Cistanche Tubulosa indukuje druhem reaktivní kyslíkem zprostředkovanou apoptózu primárních a metastatických lidských rakovinných buněk tlustého střeva

ÚVOD

Kolorektální karcinom je celosvětově jedním z nejčastějších nádorů (Brennera kol., 2014) a její výskyt se neustále zvyšuje s odhadovanými 2,4 miliony případů v roce 2035, a to v důsledku moderní stravy a životního stylu spolu se sníženou fyzickou aktivitou. Současné úsilí není dostatečné pro boj se současnou epidemií kolorektálního karcinomu, a proto jsou zapotřebí nové přístupy pro účinnou prevenci a léčbu včetně změn životního stylu v kombinaci s bezpečnějšími alternativními intervencemi, jako je např.Fytoterapeutika (Weidnera kol., 2015). Fytoterapie, využívání léčivých rostlin k léčbě nemocí, byla nevyhnutelnou součástí dávné historie lidstva. Léčivé rostliny jsou již dlouho využívány jako alternativní zdroje léčby rakoviny a představují více než šedesát procent protirakovinných látek používaných v konvenční medicíně (Balunas a Kinghorn, 2005; Saibua kol., 2015). Některé z nejznámějších příkladů zahrnují výtažky zCatharanthus roseusG. Don. (Apocynaceae), Taxus baccata L. (Taxaceae) a Camptotheca acuminate Decne (Nyssaceae) (Cragg a Newman, 2005; da Rochaa kol., 2001). Bylo prokázáno, že několik bylinných extraktů a fytochemikálií má protinádorové účinky u kolorektálního karcinomu přisuzované indukci produkce reaktivních forem kyslíku (ROS) a související apoptóze rakovinných buněk jako v případě extraktů zMelissa officinalis(Weidnera kol., 2015)

Mezi kandidáty na fytoterapeutikuCistanche tubulosa, Orobanchaceae parazitická pouštní rostlina (Jiang et al., 2009), která je široce rozšířena v suchých a polosuchých oblastech Afriky, Asie a Středomoří, má prokazatelně cenné léčivé vlastnosti. Cistanche tubulosa je široce používána v tradiční medicíně a předpokládá se, že má léčebné účinky při nedostatku ledvin, chorobné leukoree, metroragii, ženské neplodnosti a stařecké zácpě (Jiang et al., 2009). vlastnosti Cistanche Tubulosa byly v posledním desetiletí intenzivně studovány včetně vazorelaxačních (Yoshikawa et al., 2006), hepatoprotektivních (Morikawa et al., 2010), antihyperglykemických a hypolipidemických účinků (Xiong et al., 2013). Cistanche Tubulosa byla také navržena jako silný posilovač imunitního systému, promotor tvorby kostí a prostředek proti stárnutí a únavě (Xu et al., 2014). Dále bylo prokázáno, že extrakt z Cistanche tubulosa blokuje ukládání amyloidu v modelu Alzheimerovy choroby (Wu et al., 2015). Přes různé terapeutické použití nebyl účinek Cistanche Tubulosa jako potenciálního protirakovinného činidla dosud studován.

V této práci jsme zkoumali protirakovinný účinek Cistanche Tubulosa na dvě primární a dvě metastatické buněčné linie rakoviny tlustého střeva a potenciální mechanismy, které jsou základem tohoto účinku.

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO ZLEPŠENÍ SEXUÁLNÍ FUNKCE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

MATERIÁLY A METODY

Sběr a příprava rostlinného extraktu

Vzorky Cistanche tubulosa byly odebrány z pouštních oblastí v Kataru v roce 2014 a pravost rostliny byla potvrzena herbatologem. Vzorky voucherů jsou archivovány na Toxikologickém a víceúčelovém oddělení v ADLQ. Vzorky rostlin vysušené na slunci byly rozemlety pomocí Retsch Knife Mill Grindomix GM300 na jemný prášek. Dvacet gramů prášku bylo extrahováno 200 ml ultračisté vody přes noc při 37 stupních na rotační třepačce při 200 ot./min. HrubýExtrakty z Cistanche tubulosa (CTE)byly centrifugovány po dobu 30 min při 8000 ot./min, aby se peletovaly nerozpustné sloučeniny, supernatant byl shromážděn a lyofilizován za použití Labconco Freezone 6 plus Freeze dryer. Vysušený extrakt byl rekonstituován v Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, SIGMA, Německo) na koncentraci 20 mg/ml a sterilně zfiltrován přes 0,{8}}mikronový membránový filtr.

