Aktivita komplementu je u C3 glomerulopatie regulována fúzními proteiny IgG-faktor H s cílovými doménami a bez nich

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Alyssa C. Gilmore, Yuchun Zhang, H. Terence Cook', Deborah P. Lavin, Suresh Katti, YiWang2, Krista K. Johnson, SungKwon Kim² a Matthew C. Pickering

„Centrum pro zánětlivá onemocnění, Imperial College London, Spojené království; a²Alexion Pharmaceuticals, New Haven, Connecticut, USA

C3 glomerulopatiije charakterizována akumulací komplementu C3 v glomerulech. Příčiny zahrnují, ale nejsou omezeny na abnormality ve faktoru H, hlavním negativním regulátoru alternativní dráhy komplementu. U myší s deficitem faktoru H (Cfh-/-) se vyvine C3glomerulopatiispolu se snížením plazmatických hladin C3. Pomocí tohoto modelu jsme hodnotili účinnost dvou fúzních proteinů obsahujících regulační domény alternativní dráhy faktoru H (FH1-5)

navázané buď na necílený myší imunoglobulin (IgG-FH1-5) nebo protilátku proti myšímu properdinu (Anti-P-FH1-5). Oba proteiny zvyšovaly plazmatický C3 a snižovaly ukládání C3 v glomerulech v ekvivalentní míře, což naznačuje, že pro FH1-5 nebylo vyžadováno zacílení pomocí správného cílení, aby se změnila aktivace C3 buď v plazmě, ani v glomerulech. Po podání IgG-FH1-5 hladiny C3 v plazmě dočasně korelovaly se změnami hladin faktoru B, zatímco hladiny C5 v plazmě korelovaly se změnami hladin plazmatického properdinu. Zejména zvýšení plazmy

Hladiny C5 a properdinu přetrvávaly déle než zvýšení C3 a faktoru B. U Cfh-/- myší IgG-FH1-5 snížilo poškození ledvin během akcelerované sérové ​​nefrotoxické nefritidy. Naše data tedy ukazují, že IgG-FH1-5 obnovil aktivitu cirkulující alternativní dráhy a snížil glomerulární depozici C3 u Cfh-/- myší a že plazmatické hladiny properdinu jsou citlivým markerem aktivity C5 konvertázy při nedostatku faktoru H. Protein FH1-5 konjugovaný s imunoglobulinem může být díky svému poměrně dlouhému poločasu v plazmě potenciální terapií C3glomerulopatii.

Cistanche může pomoci s glomerulopatií

Překladové prohlášení

C3 glomerulopatii(C3G) je onemocnění ledvin charakterizované abnormální akumulací komplementu C3 v glomerulech a poškozením glomerulů. Je to kvůli nekontrolované aktivaci alternativní dráhy komplementu. Fúzní proteiny, složené z funkčních domén regulátoru alternativní dráhy, faktoru H (FH), spojené s protilátkou, obnovily regulaci komplementu a redukovaly glomerulární C3 v C3G myším modelu. Necílená protilátková konjugace vedla k poměrně dlouhému poločasu fúzního proteinu v plazmě a tento nebo podobné způsoby konjugace by mohly být použity k posílení funkce FH v terapii C3G.

C3 glomerulopatii(C3G) je porucha ledvin zprostředkovaná komplementem charakterizovaná abnormálním množstvím C3 v glomerulech.1 Může progredovat do selhání ledvin a nemá žádnou definitivní léčbu.2 C3G je spojena s abnormální aktivací alternativní dráhy komplementu (AP). Aktivace AP vede k produkci C3bBb (C3 konvertáza), enzymu, který štěpí C3. Po přidání další molekuly C3b může výsledný komplex C3bBbC3b (C5 konvertáza) štěpit komplement C5. Nekontrolovaně

Aktivace AP v C3G může být spojena se snížením cirkulujících C3, C5, faktoru B (FB) a properdinu. Mezi příčiny nekontrolované aktivace AP patří ztráta funkčních změn v regulátorech komplementu a zisk funkčních změn v aktivátorech komplementu.2 Klíčovým negativním regulátorem AP je faktor H (FH) a nedostatek FH u lidí, prasat a myší je spojen s C3G. 3 C3 nefritický faktor, protilátka, která stabilizuje AP C3 konvertázu je častá u C3G.4 C3 nefritický faktor může vést ke snížení samotného C3 (nefritický faktor C3 nezávislý na správném C3) nebo ke snížení C3 i C5 (správný závislý nefritický faktor C3).5,6

Ačkoli nedostatek properdinu nezlepšil plazmatické hladiny C3, hladiny C5 se zvýšily, což naznačuje, že properdin byl nezbytný pro aktivitu C5, ale ne C3 konvertázy.8,9

Podávání myší10 nebo lidského FH11,12 myším Cfh–/– snížilo glomerulární C3 barvení a zvýšilo hladiny C3 v oběhu. V tomto modelu jsou také účinné konstrukty, které obsahují pouze regulační a cílící domény FH (mini-FH molekuly).13 Jiné přístupy zahrnují proteiny, které cílí na místa aktivace komplementu. Patří mezi ně TT30,14 protein obsahující regulační domény komplementu FH (FH1-5) spojené s doménami vázajícími komplement komplementového receptoru 2 a homodimerní molekuly FH,15 mini-FH molekuly, které obsahují domény vázající komplement proteinu 1 souvisejícího s faktorem H.

