Metody kombinatorické genetiky pro objevování regulačních kombinací vysokého řádu a inženýrské genetické ovladače pro neurální diferenciaci

Ponořte se do hledání účinných faktorů buněčné diferenciace

Vědci se stále snaží najít lepší terapeutika, která by zvrátila nebo zpomalila progresi neurologických poruch, jako je Parkinsonova choroba, Alzheimerova choroba a Huntingtonova choroba. Tyto poruchy jsou výsledkem smrti neuronových buněk v různých částech mozku. Léky nebo léčebné postupy používané ke zmírnění příznaků u pacientů nebyly dobře zavedeny.

Klikněte pro cistanche tubulosa prášek pro neuroprotekci

Neobnovují poškozené nervové tkáně a mohou mít za následek nežádoucí vedlejší účinky. Rostoucí počet studií proto pohlíží na kmenové buňky jako na slibné terapeutikum kvůli jejich schopnostem samoobnovy a flexibilitě diferenciace do požadovaných buněčných linií pro přihojení do pacienta, aby se obnovily ztracené nervové tkáně.

Než však mohou být kmenové buňky klinicky použity při léčbě neurologických poruch, stále existují oblasti, které vyžadují lepší porozumění, aby se naplno rozvinul jejich potenciál. Kmenové buňky jsou regenerativní a tvárné, se sklonem stát se jakýmkoliv buněčným typem, pokud je správně namícháno faktory, které vedou k diferenciaci. Ve velké síti faktorů je však hloubka složitosti.

Je důležité určit kombinace transkripčních faktorů (TF), malých molekul a/nebo růstových faktorů, aby se dosáhlo optimálního synergismu pro diferenciaci kmenových buněk včetně embryonálních kmenových buněk (ESC) a indukovaných pluripotentních kmenových buněk nejrychlejší rychlostí, což vede k v nejčistší populaci neuronální linie. Mohl by však existovat strategický způsob, jak tyto faktory prověřovat hospodárnějším a časově výhodnějším způsobem.

To by pomohlo optimalizovat již zavedené protokoly, které jsou stále pracné, nebo pro další charakterizaci neuronových podtypů, jako jsou střední ostnaté neurony, senzorické neurony a serotonergní neurony. Zůstává výzvou komplexně profilovat hybatele neuronového osudu a definovat, jak se tyto prvky vzájemně ovlivňují v regulační síti.

Několik skupin použilo nové vysoce výkonné screeningové přístupy k objasnění regulační sítě buněčného osudu a poskytlo informativní pohled na faktory, které řídí konverzi neuronů a přežití. Liu a kol. (2018) použili aktivaci CRISPR (CRISPRa) k hledání TF nebo faktorů vážících DNA, které podporují neuronální osud ESC. Práce se však omezila na studium jednotlivých faktorů nebo párových kombinací.

Další systematický screening provedl Tsunemoto et al. (2018), která zkoumala vztah mezi TF. Většina z jejich vybraných jednotlivých TF nevykazovala ve studii žádné účinky, nicméně identifikovali 76 párových kombinací TF na podporu diferenciace myších fibroblastů na indukované neurony.

Je pozoruhodné, že jejich výsledky postrádaly určitou konzistenci s předchozími studiemi, jako je nedetekce dopaminového aktivního transportéru Slc6a3 v indukovaných neuronech, pravděpodobně kvůli vynechání dalších faktorů. Další studie určila základní geny pro udržení nebo zlepšení přežití neuronů provedením screeningu na bázi CRISPR interference (CRISPRi) (Tian et al., 2019). A opět byly omezeny na screening jednotlivých sgRNA.

Pro nezaujatý screening dalších genetických faktorů a pro zvýšení počtu kombinací faktorů jsou zapotřebí další studie, protože se ukázalo, že v různých kontextech může být vyžadován koktejl více než dvou faktorů, aby se účinně řídila diferenciace a přeprogramování.

Dobrým příkladem je kombinace Oct4, Sox2, Klf4 a c-Myc, která je nezbytná pro regulaci vývojové signální sítě pro pluripotenci ESC (Takahashi a Yamanaka, 2006). V takto složitých systémech je potřeba komplexně charakterizovat funkce genetických kombinací vysokého řádu a vysoce výkonným způsobem a metoda Combinatorial Genetics En Masse (CombiGEM) toho může být právě schopna.