Buněčné linie a buněčná údržba

Buněčné linie lidského karcinomu tlustého střeva CaCo2, SW620 a LoVo byly získány od Cell Lines Service (CLS, Eppelheim, Německo), zatímco buněčná linie HCT 116 byla laskavým darem z oddělení biologických a environmentálních věd na Katarské univerzitě. CaCo2 a HCT11 byly odvozeny z primárního místa karcinomu tlustého střeva, zatímco SW620 a LoVo byly odvozeny z metastatického místa. Buňky SW620, HCT116 a LoVo byly kultivovány a udržovány v médiu DME, zatímco buňky CaCo2 byly udržovány v Eagleově minimálním základním médiu (EMEM, SIGMA, Německo). Buňky byly pěstovány jako monovrstva kultivovaná při 37 stupních v příslušném médiu doplněném 10% fetálním bovinním sérem (FBS, SIGMA, Německo) a 1% penicilin/streptomycin (SIGMA, Německo) ve zvlhčené atmosféře obsahující 5% oxidu uhličitého.

Test životaschopnosti buněk

K hodnocení cytotoxické aktivity CTE podobně, jak bylo popsáno dříve (Jaganjac et al., 2010). Hustota naočkování buněk CaCo2, HCT116, SW620 a LoVo kultivovaných v 96-jamkových destičkách byla 104 buněk na jamku. Buňky byly naneseny do příslušného média doplněného 10% FBS 24 hodin před ošetřením. Po 24 hodinách bylo médium odstraněno a buňky byly ošetřeny 0, 0,25, 0,5, 1 a 2 mg/ml CTE po dobu 24, 48 a 72 hodin při 37 stupních ve zvlhčené atmosféře obsahující 5 % C02. Po ošetření CTE bylo médium odstraněno a do každé jamky bylo přidáno 40 ul roztoku MTT (0,5 mg/ml).

Po 3 hodinách inkubace byl MTT roztok odstraněn, formazanový produkt rozpuštěn v dimethylsulfoxidu (DMSO, SIGMA, Německo) a absorbance byla měřena při 590 nm pomocí čtečky mikrodestiček (Infinite 200 PRO NanoQuant, Tecan Trading AG, Švýcarsko) .

Test apoptózy

Apoptóza v buňkách CaCo2, HCT116, SW620 a LoVo byla detekována pomocí PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I s 7-amino-aktinomycinem D (7-AAD) jako životně důležitým barvivem (Becton Dickinson International, Belgie) podle pokynů výrobce. Stručně řečeno, buňky byly nasazeny na 24-jamkové destičky v hustotě 5×104 buňky/jamka v příslušném médiu doplněném 10% FBS po dobu 24 hodin před přidáním CTE (0, 0,5 nebo 1 mg/ml). Po inkubaci 24 CTE byly buňky sklizeny, dvakrát promyty studeným fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem a barveny fykoerythrinem (PE) Annexinem V a 7-AAD po dobu 15 minut při teplotě místnosti ve tmě. Obarvené buňky byly analyzovány během 1 hodiny průtokovou cytometrií za použití FACS. Průtokový cytometr Aria III a software FACSDiva (Becton Dickinson) při nízkém průtoku s minimálně 104 buňkami. Ošetření buněk po dobu 4 hodin 6 uM kamptotecinem (SIGMA) bylo použito jako pozitivní kontrola pro test.

