Konjugát dendrimer-tesaglitazar indukuje fenotypový posun mikroglií a zvyšuje -amyloidní fagocytózu† Část 1

Přeměna mikroglie z „prozánětlivého“ stavu exacerbujícího onemocnění do neuroprotektivního „protizánětlivého“ fenotypu je slibnou strategií pro řešení mnoha neurodegenerativních onemocnění.

Mikroglie jsou typem buněk v centrálním nervovém systému, který je primárně zodpovědný za udržování zdraví a funkce neuronů. Mohou vylučovat různé růstové faktory a neurotrofické faktory a mohou udržovat normální metabolickou aktivitu neuronů čištěním odpadních materiálů kolem neuronů. Studie z posledních let ukázaly, že mikroglie úzce souvisí s pamětí. Pojďme se na to společně podívat.

Za prvé, mikroglie může stimulovat neurony a podporovat aktivaci neuronů, čímž zlepšuje paměť. Uvolněním řady neurotransmiterů, jako je glutamát a alanin, mohou mikroglie podporovat přenos signálu mezi neurony a mohou zvýšit rezonanci signálu gliální neuron mezi presynaptickými membránami, dále podporovat neuronální excitabilitu a tvorbu paměti.

Za druhé, mikroglie mohou také vyčistit odpad kolem neuronů, udržovat normální metabolickou aktivitu neuronů a snižovat úmrtnost neuronů, čímž podporují zlepšení paměti. Když se kolem neuronů nahromadí příliš mnoho odpadků, ovlivní to normální metabolickou aktivitu neuronů, což povede k smrti neuronů a oslabení funkce, čímž se sníží výkon paměti. Mikroglie mohou udržovat normální metabolické prostředí neuronů a snižovat úmrtnost neuronů tím, že pohlcují a rozkládají okolní odpad, čímž zlepšují paměť.

Stručně řečeno, mikroglie úzce souvisí s pamětí. Podporou excitace neuronů a čištěním okolního odpadu mohou mikroglie dále zlepšit paměť a udržet náš mozek zdravý a aktivní. Měli bychom dbát na ochranu zdraví mikroglií, abychom dosáhli lepší paměti. Je vidět, že potřebujeme zlepšit paměť a Cistanche může výrazně zlepšit paměť, protože Cistanche je tradiční čínský léčivý materiál s mnoha unikátními účinky, z nichž jedním je zlepšení paměti. Účinnost Cistanche vychází z různých aktivních složek, které obsahuje, včetně kyseliny tříslové, polysacharidů, flavonoidních glykosidů atd. Tyto složky mohou podporovat zdraví mozku různými způsoby.

Klikněte na 10 způsobů, jak zlepšit paměť

Prozánětlivé mikroglie přispívají k progresi onemocnění uvolňováním neurotoxických látek a urychlováním akumulace patogenních proteinů. Ukázalo se, že oba agonisté PPAR a PPAR posouvají mikroglie z prozánětlivého ('M1-like') na alternativně aktivovaný ('M2-like') fenotyp. Takové strategie byly zkoumány v klinických studiích pro neurologická onemocnění, jako je Alzheimerova a Parkinsonova choroba, ale pravděpodobně selhaly kvůli jejich špatnému pronikání hematoencefalickou bariérou (BBB).

Bylo ukázáno, že polyamidoaminové dendrimery zakončené hydroxylem (bez připojení jakýchkoli cílících ligandů) procházejí přes narušenou BBB v místě neurozánětu a hromadí se v aktivovaných mikrogliích.

Proto konjugace dendrimeru PPAR/duální agonista může umožnit cílenou změnu fenotypu aktivované mikroglie. Zde uvádíme syntézu a charakterizaci nového konjugátu dendrimer-PPAR/duální agonista (D-tesaglitazar).

In vitro D-tesaglitazar indukuje posun fenotypu 'M1 na M2', snižuje sekreci reaktivních forem kyslíku, zvyšuje expresi genů pro fagocytózu a enzymatickou degradaci patogenních proteinů (např. -amyloid, -synuklein) a zvyšuje -amyloidní fagocytózu.

