Cistanche zlepšuje infekci ledvin v důsledku systémového lupus erythematodes
Mar 13, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Pro část 1 klikněte zde.
DISKUSE
Charakteristickým znakem je přerušení tolerance vůči jaderným antigenůmsystémové lupuserythematodesa kromě B buněk se předpokládá, že autoreaktivní T buňky hrají ústřední roli v její patogenezi. Nicméně jako detekce (auto)antigen-specificCD4Plus T buňky stále představují velkou výzvu ve výzkumu autoimunity, k dnešnímu dni je ve skutečnosti málo známo o CD4 reaktivním na jaderný antigenPlusT buňky vsystémovélupuserythematodes.
Nedávno byly vyvinuty nové metody detekce a stanovení počtu antigen-specifických CD4PlusByly vyvinuty T buňky. Přístup knihovny T-buněk využívá předchozí polyklonální expanzi T-buněk k umožnění detekce vzácných antigen-specifických klonů T-buněk. Tato strategie nabízí vysokou citlivost a umožňuje práci s omezeným množstvím buněk. Pomocí této techniky jsme byli schopni prokázat reaktivní T buňky proti 5 kanonickým jaderným antigenům u pacientů s aktivnísystémovélupuserythematodes. Nevýhody detekce založené na knihovně jsou, kromě toho, že je náročná na práci, že nelze vyloučit růst nebo ztrátu určitých klonů během fáze expanze a omezené možnosti pro fenotypovou analýzu buněk.
Standardní cytometrie je omezena počtem detekovatelných událostí, což obvykle omezuje analýzu vzorků na populaci s frekvencemi nad 0,01 procenta. Naše pozorování pomocí knihovny T-buněk odhalilo, že frekvence cirkulujícího autoreaktivního CD4PlusT buňky pro konkrétní autoantigen u pacientů se vzplanutím onemocnění byly w20 buněk v milionu buněk, což představuje frekvenci 0,002 procenta; tedy detekce autoantigen-specifického CD4PlusT buňky používající standardní, nemanipulovanou cytometrii je téměř nemožné. Bacher a kol. zavedeno předběžné obohacení CD4PlusT buňky, které reagují na konkrétní antigeny před získáním na jiné cytometrii, známé jako metoda ARTE. Přijetí tohoto přístupu pro detekci CD4 specifického pro jaderný antigenPlusT lymfocytů, jsme byli schopni potvrdit naše zjištění a prokázat expanzi CD4 reaktivního na jaderný antigenPlusT buňky jsou aktivnísystémovélupuserythematodes. Pozoruhodné je, že frekvence T buněk reaktivních s transthyretinem a C. Albicans byla lhostejná mezi zdravými kontrolami a pacienty ssystémovélupuserythematodess různou aktivitou onemocnění. Proto pozorované rozšířeníautoreaktivníT buňkypravděpodobně není výsledkem obecné hyperreaktivity neaktivnísystémovélupuserythematodesale expanze antigen-specifických T buněk.
Thesystémový lupus erythematodesinfikujeledvina, takže cistanche se používá k ochraněledviny.
Předchozí zprávy již prokázaly existenciautoreaktivníT buňkyvsystémovélupuserythematodesprimárně pomocí proliferace, produkce cytokinů nebo upregulace aktivačních markerů, i když bez možnosti kvantifikovat jasnou populaci těchto buněk. Nejlepší důkazy o frekvenci T lymfocytů specifických pro jaderný antigen existují pro reaktivitu proti malému ribonukleoproteinu U1, charakteristickému autoantigennímu cíli u smíšeného onemocnění pojivové tkáně a který se vyskytuje pouze u zlomku pacientů ssystémovélupuserythematodes. U1 malý jaderný ribonukleoprotein – reaktivní CD4PlusT lymfocyty byly stanoveny pomocí limitního ředění a enzymatického imunospotového testu (ELISPOT) a bylo hlášeno, že se vyskytují s frekvencí (40 až 250) 106 T buněk a (20 až 60) 106 PBMC, což je podobné velikost jako frekvence autoreaktivních buněk v naší studii. V naší práci jsme zkoumali reaktivitu vůči několika charakteristikámsystémovélupuserythematodes- asociované jaderné antigeny. Je zajímavé, že ačkoli všichni pacienti s aktivní LN vykazovali zvýšené frekvence antinukleárního antigenu-reaktivního CD4PlusT lymfocyty se pacienti lišili ve svém cílovém portfoliu a reaktivita byla zaměřena proti širší sadě antigenů ve srovnání s pacienty s neaktivnísystémovélupuserythematodes. Biologický význam toho není v současné době znám. Různé CD4PlusReaktivity T buněk se mohou spojovat s určitými klinickými projevy různých reaktivit, které mohou být pro patogenezi onemocnění nadbytečné.
