Cistanche zlepšuje infekci ledvin v důsledku systémového lupus erythematodes

CD4 reaktivní s jaderným antigenem^Plusbuňky expandují v aktivním systémovém lupus erythematodes, produkují efektorové cytokiny a infikují ledviny

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Dimas Abdirama, Sebastian Tesch atd

Systémovýlupuserythematodesje systémové a chronické autoimunitní onemocnění charakterizované ztrátou tolerance vůči jaderným antigenům s autoreaktivním CD4^PlusT buňky zapojené do patogeneze onemocnění. Od detekce lidského autoantigen-specifického CD4 je však známo velmi málo o jejich receptorové specifitě^PlusT buňky byly extrémně náročné. Zde uvádíme analýzu CD4^Plus T buňky reagující na jaderné antigeny pomocí dvou komplementárních metod: knihovny T buněk a obohacení T buněk reaktivních na antigen. Frekvence CD4 specifického pro jaderný antigen^Plus T buňky korelovaly se závažností onemocnění. Tyto autoreaktivní T buňky produkují efektorové cytokiny, jako je interferon-g, interleukin-17 a interleukin-10. Ve srovnání s krví byly tyto buňky obohaceny v moči pacientů s aktivní lupusovou nefritidou, což naznačuje infiltraci infikovanýchledviny. Tyto dříve nerozpoznané charakteristiky tedy podporují roli A CD4 specifického pro jaderný antigen^PlusT buňky vsystémovélupuserythematodes.

Copyright ª 2020, International Society of Nephrology. Vydalo Elsevier Inc. Toto je článek s otevřeným přístupem pod licencí CC BY-NC-ND

KLÍČOVÁ SLOVA: lupuserythematodes, ledviny,

Systémovýlupuserythematodesje systémové a chronické autoimunitní onemocnění charakterizované ztrátou tolerance vůči jaderným antigenům v důsledku vadné likvidace biologického odpadu, jako je apoptotický materiál obsahující ribonukleoproteiny a nukleozomy.1 Autoprotilátka namířená proti jaderným antigenům je charakteristickásystémovélupuserythematodesa obvykle se vyskytuje před manifestním onemocněním. Navíc autoreaktivní CD4^PlusT buňky se účastní patogenezesystémovélupuserythematodespodporou produkce autoprotilátek B buňkami a přímou propagací poškození orgánů v infikovaných cílových orgánech. Ačkoli detekce T lymfocytů reaktivních na jaderný antigen byla popsána již dříve, důkazy o jejich existenci zůstávají až dosud obvodové a v současné době není jasné, jak se ovlivňují v patogenezi. Pochopení toho, jak se tyto buňky účastní autoimunity, bude rozhodující pro návrh účinné léčby.

Detekci autoantigen-specifických T buněk brání jejich mimořádně nízké frekvence v cirkulující krvi. Předchozí studie lidského naivního CD4^PlusRepertoáry T-buněk používají technologii založenou na tetramerech k účinnému poskytování přesných informací o odpovědích T-buněk na specifické epitopy antigenu; tato metoda však vyžaduje předchozí znalost typů lidských leukocytárních antigenů dárce. Alternativní techniky pro současnou detekci a počítání vzácných populací T-buněk s reaktivitou na různé antigeny bez předchozí znalosti typů lidských leukocytárních antigenů byly vyvinuty pomocí knihoven amplifikovaných polyklonálních T-buněk a obohacením CD154-exprimujících T-buněk po stimulaci s antigenem nazývaným ARTE (antigen-reactive Tcell obohacení).

Systémovýlupuserythematodesje škodlivé proledviny, ale cistanche se může zlepšitledvinafunkcí.

CD4^Plus T buňky uplatňují svou funkci hlavně prostřednictvím sekrece cytokinů po aktivaci antigenu16 a šířením zánětu tkáně, jako je např.lupuszánět ledvincož představuje jednu z nejzávažnějších komplikacísystémovélupuserythematodes. Analýza repertoáru T-buněk přítomných vledvinabiopsie od pacientů slupuszánět ledvinodhalila oligoklonalituledvina- infiltrace CD4^Plus T buňky, což ukazuje na akumulaci antigen-specifických T buněk u infikovanýchledviny. Naše předchozí studie odhalila močové T buňky u pacientů s aktivnílupus zánět ledvinjako přesný biomarker, který se podobá fenotypu intrarenálních buněk. I když jsou tyto buňky obohaceny o CXC chemokinový receptor 3 a CC chemokinový receptor 5 exprimující T buňky svědčící o populaci pomocných T buněk 1 (Th1) a obsahují CD154^PlusT lymfocyty svědčí o nedávném setkání s antigenem, jejich antigenní specificita vůči jaderným antigenům zůstává nejasná.