Metoda CombiGEM pro vysoce výkonnou, uspořádanou a systematickou kontrolu kombinací faktorů

CombiGEM nabízí nejen systematický způsob provádění sdružených screeningů ve velkém měřítku, ale má také schopnost škálovatelného sestavení kombinatorických genetických knihoven vysokého řádu (Wong et al., 2015, 2016; Zhou et al., 2020). Proces v jedné nádobě umožňuje uživateli prověřovat množství genetických kombinací; 1-way, 2-way, 3-way, a teoreticky n-way knihovny.

To poskytuje rychlou alternativu ke konvenčnímu procesu vytváření a testování jednotlivých kandidátských kombinací, které jsou předmětem zájmu. Zatímco několik dalších kombinatorických screeningových strategií CRISPR bylo také vyvinuto pro studium párových genetických kombinací (Han a kol., 2017; Shen a kol., 2017; Najm a kol., 2018; Truong a kol., 2019; DeWeirdt a kol., 2020 ), CombiGEM nabízí jedinečnou příležitost vyhodnotit interakce mezi třemi nebo více genetickými kombinacemi.

Pokud například uživatel zamýšlí použít CRISPRa nebo CRISPRi pro nadměrnou expresi nebo potlačení seznamu kandidátských kombinací TF, mohl by pomocí CombiGEM-CRISPR v2 prohledat knihovnu s čárovým kódem kombinací sgRNA cílených na TF.0 ( Wong a kol., 2016; Zhou a kol., 2020), jak je znázorněno na obrázku 1.

Použitím ligačních kroků v jedné nádobě se knihovna sgRNA a jejich příslušné čárové kódy začlení do lentivirového cílového vektoru, který hlásí expresi fluorescenčního proteinu po aktivaci promotoru specifického pro typ neuronové buňky, jako je tubulin 1. Knihovna Do požadovaných výchozích buněk lze dodat 1000 ug sgRNA a samostatný lentivirový vektor nesoucí enzymaticky deficitní Cas9 buď fúzovaný s transkripčním aktivátorem nebo represorem.

Postupem času, jak se buňky začnou diferencovat, budou fluorescenci exprimovat pouze buňky podobné neuronu, a tyto buňky lze izolovat pomocí fluorescenčně aktivovaného třídění buněk pro získání jejich kombinací TF pomocí sekvenování čárových kódů.

Pro lepší pochopení kombinací, které řídí specifické buněčné linie, mohou být tyto buňky také testovány na známé reportéry buněčné linie nebo markery na základě preference fází diferenciace, které si uživatel zvolí ke studiu. Magneticky aktivované třídění buněk by mohlo být použito k separaci zájmových buněk v závislosti na expresích markerů buněčného povrchu.

Sekvenování jednobuněčné RNA by mohlo být spojeno s kombinatorickým screeningem CRISPR jako výstup pro profilování typu a úrovní genové up nebo downregulace a kombinaci cílených TF lze určit pomocí čtení čárového kódu (Replogle et al., 2020). Zobrazování s vysokým obsahem by mohlo být použito ke sledování změn buněčné morfologie od časných do pozdějších fází vývoje neuronů.

Fyziologická relevance nebo funkčnost indukovaných buněk podobných neuronu může být stanovena imunocytochemickým značením specifickým pro zrání neuronů, jako je NeuN, TUJ1 a MAP2, a elektrofyziologickými měřeními. Jak již bylo zmíněno dříve, studie kombinovaly TF a malé molekuly, aby manipulovaly s buněčným osudem.

CombiGEM lze také použít k identifikaci kombinací malých molekul, které mohou zachovat samoobnovu kmenových buněk, indukovat diferenciaci buněčné linie nebo usnadnit přeprogramování zvýšením účinnosti a potenciálně nahrazením genetických faktorů. CombiGEM lze také aplikovat tak, že se nejprve určí malé molekulové cíle signálních drah, epigenetických faktorů nebo faktorů buněčného procesu.