Protože terapeutická užitečnost inhibice aktivace komplementu C3 je u C3G2 zkoumána, je důležité pochopit kinetiku glomerulární depozice C3 a její vztah k aktivaci AP jak v glomerulech, tak v oběhu. V modelech glomerulonefritidy zprostředkované imunitními komplexy se glomerulární C3c vymizel do 24 hodin od prevence aktivace komplementu, zatímco glomerulární C3d přetrvával týdny.16 Podobně u Cfh–/– myší vede exogenní FH ke snížení glomerulárního C3c zabarvení za 24 hodin , zatímco glomerulární C3d zůstává nezměněn.11

V této studii jsme zkoumali účinnost 2 nových fúzních proteinů s regulační aktivitou komplementu na Cfh–/– myším modelu C3G. Proteiny obsahovaly regulační domény myšího FH (FH1-5), který byl konjugován s myším Ig pro prodloužení biologického poločasu. Jeden z fúzních proteinů, nazvaný IgG-FH1-5, byl konjugován s necílenou myší monoklonální protilátkou. Druhý, nazvaný anti-P-FH1-5, byl konjugován s monoklonální protilátkou k myšímu properdinu. To bylo provedeno za účelem testování hypotézy, že zacílení tohoto fúzního proteinu do míst aktivace komplementu interakcí s ukládáním properdinu by zvýšilo regulaci tkáňového komplementu. Naše data ukazují, že jak necílící (IgG-FH1-5), tak proteiny cílené na properdin (anti-P-FH1-5) obnovily plazmatickou a glomerulární regulaci C3 u Cfh–/– myší. Studie časového průběhu ukázaly, že obnovení hladin C3 a FB odráželo hladiny fúzních proteinů v oběhu. Naproti tomu zvýšení C5 v plazmě přetrvávalo poté, co se fúzní proteiny vyloučily z oběhu. Ukazujeme, že IgG-FH1-5 zlepšil glomerulární poškození během akcelerované sérové ​​nefrotoxické nefritidy u Cfh–/– myší.

cistanche může léčit onemocnění ledvin zlepšit funkci ledvin

VÝSLEDEK

Generování fúzních proteinů a hodnocení aktivity in vitro a in vivo Fúzní proteiny byly vytvořeny spojením prvních 5 domén krátkého konsenzuálního opakování (SCR) myší FH (FH1-5) buď s protilátkou proti myšímu properdinu (anti -P-FH1-5) nebo protilátka s necílící Ig doménou (IgG-FH1- 5, doplňkový obrázek S1). Aktivita proteinů byla hodnocena pomocí AP-specifického hemolytického testu (obrázek la). Anti-P-FH1-5 a IgG-FH1-5 inhibovaly hemolýzu způsobem závislým na dávce s větší účinností pro anti-P-FH1-5. Anti-properdin (anti-P) také snižoval hemolýzu v závislosti na dávce, ale kontrola IgG neměla žádný účinek. Po ekvimolárních injekcích proteinů myším Cfh–/– byl protein IgG-FH1-5 detekovatelný až 11 dnů po injekci, zatímco anti-P-FH1-5 byl detekovatelný až 4 dny po vstřikování (doplňkový obrázek S2). Abychom určili, zda by IgG-FH1-5 a anti-P-FH1-5 mohly obnovit plazmatickou regulaci AP u Cfh–/– myší, nejprve jsme měřili hladiny C3 v plazmě po injekci fúzních proteinů (obrázek 1b) . Podání buď IgG-FH1-5 nebo anti-P-FH1-5 významně zvýšilo C3 v plazmě za 24 hodin a v menší míře za 96 hodin po injekci (obrázek 1b). Tato data prokázala, že jak IgG-FH1-5, tak anti-P-FH1-5 by mohly dočasně obnovit plazmatickou regulaci AP u Cfh–/– myší. Dále jsme provedli podrobnou analýzu těchto změn charakterizací časového průběhu změn nejen plazmatického C3, ale také plazmatického C5 a proteinů alternativní dráhy FB a properdinu. Zvýšení hladiny C5 a properdinu v oběhu přetrvává déle než zvýšení hladiny C3 a FB po podání IgG-FH1-5 a anti-P-FH1-5 u Cfh–/– myší

Porovnali jsme kinetiku změn v C3, C5, FB a properdinu měřením proteinů v intervalech až 27 dnů po jedné injekci buď IgG-FH1-5 nebo anti-P-FH1-5 ( Obrázek 2). Po podání IgG-FH1-5 došlo k vrcholu vzestupu C3, C5, FB a properdinu v den 1 po injekci. Doba, po kterou tyto změny poklesly na úroveň před léčbou, se lišila. Návrat k hladinám před léčbou nastal mezi 1. a 4. dnem pro FB, mezi 7. a 11. dnem pro C3 a mezi 14. a 21. dnem pro properdin i C5 (obrázek 2a, c, e a g). Po podání anti-P-FH1-5 se maximální hladiny C3 objevily 1. den, ale mezi 4. a 7. dnem klesly na hladiny před léčbou (obrázek 2b). Nejvyšší hladiny C5 se objevily 4. den a vrátily se na úroveň před léčbou mezi 7. a 11. dnem (obrázek 2d). Vrchol nárůstu FB nastal 1. den a mezi 1. a 4. dnem klesl na úroveň před léčbou (obrázek 2f). Jak se očekávalo, volný plazmatický properdin byl vyčerpán po injekci buď anti-P-FH1-5 nebo anti-P (obrázek 2h). Hladiny volného plazmatického properdinu zůstaly nízké až 7 dní po anti-P-FH1-5 a až 14 dní po anti-P (obrázek 2h). Ačkoli oba fúzní proteiny dočasně obnovily plazmatickou regulaci AP, trvání zlepšení hladin C3, FB a C5 odráželo dobu jejich detekce v plazmě, která byla kratší pro anti-P-FH1-5 (doplňkový obrázek S2) . Stručně řečeno, změny v hladinách C3 a FB po injekci kteréhokoli proteinu byly kratší než u C5 a properdinu. Tato data naznačují, že plasmatický FB je v tomto nastavení citlivým markerem aktivity C3 konvertázy, zatímco properdin je marker aktivity C5 konvertázy. Je pozoruhodné, že po injekci anti-P došlo ke zvýšení C5 ve 24 a 96 hodinách a v den 7

Obrázek 1| (a) Doplňte alternativní test hemolýzy závislý na dráze. Protilátky byly titrovány v 2-násobném ředění od 60 nM až do 0,5 nM. Činidla IgG-FH1-5, anti-P-FH1-5 a anti-P snižovala hemolýzu králičích erytrocytů způsobem závislým na dávce. U IgG-kontrolního proteinu nebyla použita žádná inhibice. Vodorovné úsečky označují střední hodnoty a chybové úsečky představují SD. (b) Plazmatický komplement C3 u Cfh–/– myší po injekci fúzních proteinů. Plazmatická C3 byla měřena před a 24 hodin a 96 hodin po podání IgG-FH1-5 (červené trojúhelníky, n ¼ 5) Anti–P–FH1-5 (fialové trojúhelníky, n ¼ 6), Anti -P (zelené tečky, n ¼ 5) a IgG kontrola (modré tečky, n ¼ 5). Vodorovné pruhy označují střední hodnoty a vousy označují SD. ***P # 0,001 oproti hodnotě před ošetřením a odvozeno z 2-way ANOVA s Bonferroniho vícenásobným srovnávacím testem. FH, faktor H; P, správný.