V této studii prezentujeme analýzu CD4^Plus T buňky reagující na jaderné antigeny u celkem 17 zdravých jedinců, 12 jedinců s neaktivnímisystémovélupuserythematodes, a 20 subjektů s aktivnísystémovélupuserythematodespomocí knihoven T-buněk a technik ARTE k analýze frekvencí autoreaktivního CD4^Plus T buňky v periferní krvi a moči pacientů slupuszánět ledvinstejně jako produkci cytokinů.

VÝSLEDEK

CD4 reaktivní s jaderným antigenem^PlusT buňky jsou expandované neaktivní systémový lupus erythematodes, jak bylo stanoveno pomocí knihovny T buněk a ARTE

s aktivnímsystémovélupuserythematodes. Tyto buňky byly také detekovatelné u 5 ze 6 pacientů s neaktivnísystémovélupuserythematodes, zatímco pouze 3 ze 6 zdravých kontrol byly uvedeny v oběhuautoreaktivníT buňky. Zajímavé je, že pacienti s aktivnísystémovélupuserythematodestaké vykazovaly širší škálu autoreaktivních T-buněčných odpovědí, přičemž každý pacient měl reaktivní T-buňky proti alespoň 3 jaderným antigenům. Ve srovnání s tím bylo cílové portfolio méně variabilní u pacientů s neaktivnímisystémovélupuserythematodesa zdravé kontroly. Celkově vzato, cirkulující nukleární antigen-reaktivní T buňky nejsou výlučné prosystémovélupuserythematodes, přesto neaktivnísystémovélupuserythematodes, jejich počet je větší a jejich cílové struktury variabilnější.

Protože autoreaktivní T buňky hrají roli při šíření autoimunitních reakcí, porovnali jsme počet autoreaktivních T buněk se závažností onemocnění, hodnocenou pomocísystémovélupuserythematodesindex aktivity onemocnění (systémovélupuserythematodesDAI) skóre. Pouze frekvence CD4^PlusT buňky reaktivní na RNP70, Ro a La pozitivně korelovaly ssystémovélupuserythematodesDAI (RNP70: P ¼ 0.{5}}4, r ¼ 0,4865; Ro: P ¼ 0.005 r=0,6299, La: P=0,01, r=0,5651) (obrázek 1d). Naproti tomu frekvence T lymfocytů reaktivních na transthyretin byla nalezena na dosti podobné úrovni ve všech 3 skupinách (obrázek 1e), čímž se zamítá možné experimentální zkreslení způsobené obecnou neantigenně specifickou hyperreaktivitou T lymfocytů neaktivnísystémovélupuserythematodes.

Knihovny T-buněk nabízejí řadu výhod včetně vysoké citlivosti pro detekci velmi vzácných buněk v rámci nízkého počtu vstupních buněk. Tato technika se však opírá o expanzi buněk, která může změnit složení buněk a poskytuje pouze omezenou možnost fenotypově charakterizovat reaktivní buňky. Proto jsme svá pozorování ověřili metodou ARTE. Protokol ARTE vyžaduje větší množství vstupních buněk, což je zvláště náročné u pacientů ssystémovélupuserythematodeskteří se často projevují lymfopenií a anémií. Kvůli tomuto omezení a také kvůli zvýšení očekávaného počtu reaktivních buněk jsme shromáždili všech 5 kanonických jaderných antigenů a použili tento soubor ke stimulaci mononukleárních buněk periferní krve (PBMC) před obohacením buněk exprimujících CD154- (n ¼ 15 pacientů ssystémovélupuserythematodes; n ¼ 6 zdravých kontrol). Použitím kombinace povrchových markerů CD154 a CD69 reagují T buňky nasystémovélupuserythematodes-asociované jaderné antigeny mohly být identifikovány v základní populaci (obrázek 1f). Přestože exprese pozadí CD154 a CD69 byla hojně pozorována u všech jedinců, pacientů s aktivnísystémovélupuserythematodesměli významně zvýšené frekvence CD154 plus CD69 plus T buněk při stimulaci jadernými antigeny ve srovnání se stimulací pozadí (P ¼ 0,008), zatímco zdraví jedinci a pacienti s neaktivnísystémovélupuserythematodesměly podobné frekvence mezi antigenem stimulovanými a nestimulovanými buňkami (zdraví jedinci: P ¼ 0.44; pacienti s neaktivnísystémovélupuserythematodes: P ¼ {{0}}.56) (obrázek 1g). Odečtením frekvencí pozadí byly frekvence T buněk reaktivních na jaderný antigen vyšší u pacientů s aktivním onemocněním než u zdravých jedinců a pacientů s neaktivním onemocněním (P ¼ 0.02 a P ¼ 0,11) (obrázek 1h). Frekvence T-buněk reaktivních na nukleární antigen s odečtením pozadí tak pozitivně korelovala s aktivitou onemocnění (P ¼ 0,004, r ¼ 0,5978), což naznačuje jejich potenciální roli vsystémovélupuserythematodes.