Tyto výsledky podporují další vývoj D-tesaglitazaru směrem k translaci pro mnohočetná neurodegenerativní onemocnění, zejména Alzheimerovu a Parkinsonovu chorobu.

Zavedení

Jen ve Spojených státech amerických je v současnosti více než 5,3 milionu lidí s Alzheimerovou chorobou (AD) a 1 milion lidí s Parkinsonovou chorobou (PD). se bude i nadále zvyšovat, protože populace stále stárne.

Nedostatek nedávných úspěchů ve vývoji nových léků k léčbě těchto nemocí navíc zdůraznil potřebu vývoje inovativních terapií.2,3 Tyto klinické neúspěchy zdůrazňují obtíže při vývoji léku, včetně dodávání dostatečně vysoké koncentrace léku do mozku, aby byla účinná bez způsobující nežádoucí vedlejší účinky.

Neurodegenerativní onemocnění, jako je AD a PD, sdílejí tři hlavní neuropatologické složky: neurozánět, akumulaci patogenních proteinů a smrt neuronů.4–7 Nezdraví lidé, vrozená imunitní buňka mozku (themikroglie) neustále fagocytují špatně složené proteiny (např. -amyloid, -synuklein ), které způsobují smrt neuronů, když jsou produkovány, což zabraňuje tvorbě charakteristických agregátů.

Avšak u lidí, u kterých se nakonec rozvinou neurodegenerativní onemocnění, mikroglie již tyto proteiny účinně neodstraňují a přecházejí do prozánětlivého fenotypu zhoršujícího onemocnění (typicky označeného jako M1).

Zatímco převážně prozánětlivá/protizánětlivá (M1/M2) klasifikace mikrogliální aktivace je přílišným zjednodušením spektra polarizace makrofágů, stále se používá jako široká nomenklatura k popisu dominantního fenotypu mikroglie v neurozánětu a odpovědi na terapii.

Mikroglie podobné M1-u uvolňují reaktivní formy kyslíku a další zánětlivé mediátory, které jak indukují smrt neuronů, tak zhoršují patologii onemocnění zvýšením produkce patogenních proteinů (např. -amyloid, -synuklein).

Kromě toho jsou hlavní genetické rizikové faktory pro rozvoj AD (TREM2 a APOE) ve vysokých hladinách exprimovány v mikrogliích a bylo prokázáno, že dráha TREM2/APOE způsobuje posun amikrogliálního fenotypu u AD, amyotrofické laterální sklerózy (ALS) a roztroušené sklerózy. zvířecí modely.8

Tyto poznatky dále demonstrují roli mikroglií v patologii mnoha lidských neurodegenerativních onemocnění. Přístup k manipulaci s fenotypem mikroglií by umožnil výzkumníkům porozumět jejich roli v neurodegenerativních onemocněních, kromě toho, že je potenciálně účinným léčebným prostředkem.

Přechod mikroglie z M1 na protizánětlivý a neuroprotektivní (M2) fenotyp byl navržen jako terapeutická strategie k léčbě mnoha neurodegenerativních onemocnění.5,6 Bylo prokázáno, že dva v současnosti FDA schválení agonisté PPAR, léky na diabetes typu II rosiglitazon a pioglitazon, vyvolávají Posun fenotypu M1 na M2 u makrofágů a mikroglií in vitro a in vivo.

Bylo prokázáno, že 9,10 agonisté PPAR snižují LPS-indukovanou sekreci reaktivních druhů kyslíku snížením aktivity NF-κB indukcí NF-κBdegradace a exportu z jádra, stejně jako ligand-dependentní transreprese.11

Epidemiologické studie navíc ukázaly, že u pacientů s diabetem, kteří užívají rosiglitazon nebo pioglitazon, je snížené riziko rozvoje AD a PD.12 Následně byly rosiglitazon a pioglitazon zkoumány ve fázi III klinických studií pro AD, ale neuspěly.13

Jedním z pravděpodobných vysvětlení neúspěchu výše uvedených klinických studií je špatný transport těchto léků přes hematoencefalickou bariéru (BBB), což omezuje počet léků, které se dostaly do mozku pacientů zařazených do těchto klinických studií.14

Odhaduje se, že BBB zabraňuje asi 98 % všech léků s malou molekulou dostat se do mozku a pouze zlomek léku, který vstoupí do mozku, dosáhne mikroglie.15

Kromě toho je PPAR dalším nukleárním receptorem v rodině PPAR.16 Hraje roli v homeostáze lipidů a regulaci zánětu a také bylo prokázáno, že agonisté PPAR vykazují protizánětlivé účinky v mikrogliích.