Podobně jako u jiných autoimunitních onemocnění se nám také podařilo prokázat existenci autoreaktivního CD4PlusT buňky u zdravých jedinců, i když v mnohem nižších frekvencích ve srovnání s pacienty s aktivním systémovým lupus erythematodes. Tyto buňky byly nedetekovatelné porovnáním počtu aktivovaných buněk se stimulací antigenem nebo bez ní, dokonce i s tak vysoce citlivými technikami, jako jsou knihovny T-buněk nebo metody ARTE. Jednobuněčným klonováním jsme však byli schopni prokázat, že signál „pozadí“ skutečně obsahoval autoantigen-specifický CD4PlusT buňky. Které konkrétní události vedou k porušení tolerance a zvyšování četnostiautoreaktivníT buňkyzůstává spekulativní; nicméně naše data ukazují, že expanze autoreaktivních klonů hraje roli v patogenezi systémového lupus erythematodes.
Cirkulující nukleární antigen-reaktivní CD4PlusT buňky produkovaly hlavně IFN-g a v menší míře IL-17 a IL-10. Tento cytokinový profil spolu se slabou/žádnou korelací s produkcí autoprotilátek naznačuje, že role CD4 reaktivního na jaderný antigenPlusT lymfocyty nemusí být výhradním poskytovatelem pomoci B lymfocytů. Ukázalo se, že IFN-g je nepostradatelný v patogenezi LN. Ukázalo se, že Th1 buňky jsou rekrutovány doinfikovaný ledvinatkáň vsystémové lupuserythematodes, což činí T buňky reaktivní s jaderným antigenem hlavními kandidáty na invazi doledviny, kde by se setkali se svým všudypřítomným příbuzným autoantigenem. Již dříve bylo popsáno, že močové T buňky odrážejí aktivitu onemocnění a odrážejí fenotyp intrarenálních buněk v LN20,33; tedy jsme použili močové T buňky jako proxy proledvinaT buňky. Močové T buňky odhalily omezenou variabilitu TCR, což je v souladu s pozorováním vledvinabiopsie, což ukazuje na obohacení určitých klonů T-buněk vinfikovanýledvinatkáň. Mezi močovými T buňkami jsme byli schopni detekovat jaderné antigen-reaktivní T buňky a jejich frekvence byla ve srovnání s cirkulačními T buňkami obohacena. V důsledku toho se zdá pravděpodobné, že buňky reaktivní s jaderným antigenem se přímo podílejí na šíření lokálního poškození orgánů.
V souhrnu zde prokazujeme, že nukleární antigen-reaktivní CD4PlusT buňky jsou expandované neaktivnísystémovélupuserythematodes; jsou to fenotypově hlavně Th1 T buňky produkující IFN-g a napadajíinfikovanýcílové orgány jako napřledvina.
Cistanche se může vyhnout infekciledvinakvůlisystémovélupuserythematodes.
METODY
Podrobné metody jsou uvedeny v doplňkovém materiálu.
Subjekty a vzorky krve a moči
Vzorky krve byly odebrány od 17 zdravých jedinců, 12 pacientů s neaktivním stavemsystémovélupus erythematodes(systémovélupuserythematodesskóre DAI<10), and="" 20="" patients="" with="" active="">systémovélupuserythematodes(systémovélupuserythematodesDAI score >10). Kromě toho byly odebrány vzorky moči od 12 pacientů s aktivnísystémovélupuserythematodesa LN. Všechny subjekty daly svůj informovaný souhlas na základě etického souhlasu získaného institucionálním kontrolním výborem a etickými orgány Charité – Universitätsmedizin Berlin (EA 1/342/12, EA 1/098/07 a EA 1/036/16 ). PBMC a močové buňky byly připraveny s použitím hustotního gradientu FicollHypaque.
