jsou mikroglie ve fenotypu M1 nebo M2, mikroglie upregulují buď iNOS nebo arginázu 1 (Arg1), aby metabolizovaly L-arginin za vzniku oxidu dusnatého pro svou odpověď zabíjení patogenů M1, orornitin a močovinu pro odpověď na hojení ran M2. 59

V souladu s jeho downregulací iNOS zvýšil D-Tesa hladiny mRNA Arg1 2-násobně (p=0,011) ve srovnání s kontrolou pouze s LPS, zatímco volná Tesa nezvýšila expresi významně (p=0 40) (obr. 4C).

D-Tesa a v menší míře i volné Tesa změnily mikroglie z uvolňování cytotoxického oxidu dusnatého na metabolizaci L-argininu pro hojení ran, což má důsledky pro snížení a potenciálně zvrácení neurotoxicity způsobené mikroglií při neurodegeneraci.5–7,10

Snížení hladin iNOS a sekretovaného oxidu dusnatého při léčbě D-Tesa je způsobeno předchozí prací, která prokázala, že přirozený ligand PPAR (15-deoxy-Δ12,14-prostaglandin J2) snížil expresi a sekreci iNOS a oxidu dusnatého u léčených LPS primární mikroglie.60

IL-10, IL-4 a TGF- 1 jsou všechny cytokiny, které jsou vylučovány alternativně aktivovanými mikrogliemi M2, které mohou navodit neuroprotektivní, protizánětlivé prostředí v mozku.58,61,62Směrem za tímto účelem D-Tesa zvýšila expresi IL-105.{10}}násobně (p=0.011) a IL-4 8.2-násobně (p { {15}}.013) ve srovnání s kontrolou pouze LPS (obr. 4D a E).

Free Tesa významně nezvýšila úrovně IL-10 ani IL-4, ačkoli průměry byly 1.7-násobek (p=0,066) a 2.{{7} }krát (p=0.11) vyšší pro mikroglie ošetřené Tesa ve srovnání s kontrolami pouze s LPS (obr. 4D a E). Kromě toho D-Tesa zvýšila expresi TGF- 1 2.3-násobně (p=0.015) a volný Tesa výrazně nezměnil expresi (obr. 4F).

D-Tesa tedy indukuje sekreci protizánětlivých cytokinů po LPS léčbě mikroglií, které mohou zmírnit neurotoxické, prozánětlivé prostředí přítomné u neurodegenerativních onemocnění.5–7,10

D-Tesa indukovaná exprese markerů podtypu M2-

CD206, Ccl1 a TLR8 jsou specifické markery pro podtypy mikroglií M2a, M2b a M2c.58 D-Tesa upregulated CD206 expression 4.{{10 }}násobek (p < 0,001), Ccl1 3.{14}}násobek (p < 0,005) a TLR8 5-násobek (p < 0,01), zatímco volná Tesa významně nezvýšila expresi kterýkoli z těchto tří markerů (obr. 5A–C).

Tato data ukazují, že mikroglie ošetřené D-Tesa vykazují signifikantní upregulaci markerů všech tří podtypů M2, což souhlasí s pochopením, že fenotyp mikroglie je plastický a ne binární.63–65

Nomenklatura M1/M2 příliš zjednodušuje složitost, že mikroglie mohou existovat ve spektru aktivačních stavů; podél tohoto kontinua byly charakterizovány tři odlišné fenotypy M2 (M2a, M2b a M2c) a D-Tesa indukuje expresi markerů konzistentních s každým z těchto stavů.58,61,63,66,67 M2a mikroglie se účastní zvýšené fagocytózy patogenních proteiny zvýšením regulace vychytávacích receptorů, opravou tkání a protizánětlivými účinky.

Mikroglie M2b jsou jako mikroglie M1 v tom, že vyjadřují IL-1, TNF- a IL-6; avšak M2b se liší od mikroglií M1 v tom, že exprimují IL-10 ve vysokých hladinách a snižují expresi iNOS. Makrofágy M2b a mikroglie stimulují Th2 T-buňky, což svědčí o jedné z rolí M2b při indukci protizánětlivé odpovědi.

M2cmicroglia se podílí na hojení ran, remodelaci tkání, sekvestraci železa a aktivaci STAT3, která snižuje prozánětlivou signalizaci.58,61,63,66PPAR aktivita přípravku Tesa stimuluje dopřednou smyčku, která vede ke zvýšené expresi PPAR a jeho upstreamsignalizačního proteinu (STAT6), což jsou oba markery M2a.58D-Tesa zvýšila expresi PPAR 2.3-násobně (p=0.0036) a STAT6 3.4- násobně (p < 0,001), zatímco volná Tesa zvýšila STAT6 1.8-násobně (p=0,011) bez významného zvýšení exprese PPAR (1,{23}}násobné zvýšení, p=0.17) (obr. 5D a E).

Zvýšená exprese STAT6 a PPAR vede k produkci protizánětlivých genů a inhibici prozánětlivých signálů inhibicí aktivity NF-KB. Vzhledem k tomu, že mikroglie M2a mohou být indukovány ošetřením mikroglií IL-4, který signalizuje prostřednictvím STAT6 a PPAR, může upregulace těchto dvou downstream signálních proteinů vést k polarizaci zpětné vazby M2a.68

V našich testech aktivace LPS zvýšila hladiny IL-6, TNF- a IL-1 a léčba D-Tesa dále zvýšila expresi těchto cytokinů (obr. S6A–D†), což je pravděpodobné kvůli D-Tesa indukujícímu fenotyp M2b (obr. 5B).

Volný Tesa zvýšil expresi IL-6 a významně nezměnil expresi TNF- a IL-1 (obr. S6A–D†). Zatímco tyto cytokiny jsou vylučovány mikroglií M1, mikroglie M2b tyto cytokiny také exprimují.58,61 CD86 je marker mikroglií M1 i M2b a je zvýšen léčbou D-Tesa (obr. S6E†).

Navíc supresor cytokinové signalizace (SOCS) je rodina intracelulárních proteinů, které regulují fenotypovou polarizaci mikroglií potlačením více signálních drah aktivovaných cytokiny.69 SOCS1 je jedním členem této rodiny a bylo prokázáno, že inhibuje LPS/TLR4 zprostředkoval signalizaci NF-κB a JAK2, čímž se snížilo množství TNF-, IL-1 a IL-6 uvolněné mikroglií M1 prostřednictvím LPS/TLR4 dráhy.

D-Tesa upreguluje expresi SOCS1 ve srovnání s kontrolou pouze s LPS (obr. S6F†), což naznačuje, že zvýšení IL-6, TNF- a IL-1 vykazované D-Tesa by mohlo být způsobeno indukcí M2b fenotyp a ne prostřednictvím zesílení LPS/TLR4, M1-indukujícího fenotypu.

Kromě toho LPS signalizuje prostřednictvím TLR4 a aby se zabránilo nadměrné buněčné aktivaci, mikroglie mají mechanismus negativní zpětné vazby, přičemž aktivace TLR4 vede ke snížené expresi TLR4.70

Léčba pomocí bezplatných přípravků Tesa a D-Tesa zvýšila TLR4 úrovně 3.6-násobně (p < 0.001) a 3.7-násobně (p < 0,001), v tomto pořadí (Obr. 5F), což naznačuje, že Tesa a D-Tesa změnily typickou signální dráhu negativní zpětné vazby LPS/TRL4.

For more information:1950477648nn@gmail.com