Klinické studie využívající neurozobrazení, tkáňovou analýzu post mortem a biomarkery CSF poskytly důkaz, že BBB je narušena u AD a PD, stejně jako u jiných neurodegenerativních onemocnění.

Bylo prokázáno, že dendrimery 17 generace-4 hydroxylem zakončených polyamidoaminů (G4-PAMAM-OH) přirozeně obcházejí narušenou BBB a akumulují se v aktivované mikroglii bez potřeby cílení na ligandy, po systémovém podávání v mnoha různých modelech neurozánětlivých onemocnění , včetně hlodavců, králíků, psů a primátů.18–28 Je příznačné, že G4-PAMAM-OH může být podáván systémově a procházet přes BBB u modelů onemocnění s mírným narušením BBB, jako je Rettův syndrom.29

Kromě toho je rozsah absorpce G4-PAMAM-OH do mozku přímo úměrný závažnosti onemocnění u králičího modelu mozkové obrny.30 Dendrimery zakončené hydroxylem mají výhodu neinvazivního podávání ve srovnání s vysoce invazivním lokálním podáváním prostřednictvím lebka požadovaná v předchozích studiích s jinými nanočásticemi, jako je poly-ekaprolakton a PEG, záporně nabité dendrimery PAMAM, kvantové tečky a nanoformulace složené z polyethyleniminu (PEI) a dextransulfátu.31–35

Kromě toho jsou tyto dendrimery hydroxylového PAMAM ideálně umístěny pro translaci díky své škálovatelnosti a dobře tolerovanému bezpečnostnímu profilu in vivo.36–38 Díky pozitivním předklinickým údajům o účinnosti je a (G4-PAMAM-OH)-N- konjugát acetyl-cystein je v současné době hodnocen v raných klinických studiích pro dětskou mozkovou adrenoleukodystrofii (NCT03500627) a závažný zánět spojený s koronavirovým onemocněním 2019 (COVID-19) (NCT04458298).

Studovali jsme konjugát dendrimer-lék tesaglitazar (Tesa) připojený ke generaci -4 hydroxylem zakončeného PAMAMdendrimeru. Tesaglitazar je silný PPAR/duální agonista, který kombinuje příznivé účinky PPAR a agonistů PPAR. Obsahuje funkční skupinu karboxylové kyseliny pro kovalentní konjugaci s dendrimerem a pro následné uvolnění.

Byly vyvinuty a klinicky testovány další kytary, ale Tesa byla vybrána kvůli svému většímu poměru aktivity PPAR k PPAR, relativně jednoduché chemické struktuře a bezpečnostnímu profilu.39–43

Společnost Tesa již dříve dosáhla fáze III klinických studií pro diabetes 2. typu ve Spojených státech amerických, ale selhala kvůli toxicitě závislé na dávce, které lze předejít snížením nutné dávky podávání kontrolovaným podáváním dendrimeru.39,40,44Protože společnost Tesa je PPAR / duální agonista, jeho cílené dodání do aktivované mikroglie v místě neurozánětu by mohlo být velmi prospěšné.

Zde demonstrujeme syntézu a charakterizaci konjugátu dendrimer-tesaglitazar (D-Tesa) a demonstrujeme schopnost této sloučeniny indukovat posun fenotypu 'M1 až M2' v mikrogliích a zvýšit fagocytózu fluorescenčně značeného -amyloidu.