Protilátky a sledujte cytometrii
V závislosti na experimentech bylo na buňkách stimulovaných antigenem obarveno několik povrchových molekul v různých kombinacích následujících monoklonálních protilátek: anti-CD3, -CD4, -CD8, -CD14, -CD20, -CD69 a -CD154; k rozlišení živých a mrtvých buněk je k dispozici sada LIVE/DEAD Aqua (Life Technologies Ltd.,Paisystémovýlupuserythematodes, UK) byl použit.
Pro obarvení intracelulárního buněčného kompartmentu byly buňky fixovány 2% (obj./obj.) paraformaldehydem po dobu 15 minut při teplotě místnosti a permeabilizovány BD FACS permeabilizačním roztokem 2 (BD Biosciences, San Jose, CA); následující antigeny byly obarveny intracelulárně pomocí standardního protokolu: CD154, IFN-g, IL-2, IL-4, IL-10 a IL-17.
Vzorky byly získány na BD FACSCanto II a BD LSRFortessa (BD Biosciences) podle cytometrů v zařízení průtokové cytometrie Core Facility Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlin pomocí softwaru BD FACSDiva (BD Biosciences). Data průtokové cytometrie byla analyzována pomocí softwaru FlowJo (FlowJo v10, Three Star, Ashland, VA).
Příprava antigenu a směsi antigenů
Ke stimulaci CD4 jsme použili následující antigenyPlusT buňky v testu knihovny T buněk: {{0}},5 mg/ml lidského rekombinantního proteinu SNRPD1 (SmD1) (Biorbyt Ltd., Cambridge, UK), 50 ng/ml lidského SNRP70 (RNP7{19}}) rekombinantního proteinu (Abcam Plc., Cambridge, UK), 0,5 mg/ml přirozeného lidského histonového proteinu (Abcam Plc.), 0,5 mg/ml lidského SS -A/Ro rekombinantní protein (laskavě poskytnutý společností Euroimmun AG, Lübeck, Německo), 0,5 mg/ml lidského SS-B/La rekombinantního proteinu (laskavě poskytnutý společností Orgentec Diagnostika GmbH, Mainz, Německo), 1 mg/ml SEB (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Německo), 1 mg/ml PepTivator Candida albicans MP65 (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Německo) a 0,5 mg/ml lidského transthyretinového rekombinantního proteinu (ATGen, Seongnam, Jižní Korea ).
Knihovny periferních a močových T-buněk Protokol pro vytváření amplifikovaných periferních a urinárních knihoven T-buněk byl přijat a upraven, jak bylo popsáno dříve.14 Stručně, 200,000 periferní CD4PlusT buněk nebo 500 až 2000 CD4 v močiPlusT buňky byly izolovány s použitím anti-lidského CD4PlusMicroBeads (Miltenyi Biotec GmbH) podle pokynů výrobce. Čistota CD4PlusFrakce T-buněk byla rutinně kontrolována pomocí následné cytometrie na základě CD3PlusCD4Plus expression, where the purity always reached >99 procent a 70 procent až 75 procent pro vzorky periferní krve a moči. Paralelně byly připraveny buňky prezentující antigen sběrem buněk CD3 z PBMC po vyčerpání pomocí anti-lidských CD3 MicroBeads (Miltenyi Biotec GmbH) a konzervovány zmrazením. Po 1 až 2 týdnech kultivace se frakce amplifikovaného CD4PlusT buňky byly rozděleny do 96-jamkových destiček v závislosti na počtu analyzovaných antigenů. Před stimulací antigeny byly buňky v klidu po dobu alespoň 4 dnů. V den stimulace byly buňky prezentující antigen rozmraženy a distribuovány do kultury T lymfocytů v poměru alespoň 1 buňka prezentující antigen ku 100 CD4PlusT buňky. CD4PlusDo experimentů byly vždy zahrnuty knihovny T-buněk pro negativní kontrolu (nestimulované buňky) a pozitivní kontrolu (buňky stimulované SEB). CD4Plus T buňky byly stimulovány antigenem po dobu 4 dnů a proliferace byla stanovena pomocí standardního [3H]-thymidinového protokolu.