(Obrázek 2d). Jak bylo uvedeno,8,9 ukazuje, že C5 konvertáza je závislá na properdinu u Cfh–/– myší.

IgG-FH1-5 a anti-P-FH1-5 snížily glomerulární C3c, ale nezměnily C3d barvení u Cfh–/– myší

Dále jsme hodnotili vliv IgG-FH1-5 a anti-P-FH1-5 na glomerulární C3b/iC3b/C3c, C3d, properdin a proteiny související s FH (FHR). 96 hodin po injekci IgG-FH1-5 bylo glomerulární C3b/iC3b/C3c barvení redukováno, ale glomerulární C3d (obrázek 3a) a FHR barvení (obrázek 3b) nikoli. Glomerulární C3b/iC3b/C3c zůstaly nezměněny buď s IgG-kontrolou, nebo anti-P. Abnormální lineární vzor barvení glomerulárního properdinu u neléčených Cfh–/– myší9 zůstal 96 hodin po IgG kontrole. U Cfh–/– myší injikovaných buď anti-P nebo IgG-FH1-5 byla hladina glomerulárního properdinu po 96 hodinách téměř nedetekovatelná (obrázek 3b). Neočekávaně vedla injekce anti-P-FH1-5 ke granulárnímu glomerulárnímu barvení pomocí protilátek anti-properdin, anti-FH/FHR a anti-IgG (obrázek 3b). Toto zjištění naznačuje, že protein anti-P-FH1-5 se ukládá v glomerulech. Injekce anti-P-FH1-5 proteinu myším divokého typu vedla k glomerulárnímu barvení protilátkami anti-properdin, anti-FH/FHR a anti-IgG po 96 hodinách (doplňkový obrázek S3), což naznačuje, že toto činidlo interaguje s normálními glomeruly. Spekulovali jsme však, že anti-P-FH1-5 protein by mohl také interagovat s již existujícím glomerulárním properdinem u Cfh–/– myší. Když jsme injikovali činidlo do Cfh–/– myší, které byly předem ošetřeny anti-P k odstranění glomerulárního properdinu, došlo ke snížení granulárních vzorců barvení pomocí anti-properdin, anti-FH/FHR a anti-IgG protilátek ( Doplňkový obrázek S4). Tato pozorování ukazují, že glomerulární interakce anti-P-FH1-5 proteinu u Cfh–/– myší je částečně závislá na glomerulárním properdinu.

IgG-FH1-5 zlepšilo poškození ledvin během akcelerované sérové ​​nefrotoxické nefritidy u Cfh–/– myší

U pacientů s C3G může dojít k rozvoji akutního poškození ledvin v souvislosti s interkurentními infekcemi. Například ztráta renální funkce u nefropatie FHR5 je spojena s epizodami synfaryngitní makroskopické hematurie.17 Základní dysregulace C3 u pacientů s C3G pravděpodobně vede k zesílenému poškození ledvin zprostředkovanému komplementem po spouštěči, které vede k zánětu ledvin. Abychom to mohli modelovat, vyvolali jsme akcelerovanou sérovou nefrotoxickou nefritidu, imunitní komplex

Obrázek 2| Časový průběh profilu plazmatického komplementu u Cfh–/– myší s injekcí IgG-FH1-5 a anti-P-FH1-5. Plazma C3 (a,b), C5 (c,d), FB (e,f) a properdin (P; g,h) od začátku experimentu do 27 dnů po jedné injekci IgG-FH{{1{{21 }}}} (a,c,e,g; červené trojúhelníky, n ¼ 5) nebo anti-P-FH1-5 (b,d,f,h; fialové trojúhelníky, n ¼ 6). Kontroly zahrnovaly anti-P (zelené tečky, n ¼ 5) a monoklonální protilátku se shodným izotypem (kontrola IgG; modré tečky, n ¼ 5). Vodorovné pruhy označují střední hodnoty a vousy označují SD. *P # 0.05, **P # 0,01, ***P # 0,001 oproti hodnotě před ošetřením a odvozeno z 2-analýzy rozptylu s Bonferroniho testem vícenásobného srovnání. FB, faktor B; FH, faktor H.

model glomerulonefritidy, který zahrnuje cesty zprostředkované komplementem a Fc receptorem,18,19 u Cfh–/– myší. Již dříve jsme ukázali, že Cfh–/– myši jsou v tomto nastavení přecitlivělé na poškození ledvin7, a předpokládali jsme, že protein FH1-5 by v tomto modelu mohl zlepšit poškození ledvin zprostředkované komplementem zvýšením regulace AP. Protože naše data naznačovala, že protein anti-P-FH1-5 byl uložen v normálních glomerulech, použili jsme IgG-FH1-5 během akcelerované sérové ​​nefrotoxické nefritidy. Dvacet čtyři hodin před injekcí ovčího nefrotoxického séra myši dostaly ip injekci buď IgG-kontroly (n ¼ 7) nebo IgG-FH 1-5 (n ¼ 8). Experimentální protokol je znázorněn na obrázku 4a. Myši byly vyřazeny 6 dní po podání ovčího nefrotoxického séra. Všechna 3 histologická měření glomerulární patologie (skóre závažnosti, celkový počet buněk a počet makrofágů) byla signifikantně nižší ve skupině IgG-FH1-5 (obrázek 4b). Tubulointersticiální poškození bylo také nižší ve skupině IgG-FH1-5 (obrázek 4b). Sérová močovina byla výrazně zvýšena