Knihovny T-buněk nabízejí řadu výhod včetně vysoké citlivosti pro detekci velmi vzácných buněk v rámci nízkého počtu vstupních buněk. Tato technika se však opírá o expanzi buněk, která může změnit složení buněk a poskytuje pouze omezenou možnost fenotypově charakterizovat reaktivní buňky. Proto jsme svá pozorování ověřili metodou ARTE. Protokol ARTE vyžaduje větší množství vstupních buněk, což je zvláště náročné u pacientů se systémovým onemocněnímlupuserythematodeskteří se často projevují lymfopenií a anémií. Kvůli tomuto omezení a také kvůli zvýšení očekávaného počtu reaktivních buněk jsme shromáždili všech 5 kanonických jaderných antigenů a použili tento soubor ke stimulaci mononukleárních buněk periferní krve (PBMC) před obohacením buněk exprimujících CD154- (n ¼ 15 pacientů ssystémovélupuserythematodes; n ¼ 6 zdravých kontrol). Použitím kombinace povrchových markerů CD154 a CD69 reagují T buňky nasystémovélupuserythematodes-asociované jaderné antigeny mohly být identifikovány v základní populaci (obrázek 1f). Přestože exprese pozadí CD154 a CD69 byla hojně pozorována u všech jedinců, pacientů s aktivnísystémovélupuserythematodesměl významně zvýšené frekvence CD154^PlusCD69^PlusT buňky při stimulaci jadernými antigeny ve srovnání se stimulací na pozadí (P ¼ 0,008), zatímco zdraví jedinci a pacienti s neaktivnísystémovélupuserythematodesměly podobné frekvence mezi antigenem stimulovanými a nestimulovanými buňkami (zdraví jedinci: P ¼ 0.44; pacienti s neaktivnísystémovélupuserythematodes: P ¼ {{0}}.56) (obrázek 1g). Odečtením frekvencí pozadí byly frekvence T buněk reaktivních na jaderný antigen vyšší u pacientů s aktivním onemocněním než u zdravých jedinců a pacientů s neaktivním onemocněním (P ¼ 0.02 a P ¼ 0,11) (obrázek 1h). Frekvence T-buněk reaktivních na nukleární antigen s odečtením pozadí tak pozitivně korelovala s aktivitou onemocnění (P ¼ 0,004, r ¼ 0,5978), což naznačuje jejich potenciální roli vsystémovélupuserythematodespatogeneze (obrázek 1i). Navíc CD4^PlusT buňky reagující na vyvolávací antigen Candida albicans MP65 vykazovaly podobné frekvence napříč dárci (obrázek 1j), s vyloučením možnosti obecného zkreslení směrem k vyšším frekvencím antigen-reaktivních T buněk u pacientů s aktivnísystémovélupuserythematodes.

Souhrnně naše data generovaná pomocí knihovny T-buněk a metod ARTE ukazují expanzi autoantigen-specifického CD4^PlusT lymfocyty u pacientů s aktivsystémovélupuserythematodes. Obě techniky jsou srovnatelné, jak ukazují podobné hodnoty středního stimulačního indexu mezi antigenem stimulovanými a nestimulovanými odpověďmi T-buněk (střední index stimulace - knihovna T-buněk: 1,857; ARTE: 1,614; P ¼ 0,33), ačkoli technika ARTE odhalila vyšší frekvence CD4 reaktivního na jaderný antigen^Plus T lymfocyty než technika knihovny T lymfocytů (obrázek 1k).