Amplifikované blasty T-buněk reagovaly odlišně na antigeny projevené vysoce heterogenní scintilační CPM; proto byla nutná normalizace prahu proliferace stanoveného jako z skóre specifické pro dárce. Z skóre bylo vypočteno jako 5 rozdílů 75. a 25. percentilu nad střední CPM nestimulovaných mikrokultur. Buňky v mikrokulturách stimulovaných SEB sloužily jako pozitivní kontrola. Za zmínku stojí mikrokultury s indexem stimulace SEB<5 for="" peripheral="" blood="" samples,="" or="" 4="" for="" urinary="" samples,="" were="" excluded="" because="" it="" indicated="" poor="" cell="" viability.="" enumeration="" of="" the="" precursor="" frequency="" of="" antigen-specific="">PlusT buňky byly vypočteny s použitím počtu negativních mikrokultur podle Poissonova rozdělení a vyjádřeny na 1 milion buněk, jak bylo popsáno dříve. Použití Poissonova rozdělení je založeno na pravděpodobnosti, že alespoň 1CD4PlusT buňka je přítomna v jediné mikrokultuře knihoven T buněk, když byl radioaktivní signál detekován po stimulaci specifické pro antigen.
Periferní a močové metody ARTE jsme postupovali podle protokolu, který používá CD154 MicroBead Kit (Miltenyi Biotec GmbH). Stručně, buňky byly stimulovány po dobu 7 hodin antigeny a poté označeny anti-lidskými CD154-biotinovými protilátkami a anti-biotinovými mikrokuličkami podle pokynů výrobce. Značené buňky byly naneseny na kalibrované MS kolony (Miltenyi Biotec GmbH), aby se obohatily buňky exprimující CD154-. Značení buněk N-sukcinimidylesterem karboxyfluorescein diacetátu (Sigma-Aldrich Chemie GmbH) bylo provedeno podle standardního protokolu.
Cistanche se zlepšujeledvinafunkcí.
Generování jednobuněčných klonů
Jednobuněčné klony byly vytvořeny z antigen-reaktivních buněk, které byly obohaceny expresí CD154 podle protokolu ARTE. Buňky exprimující CD154-byly filtrovány 30-mm preparačním filtrem (Miltenyi Biotec GmbH) a resuspendovány v 1 ml 20procentního (obj./obj.) studeného fyziologického roztoku s fosfátovým pufrem, 0,5 procenta hovězího sérového albuminu a 2 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové. Buňky byly jednotlivé buňky tříděné podle CD154PlusCD69Plusfenotypu a jednotlivé vytříděné buňky byly kultivovány v jednotlivých jamkách 96-jamkových destiček v přítomnosti podpůrných buněk. Buněčné kultury byly udržovány po dobu 3 až 4 dnů, dokud nebylo vidět několik klonů. Jeden den před restimulací byly buňky prezentující antigen rozmraženy a distribuovány do kultury T-buněk v poměru
alespoň 1 buňka prezentující antigen na 100 CD4PlusT buňky. Buňky byly stimulovány 1 mg/ml antigenu a nestimulované klony sloužily jako negativní kontrola.
Analýza repertoáru TCR nové generace založená na sekvenování
Genomová DNA byla izolována z periferního CD4PlusT buňky a močové buňky pomocí sady AllPrep DNA/RNA Micro Kit (Qiagen, Venlo, Nizozemsko). Rekombinovaný lokus TCR-b byl amplifikován podle protokolu, jak bylo popsáno dříve. Čtení byla zpracována pomocí IMSEQ a stejné klonotypy byly seskupeny a dále analyzovány.