Obrázek 3| Imunobarvení glomerulárním komplementem u Cfh–/– myší 96 hodin po injekci buď IgG-FH1-5 nebo anti-P-FH1-5. (a) Reprezentativní snímky spolu s kvantifikací glomerulárních C3b/iC3b/C3c a C3d ve 4 experimentálních skupinách: IgG-FH1-5 (červené trojúhelníky, n ¼ 5), anti-P-FH1-5 (fialové trojúhelníky, n ¼ 6), anti-P (zelené tečky, n ¼ 5) a kontrola IgG (modré tečky, n ¼ 5). (b) Datové body představují střední hodnoty a whiskery označují mezikvartilové rozmezí. Hodnoty P odvozené z Kruskal-Wallisova testu s Dunnovým vícenásobným srovnávacím testem. (b) Reprezentativní snímky glomerulárních IgG, FHR a barvení ve 4 experimentálních skupinách. Pruh ¼ 100 mm. AFU, libovolné fluorescenční jednotky; FH, faktor H; P, správný. Chcete-li optimalizovat zobrazení tohoto obrázku, podívejte se na online verzi tohoto článku na adresewww.kidney-international.org.

IgG-kontrolní skupina, ale změny v sérovém albuminu a poměru albuminu ke kreatininu v moči se nelišily (obrázek 4b). Jak se očekávalo, glomerulární C3b/iC3b/C3c byl významně snížen ve skupině IgG-FH1-5 (obrázek 4b), ale glomerulární myší IgG (obrázek 4b) a ovčí IgG (data nejsou zobrazena) se mezi skupinami nelišily .

Obrázek 4| Předběžná léčba IgG-FH1-5 zlepšila renální poškození během akcelerované sérové ​​nefrotoxické nefritidy u Cfh–/– myší. (a) Schéma protokolu akcelerované sérové ​​nefrotoxické nefritidy. Myši preimunizované ovčím IgG dostaly buď IgG-FH1-5 (ošetřovaná skupina, n ¼ 8) nebo IgG-kontrola (kontrolní skupina, n ¼ 7) 24 hodin před podáním ovčího nefrotoxického séra. (b) Renální funkce a histologie 6 dní po indukci akcelerované sérové ​​nefrotoxické nefritidy u myší léčených buď IgG-FH1-5 (léčba; červené trojúhelníky, n ¼ 8) nebo IgG-kontrola (kontrola; modré kroužky, n ¼ 7). Vodorovné pruhy označují střední hodnoty a vousy označují mezikvartilové rozmezí. *P # 0.05, **P # 0,01, ***P # 0,001 versus kontrola a odvozeno z Mann-Whitneyho testu. FH, faktor H; P, správný.

DISKUSE

Jak IgG-FH1-5, tak anti-P-FH1-5 normalizovaly hladiny C3, FB a C5 u Cfh–/– myší. Toto zjištění je v souladu se skutečností, že regulační domény komplementu myšího FH se nacházejí v doménách SCR 1 až 5 (místo vazby C3b a aktivita kofaktoru pro štěpení C3b zprostředkované faktorem I).20 Domény rozpoznávající povrch, které ovlivňují vazbu na heparin a endoteliální buňky a zahrnují druhé vazebné místo C3b, jsou přítomny v doménách SCR 18 až

20 (FH18-20), a proto nejsou přítomny ve fúzních proteinech.20 Nicméně oba proteiny redukovaly glomerulární iC3b/C3b/C3c, což naznačuje, že FH18-20 nebyl v tomto nastavení vyžadován. Toto zjištění je v souladu s předchozími údaji, které ukazují, že u myší Cfh–/– exprimujících mutantní protein FH sestávající z domén SCR 1 až 15 (Cfh–/– .FHD16-20) se nevyvinula abnormální glomerulární depozice C3.21,22 Zvířata Cfh–/–.FH D16-20 však nebyla schopna regulovat aktivaci C3 podél endotelu ledvin a vyvinula se u nich trombotická mikroangiopatie. Je možné, že vzhledem k absenci povrchově zacílených domén FH18-20 by podávání fúzních proteinů obsahujících FH1-5 v deficitu FH mohlo vést k náchylnosti k trombotické mikroangiopatii. Je také možné, že zvýšená avidita pro vazbu C3b pod dimerní strukturou fúzních proteinů je dostatečná pro kompenzaci nepřítomnosti domén FH18-20 pro povrchové cílení. Povrchové rozpoznání C3b je však také ovlivněno konformačními změnami v FH.23 A Streptococcus pneumoniae FH-vazebný protein (PspCN, který váže SCR doménu 9), spouští FH konformační změnu a komplex FH-PspCN měl zvýšenou vazbu C3b a zvýšená aktivita urychlující rozpad. FH20 C3d-vazebné místo není exponováno ve FH, ale je exponováno v komplexu FH-PspCN. To by mohlo vysvětlovat, proč FH19-20 interaguje s povrchem C3d, ale FH nikoli.24,25 Domníváme se, že naši agenti mohou prostřednictvím konformačních změn účinně interagovat jak s kapalnou fází, tak s povrchem C3b. Pozoruhodné je, že jak IgG-FH1-5, tak anti-P-FH1-5 chránily erytrocyty před lýzou v testu hemolýzy závislé na AP.