Materiály a metody

Materiály

1-[3-(dimethylamino)propyl]-3-ethylkarbodiimid methiodid (EDC), 4(dimethylamino)pyridin (DMAP), CuSO4·5H2O, askorbát sodný, kyselina hexynová a hovězí sérový albumin (BSA) byly zakoupeny od Sigma Aldrich US a použity tak, jak byly přijaty (St Louis, MO).

Tesaglitazar byl získán od AstaTech Inc. (Bristol, PA). Dendrimer PAMAM s ethylendiaminovým jádrem (generace 4 s 64 hydroxylovými koncovými skupinami) byl získán od Dendritech Inc. (Midland, MI) jako roztok v methanolu.

Dendrimer byl skladován v methanolu při 4 stupních a methanol byl před použitím odpařen. Dialyzační membrána s mezní hodnotou molekulové hmotnosti (MWCO) 1 kDa byla zakoupena od Spectrum Laboratories Inc. (New Brunswick, NJ).

Všechna ostatní rozpouštědla byla použita tak, jak byla přijata ve svých bezvodých formách. Všechny reakce, kromě mědi(I), katalyzovaných alkyn-azidových cykloadičních (CuAAC) click reakcí, byly prováděny za bezvodých podmínek v organickém médiu se skleněným nádobím sušeným v sušárně pod inertním dusíkem. atmosféra.

Pro buněčnou kulturu: Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), fetální skot (FBS), penicilin-streptomycin (P/S), 0,05% trypsin-EDTA a činidlo MTT byly získány od společnosti Invitrogen (Carlsbad, CA , USA).

Griessovo činidlo bylo získáno od Promega (Madison, WI) a TNF-ELISA bylo získáno od R&D Systems (Minneapolis, MN). Metanol analytické čistoty byl zakoupen od Sigma-Aldrich. Trypanová modř byla získána od Corning (Manassas, VA, USA).

Postupy syntézy konjugátů D-Tesa
Tetraethylenglykolmonoazid (2) byl syntetizován podle dříve publikovaného protokolu.45

Syntéza a čištění Tesa-TEG-azidu (3).
Tesa (950 mg, 2,32 mmol) se rozpustí v 10 ml dimethylformamidu (DMF). K tomuto míchanému roztoku byl po kapkách přidán tetramethylenglykolmonoazid (2, 662,1 mg, 3,02 mmol) v DMF (1 ml). K reakční směsi byly poté přidány DMAP (255,4 mg, 2,09 mmol) a EDC (577,5 mg, 3,02 mmol) a reakční směs byla míchána pod dusíkem při teplotě místnosti po dobu 24 hodin.

Reakce byla monitorována pomocí chromatografie na tenké vrstvě a vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). Reakční směs byla zředěna 100 ml dichlormethanu (DCM) a surová reakční směs byla převedena do dělicí nálevky a organická vrstva byla následně třikrát promyta nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, ​​poté nasyceným roztokem chloridu amonného a nakonec solankou.

Organická vrstva se poté vysušila bezvodým síranem sodným. Rozpouštědlo v organické vrstvě bylo poté odstraněno pomocí rotační odparky a roztok byl znovu rozpuštěn ve 3 ml DCM a absorbován na silikagel, aby byl čištěn chromatografickým systémem CombiFlash® s použitím gradientové metody s ethylacetátem/hexanem jako rozpouštědly za vzniku 3jako čirého - žlutý olej.

Požadovaný čistý produkt se eluuje přibližně 30-40% ethylacetátem. (Výtěžek: 70 %) 'H NMR (500 MHz, CDC13) 5 7,27 (d, J=8,6 Hz, 2H), 7,15 (d, J=1,9 Hz, 2H), 7,08 (d, J=8,6 Hz, 2H), 6,73 (d, J=8,6 Hz, 2H), 4,25–4,14 (m, 2H), 4,07 (t, J {{{ 33}},8 Hz, 2H), 3,94 (dd, J =7,8, 5,2 Hz, 1H), 3,67-3,47 (m, 14H), 3,30 (dd, J=8,7 , 3,8 Hz, 2H), 3,06 (s, 3H), 3,02 (t, J=6,7 Hz, 2H), 2,91-2,84 (m, 2H), 1,08 (t, J=7 0,0 Hz, 3H).ESI-MS: teoreticky C28H39N3O10S: 609,24, získáno (M + 1): 610,13.