Statistika
Statistické testy byly provedeny pomocí softwaru GraphPad Prism (Prism 8, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Byla použita Bonferroniho úprava pro vícenásobná srovnání. V experimentech s nezávislým a závislým souborem dat byly použity Mann-Whitney U test a Wilcoxonův test se znaménkem. Po Bonferroniho úpravě pro vícenásobná srovnání byl výpočet kritických hodnot P opraven, protože je založen na počtu plánovaných srovnání. P hodnoty<0.01 were="" considered="" statistically="" significant="" with="" the="" following="" indication:="" *p="" <="" 0.01,="" **p="" <="" 0.005,="" and="" ***p="" <="" 0.0005.="" correlation="" analyses="" were="" performed="" using="" spearman="" rank="" correlations="" by="" showing="" the="" absolute="">systémovélupuserythematodesHodnoty DAI namísto hodnot seřazených pro lepší pochopení korelace mezi počtem buněk a aktivitou onemocnění. Pro korelační analýzu, P hodnoty<0.5 were="" considered="" statistically="" significant="" with="" the="" following="" indication:="" *p="" <="" 0.05,="" **p="" <="" 0.01,="" and="" ***p="" <="" 0.001.="" when="" background="" frequencies="" were="" higher="" than="" the="" frequencies="" of="" nuclear="" antigen–reactive="">PlusT buňky, frekvence bez pozadí byly definovány jako nulové. Log(x þ 1) transformace byla aplikována na soubor dat, když obsahoval nulové hodnoty. Doplňkové údaje o pacientech a statistické údaje jsou k dispozici v doplňkových tabulkách S1 a S2.
CD4 reaktivní s jaderným antigenemPlusbuňky expandují v aktivnísystémovélupuserythematodes, produkují efektorové cytokiny a infikujíledviny,cistanche může chránitledviny.
ZVEŘEJNĚNÍ
Všichni autoři deklarovali žádné konkurenční zájmy.
PODĚKOVÁNÍ
Děkujeme Toralfu Kaiserovi a Jenny Kirsch (Flow Cytometry and Cell Sorting Facility, Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlin) za pomoc s průtokovou cytometrií a tříděním buněk. Podpora pro tyto studie byla poskytnuta granty od Deutsche Forschungsgemeinschaft v rámci Sonderforschungsbereich 650 do GR a granty z Deutsche Gesellschaft für Nephrologie a Clinical Scientist Program Charité–Universitätsmedizin Berlin a Berlin Institute of Health na PE.
DOPLŇKOVÝ MATERIÁL Doplňkový soubor (PDF)
Obrázek S1. Autoreaktivní CD4 specifický pro jaderný antigenPlusT buňky byly detekovány metodou T buněčné knihovny. Obrázek S2. CD154PlusCD69PlusCD4PlusT buňky izolované po stimulaci jadernými antigeny od zdravých jedinců jsou bona-fife antigen-specifické CD4PlusT buňky.
Obrázek S3. Frekvence autoreaktivního CD4 produkujícího cytokinyPlusT buňky byly porovnány s titrem antinukleárních protilátek (anti-ANA) (A) as koncentrací protilátek proti dvouvláknové DNA (anti-dsDNA) (B).
Obrázek S4. CD4 reaktivní s jaderným antigenemPlusT buňky byly detekovány v moči aktivníchsystémovélupuserythematodespacientů s LN.
Tabulka S1. Klinická data.
Tabulka S2. Souhrn středních hodnot.
Doplňkové metody.
Jednouledvinaje infikován v důsledku jaderného antigen-reaktivního CD4Plusbuňky expandující v aktivnísystémovélupuserythematodes,ledvinafunkce je zničena, cistanche se používá ke zlepšeníledvinafunkce.
REFERENCE
1. Casciola-Rosen LA, Anhalt G, Rosen A. Autoantigeny cílené vsystémové lupuserythematodesjsou shluky ve dvou populacích povrchových struktur na apoptotických keratinocytech. J Exp Med. 1994;179: 1317–1330.
2. Arbuckle MR, McClain MT, Rubertone MV, et al. Vývoj autoprotilátek před klinickým nástupemsystémovélupuserythematodes. N Engl J Med. 2003;349:1526–1533.
3. Suarez-Fueyo A, Bradley SJ, Tsokos GC. T buňky vsystémovélupuserythematodes. Curr Opin Immunol. 2016;43:32–38.
4. Crow MK, DelGiudice-Asch G, Zehetbauer JB, et al. Autoantigen-specifická proliferace T buněk indukovaná ribozomálním proteinem P2 u pacientů ssystémovélupuserythematodes. J Clin Invest. 1994;94:345–352.
5. Engler JB, Undeutsch R, Kloke L, et al. Odmaskování autoreaktivního CD4PlusT buňky deplecí CD25 regulačních T buněk vsystémovélupuserythematodes. Ann Rheum Dis. 2011;70:2176–2183.
atd.