Žádný fúzní protein nesnižoval glomerulární C3d barvení, možná kvůli přetrvávající povaze glomerulárního C3d. U experimentální imunokomplexní nefritidy se glomerulární C3c upravil do 24 hodin po ukončení aktivace komplementu, ale C3d přetrvával týdny.16 Navíc glomerulární C3d je perzistentní u lupusové nefritidy.26 To pravděpodobně odráží jeho kovalentní interakci s glomerulárními povrchy. Opakované injekce lidského FH myším Cfh–/– ukázaly snížení glomerulárního C3d během 10 dnů.11 Je pravděpodobné, že opakované dávkování IgG-FH1-5 by mohlo v tomto modelu snížit glomerulární C3d. Nedošlo také k žádné změně v glomerulárním FHR barvení. O funkcích myších FHR proteinů je známo jen málo, ale mohou interagovat jak s C3b27,28, tak C3d.27 Ve skutečnosti je zjevná afinita FHR-A i FHR-B k C3d silnější než afinita FH.27 Spekulujeme, že glomerulární FHR proteiny se pravděpodobně vyloučí z glomerulů pouze tehdy, když byl odstraněn C3d. V této souvislosti je pozoruhodné, že v lidském C3G se protein 5 související s faktorem H asociuje s glomerulárním C3d.29

Anti-P-FH1-5 protein snižoval hladiny volného properdinu v plazmě, jak se očekávalo, protože anti-properdinová část tohoto fúzního proteinu může blokovat aktivitu AP (v důsledku vyčerpání properdinu) po dobu 8 dnů po jediné injekci.30 naše data ukázala, že účinnost FH1-5 při zvyšování plazmatických hladin C3 a snižování glomerulárního C3b/iC3b/C3c barvení byla srovnatelná mezi 2 fúzními proteiny (tj. byla nezávislá na zacílení properdinu). Navíc abnormální barvení glomerulárního properdinu bylo významně sníženo po podání buď anti-P nebo IgG-FH1-5. Je zřejmé, že na rozdíl od proteinů C3d a FHR je glomerulární properdin po obnovení regulace C3 snadno odstraněn. Glomerulární properdin se po podání anti-P-FH1-5 proteinu změnil, ale to bylo komplikováno pozorováním, že jsme detekovali ukládání tohoto fúzního proteinu jak v Cfh–/–, tak v glomerulech divokého typu. To bylo částečně způsobeno interakcí s glomerulárním properdinem, ale ukládání v glomerulech divokého typu naznačilo, že je také částečně zcela nezávislé na glomerulárním komplementu a pravděpodobně souvisí s fyzikálně-chemickými vlastnostmi fúzního proteinu.

Naše kinetická data prokázala nová zjištění týkající se časových změn v FB, C5 a properdinu, které doprovázejí zvýšení C3 u Cfh–/– myší po injekci fúzních proteinů. Hladiny FB po injekci rychle vzrostly

a vrátily se na výchozí hodnoty v době, kdy hladiny C5 i properdinu zůstaly zvýšené. Hladiny properdinu u Cfh–/– myší byly sníženy na začátku a zvýšeny na normální hladiny (20 mg/ml30) po injekci IgG-FH1-5 a zůstaly na těchto hladinách po dobu nejméně 14 dnů. Podobný časový průběh byl pozorován pro vzestup plazmatických hladin C5. Překvapivě IgG-FH1-5 většinou chyběl v oběhu po 11 dnech, což naznačuje, že tvorba C5 konvertázy u Cfh–/– myší je pomalejší než u C3 konvertázy (protože hladiny C3 se vrátily na výchozí hodnotu mezi 7 a 11 dnů). C5 v plazmě se zvýšil po léčbě anti-P a dále se zvýšil s proteinem anti-P-FH1-5. Jak cílení na properdin, tak účinky FH1-5 tedy přispívaly ke zvýšeným hladinám C5 a naznačují, že konvertáza C5 je u Cfh–/– myší částečně závislá na properdinu. Toto zjištění je v souladu se zlepšením dysregulace C5 u myší s kombinovaným deficitem FH a properdinu.8,9 Hladiny cirkulujícího properdinu mohou být u C3G sníženy a zdá se, že korelují s aktivitou povrchové C5 konvertázy na rozdíl od plazmatického C5 nebo rozpustného C5b{ {30}}.31,32 Naše data podporují úzké spojení mezi hladinami properdinu a aktivitou C5 konvertázy a podporují použití hladin properdinu jako biomarkeru probíhající glomerulární aktivace C5.

Je pozoruhodné, že protein IgG-FH1-5 byl stále detekovatelný v oběhu až 11 dní po jedné injekci. To je mnohem déle než to, co jsme dříve uvedli pro nekonjugovaný myší protein FH1-5, který byl odstraněn z oběhu během 24 hodin.14 Toto zjištění ukazuje, že delší plazmatický poločas IgG-FH{ {9}} protein je odvozen z konjugace protilátky. Plazmatický poločas IgG-FH1-5 proteinu byl také delší než to, co jsme dříve pozorovali u FH plné délky.10,11 Například lidský FH byl odstraněn z oběhu za 96 hodin po jediné injekci u Cfh–/– myší.11 V kombinaci s našimi údaji prokazujícími účinnost proteinu IgG-FH1-5 v regulaci komplementu se domníváme, že konjugace proteinu FH1-5 k prodloužení jeho farmakokinetického profilu má potenciální léčebný utility v C3G.

V souhrnu jsme ukázali, že navzdory chybějícím doménám rozpoznávání povrchu byly fúzní proteiny FH1-5 účinné při snižování glomerulární aktivace C3 a obnově regulace plazmatického komplementu při nedostatku FH. V konjugaci domén FH1-5 k anti- properdinu nebyla žádná zjevná výhoda a protein IgG-FH1-5 redukoval poškození ledvin u experimentální nefritidy. Na rozdíl od problémů při výrobě přípravků FH ve velkém měřítku pro terapeutické použití je výroba terapií na bázi protilátek ve velkém měřítku dobře zavedena, což z IgG-FH1-5 činí atraktivní potenciální terapeutikum pro C3G.

METODY

Fúzní proteiny

IgG-FH1-5. Propojeno prvních 5 myších domén FH SCR (mFH1-5).

na necílený IgG1 myší Ig (antiidiotypická protilátka vytvořená proti myší monoklonální protilátce).

Anti-P-FH1-5. Myší FH1-5 spojený s myší anti-properdinovou protilátkou (anti-P),30 poskytnutou Alexionovi W. Songem, University of Pennsylvania).

Řízení. Kontroly byly izotypově odpovídající necílené myší Ig (IgG-kontrola) a myší anti-properdin (anti-P) (doplňkový obrázek S1). Proteiny byly vytvořeny pomocí vektorů pVEK a buněk Expi293 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), purifikovány pomocí proteinu A (MabSelect SuRe, Cytiva, Marlborough, MA).