Poté prostřednictvím navržení knihovny sgRNA pro aktivaci nebo inaktivaci cílených léčiv lze identifikovat účinné kombinace malých molekul pro zvýšení diferenciace nebo přeprogramování. Tento koncept dobře odrážejí studie, které jsme dříve provedli, abychom objevili cílové kombinace léků proti rakovině a Parkinsonově chorobě (Zhou et al., 2020).

Použití CombiGEM není omezeno pouze na poruchy založené na CRISPR, ale může být také aplikováno na jiné regulační faktory DNA nebo RNA ke studiu screeningu ztráty funkce s RNA interferencí, stejně jako zisků funkce s expresí. mikroRNA (Wong a kol., 2015) a sekvenčně ověřené lidské otevřené čtecí rámce, jako jsou ty, které jsou uvedeny v knihovně lidského TFome (Ng a kol., 2020).

Metoda CombiSEAL pro vysoce výkonné inženýrství transkripčních faktorů

Nalezení ideální kombinace přirozeně se vyskytujících genetických faktorů může stále představovat problémy, jako je omezení na charakterizované TF genomu s předchozími znalostmi o jejich expresi a rolích v diferenciaci. Studie prokázaly, že inženýrství TF nebo generování umělých transkripčních faktorů otevírá novou cestu možností, jak urychlit rychlost diferenciace prostřednictvím alternativních cest, překonat závislost nezbytné exprese jiných endogenních kofaktorů v rámci genové regulační sítě nebo zcela nahradit přirozené TF s účinnějšími (Jauch, 2018).

To umožňuje výzkumníkům přizpůsobit požadované faktory podle jejich experimentálních potřeb. Navrhujeme, že pokud je cílem provádět vysoce výkonnou mutagenezi na více místech na TF, která obsahuje různé domény, CombiSEAL by se mohl ukázat jako užitečná platforma (Choi et al., 2019). Metoda CombiSEAL sestavuje fragmenty DNA kódující aminokyseliny, které jsou kombinatoricky označeny čárovými kódy (obrázek 1).

Obrázek 1 ｜ Metody CombiGEM a CombiSEAL pro screening účinných genetických faktorů diferenciace. Příkladem metody CombiGEM je sestavení více sgRNA exprimovaných ze stejného konstruktu a kombinace sgRNA jsou reprezentovány jejich zřetězenými čárovými kódy. Metoda CombiSEAL zahrnuje mutace zavedené do různých částí proteinu, jako jsou transkripční faktory, označené jako P1, P2, P(n) a P(n plus 1). A kombinace mutací se odráží v jejich odpovídajících zřetězených čárových kódech. Uživatel může nastavení aplikovat na jiné systémy dodávání DNA a v tomto znázornění jsou použity lentivirové vektory. Strategie screeningu mohou být prováděny sdruženým formátem a v tomto příkladu je identifikace buněčných populací, které se diferencují na specifickou neuronovou linii, detekována aktivací promotoru pro expresi fluorescenčního proteinu, označeného v diagramu jako X-fluorescence. Sekvenování nové generace (NGS) čárových kódů ze skupiny buněk dešifruje cíle DNA nebo transkripční variantu (varianty). Přísná analýza faktorů, které řídí diferenciaci různých typů neuronů, by mohla využívat metody založené na poli, jako je sondování buněk pomocí markerů buněčné linie následované magneticky aktivovaným tříděním buněk (MACS) do vícejamkových destiček, které lze sledovat pomocí zobrazování s vysokým obsahem. Alternativně jednobuněčné sekvenování RNA (RNA-Seq) umožňuje uživateli profilovat genové exprese buněk s požadovanými fenotypy a bylo by možné získat čárové kódy pro identifikaci kombinací sgRNA nebo kombinací mutací klíčové varianty (variancí). FACS: Fluorescencí aktivované třídění buněk.

CombiSEAL začíná prvními částmi proteinu, kde je požadována mutageneze. Uživatel může vygenerovat libovolný počet variant pro každou sekci a poté je označit čárovými kódy pro identifikaci pozice a kombinace mutací. Každá zásoba sekcí je pak sestavena postupně jejich vložením do cílového vektoru obsahujícího proteinovou sekvenci divokého typu modifikovanou enzymy lemujícího typu IIS v oblasti zamýšlené mutageneze.