Intracelulární produkce ROS

Intracelulární produkce ROS byla zkoumána pomocí 2,7- dichlordihydrofluorescein diacetátu (DCFH-DA, SIGMA, Německo). DCFH-DA je nefluorescenční sonda, která se oxiduje intracelulárním ROS na fluorescenční sloučeninu 2,7- dichlorfluorescein (DCF) (Poljak-Blazi et al., 2011). Test DCFH DA byl proveden podobně, jak jsme popsali dříve (Cindric et al, 2013; Poljak-Blazi et al., 2011). Stručně, hustota naočkování buněk CaCo2, HCT116, SW620 a LoVo kultivovaných v 96-černých destičkách s jamkami byla 104 buněk na jamku. Buňky byly umístěny na 24 hodin do příslušného média doplněného 10% FBS. Před ošetřením byly buňky inkubovány s 10 uM DCFH-DA při 37 stupních po dobu 30 minut v 5% C02 / 95% vzduchu. Buňky byly poté promyty a ošetřeny 0, 0,5 a 1 mg/ml CTE v médiu bez fenolové červeně. Intracelulární tvorba ROS byla monitorována kontinuálně po dobu 25 hodin při 37 stupních a 5 % CO2 za použití čtečky mikrodestiček s horním modulem pro kontrolu fluorescence a plynu (Infinite 200 PRO, Tecan Trading AG, Švýcarsko). Intenzita fluorescence byla měřena s excitační vlnovou délkou 500 nm a detekcí emise při 529 nm. Libovolné jednotky, relativní fluorescenční jednotky (RFU), byly založeny přímo na intenzitě fluorescence.

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO ZLEPŠENÍ FUNKCE LEDVIN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Generování mitochondriálního superoxidu

Schopnost CTE indukovat tvorbu superoxidu mitochondriemi byla odhadnuta pomocí sondy MitoSOX Red (Life Technologies) a Hoechst 33342 pro nukleární barvení (Life Technologies) propustné pro mitochondrie. Buňky CaCo2, HCT116, SW620 a LoVo byly nasazeny na 96-jamkové destičky v hustotě 104 buňky na jamku v příslušném médiu doplněném 10% FBS po dobu 24 hodin . Buňky byly poté naplněny 4 uM MitoSOX a 2 uM Hoechst 33342 po dobu 20 minut, přebytek barviva byl promyt a jamky ošetřeny 0, 0,5 a 1 mg/ml CTE po dobu 24 hodin při 37 stupních a 5 % CO2. Intenzita fluorescence byla měřena s excitační vlnovou délkou 510 nm a emisní detekcí při 580 nm pro MitoSOX a excitační vlnovou délkou 350 nm a emisní detekcí při 461 nm pro Hoechst 33342 pomocí čtečky mikrodestiček se špičkovou fluorescencí (Infinite 200 PRO, Tecan Trading AG, Švýcarsko)

Statistická analýza

Popisné statistiky byly uvedeny jako průměr +/- SD. Významnost rozdílů mezi skupinami byla hodnocena pomocí Studentova t-testu a Chi-kvadrát testu. Když byly porovnány více než dvě skupiny, použili jsme jednostrannou ANOVA s příslušným post hoc testováním. Byl použit SPSS 11.{6}}1 pro Mircosoft Windows. Rozdíly s P menším než 0,05 byly považovány za statisticky významné.