AP-specifický hemolytický test

20% normální myší sérum titrované od 60 nM do 0,5 nM bylo inkubováno s králičími erytrocyty (1{4}} buněk/ml) při 37 °C po dobu 30 minut. Uvolňování hemu bylo kvantifikováno spektrofotometricky (optická hustota 415 nm); 100% lýza bylo sérum bez inhibitoru.

Plazmové FB a FH

Plazma byla získána po centrifugaci krve odebrané do zkumavek obsahujících kyselinu ethylendiamintetraoctovou (Sarstedt, Nordrhein-Westfalen, Německo). Proteiny byly měřeny imunotestem kapilární elektroforézy (WES, ProteinSimple, San Jose, CA). Použité protilátky byly polyklonální anti-myší FH protilátka (Alexion Pharmaceuticals, Boston, MA) a anti-myší FB protilátka (Abcam, Cambridge, UK); Byl použit modul WES proti králíkům (ProteinSimple, San Jose, CA). Chemiluminiscenční signály byly analyzovány softwarem Compass for SW (ProteinSimple, verze 5.{6}}.1), kvantifikovány jako plochy píku a normalizovány na kontrolu testu.

Myši

Všechny myši byly umístěny ve specifických podmínkách bez patogenů; postupy byly provedeny podle institucionálních směrnic a schváleny britským Home Office. C57BL/6 myši divokého typu byly zakoupeny od Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) a ​​myši Cfh–/– byly vytvořeny, jak bylo popsáno dříve.7 Myši byly přiřazeny k věku a pohlaví; ekvimolární dávky proteinů byly podávány ip injekcí (1 mg pro anti-properdin a IgG-kontrola; 1,4 mg pro IgG-FH1-5 a anti-P-FH1-5). Zrychlená sérová nefrotoxická nefritida byla indukována iv injekcí ovčího nefrotoxického séra do myší preimunizovaných ovčím IgG.7 Podávání fúzních proteinů bylo provedeno 24 hodin před indukcí ovčího nefrotoxického séra (obrázek 4a).

C3, C5 a volný properdin - properdin nebo vlastní anti-myší C5 potažené na vysoce vazných MSD destičkách. Vázaný "volný" properdin a C5 byly detekovány anti-properdinem (od W. Song) nebo biotinylovaným monoklonálním anti-C5 (Alexion) v kombinaci se streptavidinem-SULFO (MSD, Meso Scale Diagnostics). Chemiluminiscenční signál byl získán pomocí zobrazovače SECTOR S 6000 (MSD, Meso Scale Diagnostics) a analyzován pomocí softwaru MSD Discovery Workbench (Meso Scale

Diagnostika, verze 4.0.12.1). Rekombinantní myší properdin a C5 byly použity jako standardy.

Renální funkce a histologie

Hematurie a proteinurie byly hodnoceny pomocí Hema-Combistix (Bayer, Reading, UK); plazmatická močovina byla změřena a ledvinová tkáň zpracována, jak bylo popsáno dříve.9 Kreatinin v moči byl stanoven ve vzorcích spotové moči pomocí testu Creatinin Companion Protocol (#1012; Excell, Philadelphia, PA) a bodové moči/ plazmatický albumin byl měřen enzymatickým imunosorbentním testem (#E99-134; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Řezy ledvin barvené kyselinou jodovou – Schiffem byly hodnoceny zaslepeným způsobem a seřazeny podle závažnosti glomerulárního a tubulointersticiálního poškození (0 [žádné], 1 [mírné], 2 [střední]). Pro stanovení průměrného počtu glomerulárních buněk bylo hodnoceno deset glomerulů na řez. Imunofluorescenční barvení bylo provedeno na 5-mm kryosekcích namontovaných pomocí média Vectashield s DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Použité protilátky byly polyklonální kozí anti-myší C3b/C3c/iC3b konjugovaný s fluorescein isothiokyanátem (FITC) (1:200; #55500; MP Biomedical, Santa Ana, CA)9; Polyklonální kozí anti-myší IgG konjugovaný s FITC specifickým pro fíkový řetězec (1:400; #F5387; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); FITC-konjugovaný monoklonální myší anti-kozí/ovčí IgG (1:100; #F5137; Sigma-Aldrich); nebo FITC-konjugovaný kozí anti-lidský properdin (1:50; #GAHu/PPD/FITC, Nordic Immuno logic Laboratories, Kodaň, Dánsko).9 Biotinylovaný kozí anti-myší C3d (1:10; # BAF2655; R&D Systems , Minneapolis, MN) byl použit na biotinem blokovaných řezech (Biotin Blocking System; Agilent Dako, Santa Clara, CA) se sekundární protilátkou streptavidin AF488 (1:200; #S-32354; Thermo Fisher Scientific). FH byl vizualizován v přečištěných krysích anti-myších CD16/CD{52}}blokovaných řezech (1:100; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) pomocí kozího anti-lidského FH (1:1000; #A312; Quidel, San Diego , CA) a monoklonální anti-kozí IgG-FITC sekundární protilátka (1:100; klon GT-34; F4891; Sigma-Aldrich). Glomerulární makrofágy byly identifikovány pomocí FITC-konjugovaného potkaního anti-myšího CD68 (FA-11 klon GTX43518; GeneTex, Irvine, CA). Kvantitativní imunofluorescenční analýza byla provedena pomocí optického mikroskopu Leica DM4B spojeného s digitální kamerou Leica DFC700T (Leica Microsystems, Wetzlar, Německo) a softwarem Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Rockville, MD, verze 7). Na jeden řez bylo vyšetřeno deset glomerulů a průměrná intenzita byla vyjádřena v libovolných fluorescenčních jednotkách.

Statistická analýza

Pro statistickou analýzu byl použit GraphPad Prism, verze 8.{1}} (GraphPad, San Diego, CA). Pro analýzu časového průběhu byla použita 2-analýza rozptylu metodou opakovaných měření s Bonferroniho testem vícenásobného srovnání (faktory byly čas a léčba). Při srovnávání více skupin byl použit Kruskal-Whitneyův test vícenásobného srovnání a pro 2 skupiny byl použit Mann-Whitneyův test.