Cistanchemůže zlepšit infekciledvina.

Nukleární antigen-reaktivní T buňky u zdravých jedinců jsou bona fife autoreaktivní CD4^PlusT buňky

Jak knihovna T-buněk, tak techniky ARTE demonstrovaly detekciautoreaktivníT buňkyu zdravých jedinců, které představují možný původ pro rozvoj lidské autoimunity. Jejich počet se však významně nelišil od frekvencí pozadí, takže není jisté, zda zdravé subjekty skutečně musí cirkulovat CD4 reaktivní s jaderným antigenem^PlusT buňky. Abychom odhalili antigenní specificitu autoreaktivních T buněk u zdravých jedinců, vytvořili jsme jednotlivé klony T buněk z CD154^PlusCD69^PlusCD4^PlusPrekurzory T-buněk izolované od zdravých jedinců po stimulaci PBMC jednotlivými jadernými antigeny a kontrolním antigenem odvozeným z lyzátu Aspergillus fumigatus. Značný početsystémovélupuserythematodes-asociované autoantigen-specifické klony T-buněk reagovaly na své odpovídající antigeny po restimulaci antigenu, jak je zvýrazněno koexpresí IFN-g s CD154 (počet specifických klonů – Aspergillus fumigatus: 5 z 5; SmD1: 4 z 8; RNP70: 3 z 11; histon: 5 z 5; Ro: 4 z 9; La: 5 z 7) (doplňkový obrázek S2A a B). Navíc antigenní odpověď (reprezentativně ukázána pro SmD1) byla závislá na dávce, což zdůrazňovalo, že T buňky reaktivní na jaderný antigen u zdravých jedinců jsou bona fife autoreaktivní CD4^PlusT buňky (doplňkový obrázek S2C). Potvrdili jsme tak existenci jaderných antigen-reaktivních T buněk u zdravých jedinců v rámci signálu pozadí aplikovaných detekčních metod.

Cytokinová produkce jaderných antigen-reaktivních CD4 plus T buněk

Dále jsme zkoumali produkci cytokinů CD4 reaktivního na jaderný antigen^PlusT buňky. Buňky exprimující CD154-byly obarveny intracelulárně na efektorové cytokiny, jako je IFN-g, interleukin (IL)-17, IL-4 a IL-10 po stimulaci směsísystémovélupuserythematodes-asociované jaderné antigeny (obrázek 2a). Frekvence IFN-g–, IL-17– a IL-10–produkujících CD154^PlusCD4^PlusT buňky byly významně zvýšeny u pacientů s aktivnísystémovélupuserythematodes(všechny cytokiny: P ¼ {{0}},004), zatímco frekvence autoreaktivních T buněk produkujících IL-4 zůstala nerozeznatelná od frekvence pozadí (P ¼ 0,125) (obrázek 2b). Absolutní počty autoreaktivních T buněk produkujících IFN-g a IL-10 byly navíc vyšší u pacientů s aktivnísystémovélupuserythematodesnež u zdravých jedinců a pacientů s inaktivsystémovélupuserythematodes(Obrázek 2b). Odečtením frekvencí pozadí se pacienti s aktivnísystémovélupus erythematodesměli významně vyšší frekvence autoreaktivních T buněk produkujících IFN-g a IL-10 než zdraví jedinci (IFN-g: P ¼ 0.003; IL{{5} }: P ¼ 0,004), stejně jako IFN-g–, IL-17– a IL-10–produkující autoreaktivní T buňky než pacienti s neaktivnímisystémovélupuserythematodes(IFN-g: P ¼ 0.002; IL-17: P ¼ 0.00 2; IL-10: P ¼ 0.005) (obrázek 2c). Frekvence IFN-g– a IL-10 – ale ne IL-17– a IL-4–produkujících jaderný antigen – reaktivních T buněk korelovala s aktivitou onemocnění. Pouze frekvence buněk produkujících IL-4 však vykazovala menší korelaci s aktivitou onemocnění (IFN-g: P < 0.0001,="" r="" ¼="" 0,7574;="" il{{20}="" }:="" p="" ¼="" 0,005,="" r="" ¼="" 0,5889;="" il-4:="" p="" ¼="" 0,14,="" r="" ¼="" 0,3717;="" il-="" 10:="" p="" ¼="" 0,0004,="" r="" ¼="" 0,6927)="" (obrázek).="" soudě="" podle="" frekvence="" producentů="" ifn-g,="" antigen-reaktivní="">^PlusT buňky byly převážně z linie Th1. Naproti tomu IL-17, stejně jako producenti IL{2}}, byly detekovány pouze v nižších frekvencích.26 Ve srovnání s hladinami autoprotilátek jsou frekvence CD4 produkujících cytokiny^PlusT buňky nekorelovaly s koncentrací anti-dvořetězcové DNA a se sérovým titrem antinukleárních protilátek (doplňkový obrázek S3A a B). Žádná další korelace mezi CD4 reaktivním na jaderný antigen^PlusByly pozorovány T buňky a autoprotilátky s výjimkou La-reaktivního CD4^PlusT buňky směrem k autoprotilátkám La (doplňkový obrázek S3C).