VÝSLEDEK

Účinek CTE na proliferaci lidských buněčných linií rakoviny tlustého střeva je znázorněn na obrázku 1. Všechny testované koncentrace CTE ukázaly silný inhibiční účinek na buněčnou linii CaCo2 v závislosti na koncentraci a čase (obrázek 1A). 72 hodin léčby CTE inhibovalo růst buněk CaCo2 o více než 60 % ve srovnání s kontrolou (p < 0.05 pro všechny koncentrace). Významný dopad léčby CTE na růst buněk HCT116 byl také detekován ve všech časových bodech při dvou nejvyšších koncentracích (1 mg/ml a 2 mg/ml), přičemž při druhé koncentraci bylo dosaženo více než 70% snížení (obrázek 1B, p < 0,05). Ačkoli dvě nižší koncentrace CTE (0,25 a 0,5 mg/ml) významně snížily růst buněk HCT116 po 24 hodinách (p<0.05), they had no significant effect following 72 hours of treatment compared to control (p>{{0}}.{{10}}5). Inhibice proliferace pomocí CTE závislá na čase a koncentraci byla dále potvrzena u buněk LoVo o více než 60 % při nejvyšší koncentraci (p < 0.05) (obrázek 1C), a všechny čtyři testované koncentrace CTE snižovaly růst buněk SW620 po 48 hodinách (obrázek 1D, p < 0.05 pro všechny). Po 72 hodinách léčby byl stejný účinek pozorován pouze u dvou nejvyšších koncentrací (p < 0,05), zatímco koncentrace 0,25 a 0,5 mg/ml nevykazovaly žádný významný účinek ve srovnání s kontrolou (p > 0,05). Dopad léčby 0,5 a 1 mg/ml CTE na indukci apoptózy byl dále testován u všech čtyř buněčných linií (obrázek 2). Zvýšený počet buněk v časné apoptóze byl detekován v HCT116 a LoVo po 24-hodinovém ošetření 0,5 mg/ml (p<0.05, Figure 2B and 2C) and in all cell lines at 1 mg/mL (p<0.05). A significant increase in necrotic or late apoptotic cell number was further observed in CaCo2 and SW620 cell lines (p<0.05, Figure 2A and 2D). The ability of CTE to induce intracellular ROS production is demonstrated in Figure 3. Three hours following CTE treatment there was a strong increase in intracellular ROS production in all cell lines (p<0.05). The intracellular ROS production increased progressively throughout the 25 hours of treatment in a time and concentration-dependent manner. Furthermore, the staining of cells with a mitochondria-targeted probe revealed a strong impact of CTE on mitochondrial superoxide production in a concentration-dependent manner (Figure 4). The highest increase in superoxide production by mitochondria was observed in HCT116 (69%, Figure 4B) and LoVo cells (82%, Figure 4C) following 24-hour treatment with 1 mg/mL of CTE.

Obr. 1:ÚčinekCistanche tubulosana životaschopnost buněčných linií rakoviny tlustého střeva. Životaschopnost buněk měřená MTT testem (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo a (D) buněk SW620 je prezentována jako procento kontrolní neošetřené buněčné linie rakoviny tlustého střeva. Jsou uvedeny průměrné hodnoty (±SD) pro 5 opakování reprezentativního experimentu: (*) významnost p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

Obr. 2: Vodní extrakt Cistanche tubulosa indukuje apoptózu v lidských buňkách rakoviny tlustého střeva. Anexin-V-FITC průtokové cytometrické analýzy buněk (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo a (D) SW620 jsou uvedeny jako procento kontrolní neošetřené buněčné linie rakoviny tlustého střeva. Jsou uvedeny průměrné hodnoty (±SD) pro 3 replikáty reprezentativního experimentu: (*) významnost p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

Obr. 3: Vodní extrakt Cistanche tubulosa indukuje intracelulární produkci ROS v závislosti na čase a dávce. Produkce ROS měřená testem DCFH-DA v buňkách (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo a (D) SW620 je prezentována jako průměrné hodnoty RFU (±SD) pro příslušné 5- replikáty reprezentativní experiment. (*) Význam Str<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells. 

Obr. 4: Vodní extrakt Cistanche tubulosa indukuje produkci mitochondriálního superoxidu v lidských buňkách rakoviny tlustého střeva. Intenzita fluorescence sondy MitoSOX Red cílené na mitochondrie v buňkách A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo a (D) SW620 jsou uvedeny jako procento kontrolní neošetřené buněčné linie rakoviny tlustého střeva. Jsou uvedeny průměrné hodnoty (±SD) pro 5 opakování reprezentativního experimentu: (*) významnost p<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells.

DISKUSE

Ačkoli dřívější studie uváděly četné léčivé vlastnosti Cistanche tubulosa, toto je první zpráva o jeho antiproliferativním účinku na maligní buňky. Bioaktivní sloučeniny Cistanche tubulosa extrahované vodou, vysoce polárním rozpouštědlem, vykazovaly silnou protirakovinnou bioaktivitu. Již dříve jsme porovnávali účinnost Cistanche tubulosa solubilizované ve vodě proti jiným rozpouštědlům, jako je methanol a ethylacetát, ale nejslibnější protirakovinné aktivity vykazovaly vodné extrakty (data nejsou uvedena).