Syntéza a čištění D-YNE (5).

(480 mg, 4,22 mmol) byl přidán k míchanému roztoku G4-PAMAM-OH (2,5 g, 0,176 mmol) ve 20 ml bezvodého DMF. K této směsi byly přidány DMAP (430 mg, 3,52 mmol) a EDC (1 g, 5,28 mmol).

Reakční směs byla míchána pod dusíkem po dobu 24 hodin při teplotě místnosti. Po dokončení reakce byla reakční směs převedena do 1000 MWCO dialyzační zkumavky DMF dialýza byla prováděna po dobu 24 hodin a DMF byl měněn přibližně každých šest hodin.

Poté byla po dobu 24 hodin prováděna dialýza deionizovanou (DI) vodou, přičemž voda se vyměňovala přibližně každých šest hodin. Nakonec byl výsledný obsah dialyzační zkumavky lyofilizován po dobu 48 hodin, čímž byl získán bílý, načechraný prášek. (Výtěžek: 61 %)1H NMR (500 MHz, DMSO) 5 8,10–7,67 (m, dendrimerinternal amid H), 4,72 (s, povrch dendrimeru OH), 4,01 (t, ester –CH2), 3,32 (m, dendrimer –CH2), 3,06 (m, dendrimerand linker –CH2), 2,85–2,58 (m, dendrimer –CH2), 2,56–1,89 (m, dendrimer a linker –CH2), 1,78–1,61 (m, linker –CH2). Syntéza a purifikace D-Tesa (6).

Tesa-TEG-azid (3 177,8 mg, 0.3{{10}}3 mmol) byl přidán k míchané směsi D-YNE(5, 35{{2{{27} }}} mg, 0,023 mmol) v 5 ml směsi 1:1 tetrahydrofuranu (THF) a vody s 0,5 ml DMF v 20ml lahvičce bezpečné pro mikrovlnný reaktor. Pro CuAAC click reakci byly k reakční směsi přidány pentahydrát síranu měďnatého (11,6 mg, 0,0467 mmol) a (+)-laskorbát sodný (9,3 mg, 0,0467 mmol).

Nádobka byla utěsněna a reakční nádoba byla poté umístěna do mikrovlnného reaktoru Biotage® Initiator a nechala se reagovat pod 20 W mikrovlnným zářením za míchání po dobu 8 hodin při 50 stupních. Reakční směs byla přenesena do 1000 MWCO dialyzační zkumavky a dialýza DMF byla prováděna po dobu 24 hodin, přičemž DMF byl nahrazen čerstvým rozpouštědlem přibližně každé 4 hodiny.

Poté byl obsah dialyzační zkumavky přenesen do zkumavky Afalcon a bylo přidáno ekvivalentní množství DI vody. Dále bylo k obsahu zkumavky Falcon přidáno 200 ul roztoku disodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové.

Tato směs byla poté umístěna do nové 1000 MWCO dialyzační zkumavky a dialýza byla prováděna po dobu 12 hodin v 1000 ml DIvody s přidaným roztokem EDTA s následnou dialýzou vody po dobu 12 hodin.

Směs byla poté lyofilizována po dobu 48 hodin a výsledkem byl bílý, načechraný prášek. (Výtěžek: 64 %)1H NMR (50}0 MHz, DMSO) 5 8,2–7,6 (m, dendrimer internalamid H), 7,36 (d, Tesa ArH), 7,21 (d, Tesa ArH), 7,03 (d, TesaArH), 6,76 (d, Tesa ArH), 4,37 (s, Tesa H), 4,18–4,04 (m, linkerH), 3,96 (dd, Tesa a linker H), 3,70 (m, Tesa a linker H) ,3,58–3,14 (m, dendrimer –CH2), 3,14–2.86 (m, dendrimer–CH2), 2,87–2,49 (m, dendrimer a linker –CH2), 2,25 (m, dendrimer –CH2) 1,82-1,67 (m, linker -CH2), 0,97 (t, Tesa -CH3).