ZVEŘEJNĚNÍ

Společnost MCP obdržela poplatky za poradenství od společností Alexion, ChemoCentryx, Novartis, Gyroscope a Achillion Pharmaceuticals. HTC obdrželo poplatky za poradenství od společností Alexion, Novartis, Aurinia a Achillion Pharmaceuticals. YZ, YW, KKJ a SK-K jsou zaměstnanci společnosti Alexion Pharmaceuticals. SK je bývalým zaměstnancem Alexion Pharmaceuticals a v současné době je zaměstnán ve společnosti Gemini Pharmaceuticals. Všichni ostatní autoři deklarovali žádné konkurenční zájmy.

PODĚKOVÁNÍ

MCP je Senior Fellow z Wellcome Trust v klinické vědě (referenční číslo grantu 212252/Z/18/Z) a ACG a DPL jsou podporovány tímto stipendiem. YZ, SK, YW, KKJ a SK-K byly financovány společností Alexion Pharmaceuticals.

DOPLŇKOVÝ MATERIÁL

Doplňkový soubor (PDF)

Obrázek S1. Fúzní proteiny použité v této studii. IgG-FH1-5 obsahuje prvních 5 domén myšího faktoru H (FH1-5) spojených s necílovým myším Ig. Anti-P-FH1-5 se skládá z mFH1-5 spojeného s neutralizační myší anti-myší protilátkou properdinu (anti-P; viz Miwa et al.30). Kontrolní proteiny zahrnovaly izotypově shodný necílený myší Ig (IgG-kontrola) a neutralizační myší anti-myší properdin protilátku (Anti-P). Obrázek S2. Analýza WES blot k detekci FH1-5 ve vzorcích plazmy od myší s deficitem FH, kterým byl injikován buď (A) IgG-FH1-5 nebo (B) Anti-P-FH1-5. 94-kDaIgheavychainlinkedtomouseFH1-5 (HC-FH1-5) je zjistitelný až 11 dní po injekci IgG-FH1-5 a až 4 dny po injekci anti-P-FH1-5 proteinu (červená políčka Kontroly zahrnovaly plazmu od myší divokého typu, kde je detekován protein faktoru H plné délky (FH, černé skříňky, dráha C1) a myší bez injekce s deficitem FH, kde není evidentní žádný FH (černé skříňky, dráha C2,). Jak se očekávalo, ani FHnorFH1-5 není detekovatelný ve vzorcích plazmy od myší, kterým byla injikována kontrola Anti-P nebo IgG.

Obrázek S3. Glomerulární komplementové imunobarvení 96 hodin po injekci IgG-kontroly nebo anti-P-FH1-5 u myší divokého typu. Jsou zobrazeny reprezentativní glomerulární snímky (sloupec ¼ 100 mm).

Obrázek S4. Úloha properdinu na ukládání anti-P-FH1-5 v glomerulech myší s deficitem FH. Myším Cfh–/– byla injekčně podána buď IgG-kontrola, nebo anti-P (léčba 1), po 24-hodinách později buď IgG-kontrola nebo anti-P-FH1-5 (léčba 2). Zvířata byla vyřazena 120 hodin po ošetření jedna a bylo hodnoceno glomerulární barvení na IgG, properdin a FH/FHR. Jsou zobrazeny reprezentativní obrázky. Injekce anti-P výrazně snížila barvení properdinu (řádek 1, sloupec 2), ale ne FH/FHR (zůstává nezměněno) nebo IgG (zůstává nepřítomné). Podání anti-P-FH1-5 24-hodin po IgG kontrole vedlo k výskytu granulárního barvení anti-IgG, anti-FH/FHR a anti-P protilátkami, jak bylo vidět po injekci anti-P-FH 1-5 samostatně (viz obrázek 3b). Toto granulární barvení bylo redukováno, když injekci anti-P-FH1-5 předcházela injekce anti-P, která vyčerpává jak cirkulující (viz obrázek 1h), tak glomerulární (viz obrázek 3b). Glomerulární barvení anti-IgG bylo evidentní pouze u myší injikovaných anti-P-FH1-5 (řádek 3, sloupce 3 a 4) a bylo významně nižší u myší, které dostaly anti-P-FH1-5 předchází anti-P. Došli jsme k závěru, že ukládání anti-P-FH1-5 v glomerulech Cfh–/– myší bylo částečně závislé na properdinu. Vodorovné pruhy označují střední hodnoty a vousy označují mezikvartilové rozmezí. P-hodnota byla odvozena z Mann-Whitneyho testu. Tyč ¼ 100 mm.

REFERENCE

1.FakhouriF, Frémeaux-Bacchi V, Noöl LH, et al C glomerulopathy∶ new dasification. Nat Rev Nephrol.20106:494-499.

2 SmithRH.AppeG8.BlomAMet aLC3gkomeripatie – pochopení vzácného skutečného onemocnění vyvolaného komplementem. Nat ReyNephrol.{4}}

3. Pickering MC, Cook HT. Translační série minirevizí o faktoru komplementu H: onemocnění ledvin spojená s faktorem komplementu H, nové poznatky od lidí a zvířat. Cin Exp Immunol.2008;151:210-230.

4. Daha MR Fearon DT Austen KF, C3nechritický faktor （C3NeF）∶stabilizace tekuté fáze a konvertáza alternativní dráhy vázané na buňky. J Immunol 1976; 116:1-7.

5. Mollnes TE, Ng YC, Peters DK, et al účinek nefritického faktoru na C3 a na terminální dráhu komplementu in vivo a in vitro. Oin Exp Immunol. 1986; 65:73-79.

6. Nq YC, Peters DK. G3 nefritický faktor (C3NeF): disociace buněčně vázané a tekuté fáze stabilizace alternativní dráhy C3 konvertázy. Cn Exp Imunol.19865:450-457.

7. Pickering MC, Cook HT, Warren J a kol. Nekontrolovaná aktivace C3 způsobuje membranoproliferativní glomerulonefritidu u myší s deficitem komplementového faktoru H. Nat Genert.2002:31;424-428.