Toto schéma bezjizvové fúze spojující více částí proteinu je důležité, aby se zabránilo přidávání nežádoucích aminokyselin do proteinu. Metoda CombiSEAL umožňuje určovat aminokyselinové sekvence vybraného poolu zájmových variant efektivněji a cenově efektivněji, čímž se vyhne nutnosti dlouhého čtení sekvenování celého proteinu k identifikaci typů mutací a jejich umístění v celém proteinu. protein.

Toto metodické nastavení umožňuje snazší analýzu prováděním vysoce výkonného sekvenování skupiny krátkých zřetězených čárových kódů, které odvozují kombinaci typů a poloh aminokyselinových mutací nebo jiných požadovaných modifikací, jako je záměna domén, inzerce a delece, které byly původně navržený a nainstalovaný na TF

Závěr

Ve srovnání s metodami pokus-omyl byly učiněny pokroky v používání systematičtějších přístupů k určení základních faktorů nebo kombinací potřebných k řízení konverze jednoho buněčného typu na neuronovou linii. Schopnost identifikovat kombinace vyšších řádů však chyběla, a zde navrhujeme, že metoda CombiGEM může být schopna tato omezení řešit.

CombiGEM používá ligační systém s čárovým kódem v jedné nádobě ke spojení kombinací vazebných faktorů DNA vyššího řádu k cílové DNA najednou, čímž se obejde proces více kol screeningu, aby se zúžil počet zásahů na zvládnutelnou velikost pro následné validace. . Kromě toho mohou být méně účinné přirozené TF substituovány umělými nebo upravenými TF, aby se lépe regulovala genová exprese. Popisujeme metodu proteinové mutageneze, CombiSEAL, která uživatelům umožní vytvářet velké zásoby variant transkripčních faktorů přímočarým sestavováním mutací na více místech označených čárovými kódy v proteinu a jejich různých doménách.

To urychlí a sníží náklady na screeningové postupy pro získání informací o typech mutací variant zájmu. Doufáme, že navržené metody mohou pomoci s dalším pochopením a rozšířením možností podpory neurální regenerace a mohou být široce použitelné v jiných oblastech výzkumu.

Mechanismus neuroprotektivního účinku Cistanche

Bylo prokázáno, že Cistanche má neuroprotektivní účinky prostřednictvím několika mechanismů:

1. Protizánětlivé účinky: Cistanche obsahuje sloučeniny, u kterých bylo prokázáno, že inhibují zánět v různých částech mozku, což může pomoci chránit neurony před poškozením.

2. Antioxidační účinky: Cistanche obsahuje sloučeniny, které mají silné antioxidační vlastnosti. Antioxidanty pomáhají chránit neurony před poškozením způsobeným volnými radikály a oxidačním stresem.

3. Regulace neurotransmiterů: Bylo prokázáno, že Cistanche reguluje některé neurotransmitery, jako je serotonin a dopamin, které mohou pomoci chránit neurony a zlepšit kognitivní funkce.

4. Stimulace neurotrofických faktorů: Bylo prokázáno, že Cistanche stimuluje produkci neurotrofických faktorů, jako je neurotrofický faktor odvozený od mozku (BDNF), který může podporovat růst a přežití neuronů.

Celkově tyto mechanismy spolupracují na ochraně neuronů před poškozením, podporují jejich růst a přežití a zlepšují kognitivní funkce.

Reference

Choi GCG, Zhou P, Yuen CTL, Chan BKC, Xu F, Bao S, Chu HY, Thean D, Tan K, Wong KH, Zheng Z, Wong ASL (2019) Hromadná kombinatorická mutageneze optimalizuje aktivity úpravy genomu SpCas9. Metody Nat 16:722-730.

DeWeirdt PC, Sanson KR, Sangree AK, Hegde M, Hanna RE, Feeley MN, Griffith AL, Teng T, Borys SM, Strand C, Joung JK, Kleinstiver BP, Pan X, Huang A, Doench JG (2020) Optimalizace AsCas12a pro kombinatorické genetické screeningy v lidských buňkách. Nat Biotechnol 39:94-104.