Detekce nukleárních antigen-reaktivních CD4 plus T buněk v moči pacientů s aktivním systémovým lupus erythematodes a lupusovou nefritidou

Populace Th1 buněk reaktivních na jaderný antigen je podezřelá z invazeledvinatkáně, kde se mohou setkat se svým téměř všudypřítomným příbuzným antigenem. Zkoumáním repertoáru receptoru T-buněk (TCR)-b CD4^PlusT buňky izolované z periferní krve ve srovnání s těmi izolovanými z moči 5 pacientů ssystémovélupuserythematodesa aktivnílupuszánět ledvinjsme pozorovali oligoklonálně zkreslený TCR repertoár buněk derivovaných z moči (obrázek 3a). Kumulativní frekvence 20 nejhojnějších klonů T-buněk byla významně vyšší v moči, což odpovídá nižšímu indexu diverzity (doplňkový obrázek S4A). Testovat, zda tyto buňky také vykazují reaktivitu na sadusystémovélupuserythematodes-asociované jaderné antigeny, jsme vytvořili knihovny sestávající z močového CD4^PlusT buňky izolované od 3 pacientů ssystémovélupuserythematodesa aktivnílupuszánět ledvin(Doplňkový obrázek S4B). Močový CD4^Plus T cells were metabolically and functionally active cells indicated by the ability to proliferate upon stimulation with SEB but with signs of exhaustion shown by a reduced proliferation capacity after polyclonal activation (Supplementary Figure S4C and D). Because of these circumstances, only microcultures with a SEB stimulation index of >4 byly zahrnuty pro výčet CD4 v moči^PlusT buňky specifické pro individuální jaderný antigen. Souběžně s močovým CD4^PlusT buňky, frekvence jaderného antigen-reaktivního CD4^PlusByly stanoveny T buňky v periferní krvi, což umožňuje přímé srovnání příslušných frekvencí u stejných jedinců (obrázek 3b). Zjistili jsme, že je neaktivnílupuszánět ledvin, frekvence močového nukleárního antigenu-reaktivního CD4^PlusT buňky byly vyšší než v periferní krvi. Pro potvrzení tohoto pozorování jsme označili močové buňky izolované ze 4 aktivníchlupuszánět ledvindárci s karboxyfluorescein sukcinimidyl esterem a smíchali značené buňky s PBMC odpovídajícími dárci, aby bylo možné přímé srovnání antigen-reaktivních buněk v 1 testu pomocí techniky ARTE. Frekvence CD154^PlusCD69^PlusT buňky ve stimulovaných a nestimulovaných vzorcích dárcovských buněk moči a periferní krve byly použity k posouzení, zda jsou T buňky reaktivní na jaderný antigen obohaceny v moči jako náhrada zaledvinavýpočtem stimulačního indexu (obrázek 3c). Ačkoli se urinární knihovna T-buněk a metody ARTE lišily ve svém středním indexu stimulace od jaderných antigenů (stimulační index – knihovna močových T-buněk: 17; ARTE: 2,79; P ¼ 0,4) (obrázek 3d) , analýza autoreaktivity periferního a močového CD4^Plus T buňky z obou metod (celkem n ¼ 7) vykazovaly zvýšený index stimulace specifické pro jaderný antigen v moči (P ¼ 0.0156) (obrázek 3e). Tato pozorování naznačují, že nukleární antigen-reaktivní CD4^PlusT buňky napadají a hromadí se vinfikovanýledviny. Tedy lokální zánět tkáně vsystémovélupuserythematodesmůže být antigen-specifický jev a přímo modulovaný infiltracíautoreaktivníT buňky.

Chcete-li pokračovat, pro část 2 klikněte zde.