8. Lesher AM, Zhou L, Kimura Y, a kol. Kombinace mutace faktoru H a deficitu properdinu způsobuje těžkou glomerulonefritidu C3. J Am Soc Nephrol. 2013;24:53–65.

9. Ruseva MM, Veron KA, Lesher AM, et al. Ztráta properdinu zhoršuje C3 glomerulopatii vyplývající z nedostatku faktoru H. J Am Soc Nephrol. 2013; 24:43-52.

10. Paixao-Cavalcante D, Hanson S, Botto M, et al. Faktor H usnadňuje clearance iC3b vázaného na GBM řízením aktivace C3 v tekuté fázi. Mol Immunol.2009;46:1942-1950.

11Fakhouri F, de Jorge EG. Brune F, et al. Léčba lidským faktorem H komplementu rychle zvrátila ukládání komplementu v ledvinách u myší s deficitem faktoru H. Kidney Int.2010:78:279-286.

12. Michelfelder S, Parsons J, Bohlender Ll, et al Mossem produkovaný, glykosylací optimalizovaný lidský faktor H pro terapeutické použití při poruchách komplementu. JAm Soc Nephrol.201728:1462-1474.

13. Nichols EM, Barbour TD, Pappworth Y, et al Rozšířená molekula faktoru H mini-komplementu zlepšuje experimentální glomerulopatii C3. Kidney Int. 201588:1314-1322.

14. Ruseva MM, Peng T, Laser MA, et al. Účinnost cílené inhibice komplementu u experimentální glomerulopatie C3. J Am Soc Nephrol. 2016; 27:405-416.

15. Yang Y, Denton H, Davies OR a kol. Upravený konstrukt komplementového faktoru H pro léčbu glomerulopatie C3. J Am Soc Nephrol. 2018; 29:1649-1661.

16. Schulze M, Pruchno CJ, Burns M, et al. Glomerulární C3clokalizace indikuje pokračující tvorbu imunitních depozit a aktivaci komplementu u experimentální glomerulonefritidy. Am J PatholL. 1993:142179-187.

17. Athanasiou Y, Voskarides K Gale DP, et al. Familiární C3 glomerulopatie spojená s mutacemi CFHRS klinické charakteristiky 91 pacientů v 16 rodokmenech. CTn JAm Soc Nephrol.20116:1436-1446.

18. Kaneko Y, Nimmer动hn F, Madaio MP a kol. Patologie a ochrana u nefrotoxické nefritidy je určena selektivním zapojením specifických Fc receptorů. J Exp Med.2006;203:789-797.

19. Sheerin NS, Springall T, Carroll MC a kol. Ochrana proti antiglomerulární bazální membráně (nefritida zprostředkovaná GBM u myší s deficitem C3-a C{4}}. C Exp Immunol. 1997;110:403-409.

20. Cheng ZZ Hellwae J, Seeberger H a kol. Srovnání povrchového rozpoznávání a vazebných vlastností C3b myšího a lidského komplementového faktoru H.Mol Immunol.2006;43.972-979.

21dp jikry EG. Macor P.Paixao-Caakante D. et al Vývoj typického hemolytického uremického syndromu závisí na komplementu C5.J Am Soc Nephrol.2011;22:137-145.

22.Pdkering MC, de Jorge EG.Martinez-Barricarte Ry a kol. Spontánní hemolytický uremický syndrom spouštěný komplementovým faktorem H postrádajícím povrchové rozpoznávací domény. J Exp Med.2007;204:1249-1256.

23 Herbert AP. Mike E, Chen ZAet al. Vyhýbání se komplementu zprostředkované zvýšením zachyceného faktoru H: důsledky pro ochranu vlastních povrchů před komplementem.J Immunol. 2015;195:4986-4998.

24. Goicoechea de Jorge E Caesar JJ, Malik TH, et al Dimerizace proteinů souvisejících s faktorem H komplementu moduluje aktivaci komplementu v. Proč Natl Acad Sci US A.2013;110:4685-4690.

25. Schmidt CQ, Bai H Lin Z, et al. Racionální inženýrství minimalizovaného imunitního inhibitoru s jedinečnými vlastnostmi trojitého cílení. J Immunol. 2013;190:5712-5721.

26. Wilson HR, Medjera-Thomas NR, Gilmore AC, a kol. Komplex ataku glomerulární membrány není spolehlivým markerem probíhající aktivace C5 u lupusové nefritidy. Kidney Int. 2019.95655-665.

27. Antonioli AH White J, Crawford F, et al. Modulace alternativní dráhy komplementu proteiny myšího faktoru H. J Immunol. 2018; 200:316-326.

28. Cserhalmi M, CsincsiALMezei Z, et al. Myší protein FHR-B související s faktorem H podporuje aktivaci komplementu. Front Immunol.20178:1145.

29. Medjeral-Thomas NR, Moffett H, Lomax-Browne HJ et al Protein 5 související s glomerulárním komplementovým faktorem H (FHR5) je vysoce převládající u glomerulopatie C3 a je spojen s poruchou funkce ledvinKdney Int Ren. 2019; 4:1387-1400.

30. Miwa T, Sato S, Gullipalli D, et al. Blokování properdinu, alternativní cesty, a receptorů anafylatoxinu zlepšují renální ischemicko-reperfuzní poškození u myší s faktorem urychlujícím rozklad a myší s dvojitým knockoutem CD59. J Immunol. 2013;190:3552-3559.

31. Corillo F, Bravo Garcia-Morato M, Nozal P, et al Spotřeba séra properdinu jako biomarker dysregulace C5 konvertázy u C3 glomerulopatie. Clin Exp Immunol.2016;184:118-125.8. Lesher AM, Zhou L Kimura Y, a kol. Kombinace mutace faktoru H a deficitu properdinu způsobuje těžkou glomerulonefritidu C3.JAm Soc Nephrol.2013;2453-65.

32. zhang Y, Nester OM Martin B. et al Definování profilu komplementového biomarkeru glomerulopatie C3. Clin J Am Soc Nephvol.20149:186-1882.