Charakterizační techniky

Nukleární magnetická rezonance (NMR). NMR spektra byla zaznamenána na spektrometru Bruker 500 MHz při teplotě místnosti. Protonové chemické posuny (5) jsou uváděny v ppm.

1H NMR byla použita ke stanovení počtu molekul Tesa připojených ke každé molekule D-Tesa metodou protonové integrace, porovnáním píku vnitřních amidových protonů dendrimeru při δ 7,6–8,2 ppm s aromatickými protony Tesa při δ 7,36–6,76 ppm a methylovými protony Tesa v alifatické oblasti. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC).

Byla použita HPLC (Waters Corporation, Milford, Massachusetts) vybavená binárním čerpadlem 1525, odplyňovačem In-Line AF, automatickým vzorkovačem 717 plus, detektorem fotodiodového pole 2998 a fluorescenčním detektorem 2475 propojeným se softwarem Waters Empower.

Byla použita kolona s reverzní fází Symmetry C18 (Tosoh, Japonsko) s velikostí částic 5 um, délkou 25 cm a vnitřním průměrem 4,6 mm. Sloučeniny byly monitorovány při 210 nm a 254 nm pomocí PDA detektorů.

Rozpouštědlem A byla voda čistoty pro HPLC s 0,1% kyselinou trifluoroctovou (TFA) a rozpouštědlem B byl acetonitril (ACN) s 5% vody a 0,1% TFA. Použitá metoda začala na 1{ {7}}0 : 0 (ACN: voda), snížena na 10 : 90 (voda: ACN) za 5 minut, zůstala v této polaritě 15 minut a vrátila se na 100 : 0 (ACN: voda) za 5 Průtok byl udržován na 1 ml min-1. Hmotnostní spektroskopie.

ESI-MS byla provedena na hmotnostním spektrometru BrukermicroTOF-II s použitím směsi acetonitril/voda (9:1) jako systému rozpouštědel. Molekulární ionty jako protonované píky[M + nH]n+ nebo adukty [M + nX]n+ (X=Na, K nebo NH4) byly použity k potvrzení empirického vzorce.

Dynamický rozptyl světla a ζ-potenciál. Ke stanovení velikosti částic a distribuce ζ-potenciálu byl použit Zetasizer NanoZS (Malvern Instrument Ltd, Worchester, UK) vybavený 50 mW He–Ne laserem (633 nm). D-Tesa byl rozpuštěn v DI vodě na koncentraci 0,2 mg ml-1 pro DLS a v 10 mM chloridu sodném na koncentraci 0,1 mg ml-1 pro ζ-potenciál.

Měření byla provedena při 25 stupních s použitím úhlu rozptylu 173 stupňů, jak bylo popsáno dříve.27,46 Studie uvolňování léčiva. D-Tesa byla rozpuštěna v koncentraci 1 mg ml-1 buď v roztoku fosfátového pufru (pH 7,4) za podmínek v plazmě nebo v roztoku citrátu sodného (pH 5,5) za účelem napodobení lysozomálních podmínek.

Esterasy z prasečích jater (od Sigma Aldrich) byly přidány k roztoku citrátu sodného na začátku studie uvolňování a byly doplňovány přibližně každé 3 dny během studie.

Každá lahvička obsahovala 15 ml vzorku a byly nepřetržitě třepány při 37 stupních po dobu trvání experimentu. V různých časových bodech byly odebrány duplikáty 200 ul vzorků z každého pH a esterázová aktivita byla následně zastavena přidáním 200 ul methanolu. Vzorky z nultého časového bodu sloužily jako kontrola.

Vzorky byly skladovány při -80 stupních, aby se dále zabránilo jakékoli hydrolýze. Vzorky byly dále analyzovány pomocí HPLC a byla vypočtena plocha pod křivkou (při 210 nm) pro pík volného léčiva. Plocha pod křivkou byla korelována s množstvím uvolněného léčiva použitím kalibrační křivky, kde byly známé koncentrace volného Tesa měřeny na HPLC při 210 nm.

For more information:1950477648nn@gmail.com