Han K, Jeng EE, Hess GT, Morgens DW, Li A, Bassik MC (2017) Synergické kombinace léků pro rakovinu identifikované ve screeningu CRISPR pro párové genetické interakce. Nat Biotechnol 35:463- 474.

Jauch R (2018) Přeprogramování buněčného osudu pomocí inženýrství nativních transkripčních faktorů. Curr Opin Genet Dev 52:109-116.

Najm FJ, Strand C, Donovan KF, Hegde M, Sanson KR, Vaimberg EW, Sullender ME, Hartenian E, Kalani Z, Fusi N, Listgarten J, Younger ST, Bernstein BE, Root DE, Doench JG (2018) Orthologous CRISPR- Enzymy Cas9 pro kombinatorické genetické screeningy. Nat Biotechnol 36:179-189.

Ng AHM, Khoshakhlagh P, Rojo Arias JE, Pasquini G, Wang K, Swiersy A, Shipman SL, Appleton E, Kiaee K, Kohman RE, Vernet A, Dysart M, Leeper K, Saylor W, Huang JY, Graveline A, Taipale J, Hill DE, Vidal M, Melero-Martin JM a kol. (2020) Komplexní knihovna lidských transkripčních faktorů pro inženýrství buněčného osudu. Nat Biotechnol doi: 10 1038/s41587-020-0742-6.

Replogle JM, Norman TM, Xu A, Hussmann JA, Chen J, Cogan JZ, Meer EJ, Terry JM, Riordan DP, Srinivas N, Fiddes IT, Arthur JG, Alvarado LJ, Pfeiffer KA, Mikkelsen TS, Weissman JS, Adamson B (2020) Kombinační jednobuněčné CRISPR screeningy přímým zachycením vodící RNA a cíleným sekvenováním. Nat Biotechnol 38:954- 961.

Shen JP, Zhao D, Sasik R, Luebeck J, Birmingham A, BojorquezGomez A, Licon K, Klepper K, Pekin D, Beckett AN, Sanchez KS, Thomas A, Kuo CC, Du D, Roguev A, Lewis NE, Chang AN , Kreisberg JF, Krogan N, Qi L a kol. (2017) Kombinatorické screeningy CRISPRCas9 pro de novo mapování genetických interakcí. Metody Nat 14:573-576.

Takahashi K, Yamanaka S (2006) Indukce pluripotentních kmenových buněk z myších embryonálních a dospělých kultur fibroblastů pomocí definovaných faktorů. Buňka 126:663-676.

Tian R, Gachechiladze MA, Ludwig CH, Laurie MT, Hong JY, Nathaniel D, Prabhu AV, Fernandopulle MS, Patel R, Abshari M, Ward ME, Kampmann M (2019) Platforma založená na interferenci CRISPR pro multimodální genetické obrazovky v lidském iPSC -odvozené neurony. Neuron 104:239-255.

Truong VA, Hsu MN, Kieu Nguyen NT, Lin MW, Shen CC, Lin CY, Hu YC (2019) CRISPRai pro současnou aktivaci a inhibici genů pro podporu chondrogeneze kmenových buněk a regeneraci kosti lýtkové kosti. Nucleic Acids Res 47:e74. Wong AS, Choi GC, Cheng AA, Purcell O, Lu TK (2015) Masivně paralelní kombinatorická genetika vysokého řádu v lidských buňkách. Nat Biotechnol 33:952-961.

Wong AS, Choi GC, Cui CH, Pregernig G, Milani P, Adam M, Perli SD, Kazer SW, Gaillard A, Hermann M, Shalek AK, Fraenkel E, Lu TK (2016) Multiplexní čárový kód CRISPR-Cas9 screening povolený CombiGEM . Proc Natl Acad Sci USA 113:2544-2549.

Zhou P, Chan BKC, Wan YK, Yuen CTL, Choi GCG, Li X, Tong CSW, Zhong SSW, Sun J, Bao Y, Mak SYL, Chow MZY, Khaw JV, Leung SY, Zheng Z, Cheung LWT, Tan K , Wong KH, Chan HYE, Wong ASL (2020) Třícestný kombinatorický screening CRISPR pro analýzu interakcí mezi cílenými léky. Cell Rep 32:108020.

Dawn GL Thean, Alan SL Wong*