Prokázali jsme schopnost CTE při 1 mg/ml a 2 mg/ml inhibovat 60 % růstu buněčných linií primárního i metastatického karcinomu tlustého střeva, což odhaluje potenciálně důležitou roliCistanche tubulosajako léčba rakoviny tlustého střeva. Ve srovnání s normálními buňkami jsou rakovinné buňky obecně charakterizovány poruchou redoxní homeostázy a běžnou strategií současných protinádorových terapií je zvýšení buněčného oxidačního stresu (Yang et al, 2013). Ačkoli fyziologicky nízké hladiny ROS mají důležitou roli jako signální molekuly, nadměrná produkce ROS může přispět k nestabilitě a malignitě rakoviny (Liou a Storz, 2010). Paradoxně tato nerovnováha v buněčné redoxní homeostáze činí rakovinné buňky zranitelnějšími vůči buněčné smrti vyvolané ROS (Jaganjac et al., 2008; Nogueira a Hay, 2013). Antiproliferativní účinek CTE uváděný v této studii může být zprostředkován různými extra- a intracelulárními mechanismy známých a neznámých sloučenin v extraktu, které se zaměřují na více cest, které hrají zásadní roli v apoptóze. Abychom odlišili různé způsoby buněčné smrti, zkoumali jsme potenciální mechanismus zodpovědný za pozorovanou cytotoxicitu indukovanou CTE.

EXTRAKT CISTANCHE TUBULOSA Anti Alzhermer's PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Naše data ukazují, že CTE zvyšuje intracelulární produkci ROS a následně ROS-indukovanou buněčnou smrt. Redoxní stav buňky také hraje klíčovou roli v regulaci apoptózy a mitochondriální elektronový transportní řetězec je jedním z hlavních míst tvorby buněčného ROS (Trachootham et al., 2008). Kromě toho by intracelulární ROS mohl způsobit buněčnou apoptózu prostřednictvím mitochondrií závislých i nezávislých drah (Sinha et al., 2013). Naše data také naznačují, že externalizace fosfatidylserinu indukovaná CTE je běžným účinkem při apoptóze, jak u primárních, tak u metastatických rakovinných buněčných linií, což naznačuje, že mechanismus smrti indukované CTE je zprostředkován spíše apoptózou než nekrózou. Aktivace apoptózy v rakovinných buňkách je korektivní strategií a mnoho protirakovinných léčiv může vykazovat apoptotické účinky v rakovinných buňkách.

Sloučeniny nebo extrakty s proapoptotickými aktivitami v rakovinných buňkách jsou proto potenciálně užitečné ve výzkumu protirakovinných léčiv (Wong, 2011). Abychom určili, zda je proapoptotický účinek vyvolaný CTE zprostředkován mechanismem ROS indukovaným mitochondriemi, měřili jsme produkci superoxidu pomocí fluorescenční sondy zaměřené na mitochondrie v buňkách ošetřených CTE. Naše data jasně ukazují, že CTE stimuluje produkci mitochondriálního superoxidu, což naznačuje, že protirakovinná aktivita Cistanche tubulosa je alespoň částečně zprostředkována mechanismem ROS indukovaným mitochondriemi.

ZÁVĚRY

Na závěr naše data naznačují, že vodní extrakt pouštní rostliny Cistanche tubulosa může představovat slibného kandidáta na protirakovinný přístup v kombinaci s jinými konvenčními terapiemi pro prevenci a léčbu rakoviny tlustého střeva. Ukazujeme také, že toxicita rostlinného extraktu proti rakovinným buňkám je zprostředkována zvýšenou intracelulární produkcí ROS a alespoň částečně apoptózou závislou na mitochondriích. Probíhají další studie s cílem izolovat a charakterizovat jednotlivé biologicky aktivní složky odpovědné za protirakovinnou aktivitu.

K vyhodnocení potenciálního použití tohoto extraktu jako účinného chemopreventivního činidla a k pochopení mechanismů působení na buňky rakoviny tlustého střeva na molekulární úrovni je zapotřebí další výzkum. K potvrzení pozorovaných příznivých účinků na zdraví jsou také zapotřebí další preklinické a klinické studieCistanche tubulosa pro prevenci rakoviny.

 CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE KÁVA ZLEPŠUJE PAMĚŤ PROTI ÚNAVĚ PHGS75% ECH 30% ACT 12%