Polysacharidy Cistanche Deserticola zmírňují kognitivní úpadek a zlepšují paměť u stárnoucích modelových myší

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Yuan Gao1,*, Bing Li1,*, Hong Liu1, Yajuan Tian2, Chao Gu1, Xiaoli Du1, Ren Bu1, Jie Gao1, Yang Liu1, Gang Li1

ABSTRAKTNÍ

Nedávné důkazy naznačují, že změny v ose střevní mikrobiota-mozek mohou řídit kognitivní poruchy se stárnutím. V této studii jsme pozorovali, že prodloužené podávání D-galaktózy myším vyvolalo kognitivní pokles, střevní mikrobiální dysbiózu, periferní zánět a oxidační stres. V tomto modelu kognitivního poklesu souvisejícího s věkem zlepšily polysacharidy Cistanche deserticola (CDPS) kognitivní funkce u myší léčených D galaktózou obnovením střevní mikrobiální homeostázy, čímž se snížil oxidační stres a periferní zánět. Příznivé účinky CDPS u těchto stárnoucích modelových myší byly odstraněny ablací střevní mikroflóry antibiotiky nebo imunosupresí cyklofosfamidem. Metabolomické profily v séru ukázaly, že hladiny kreatininu, valinu, L-methioninu, o-toluidinu, N-ethylanilinu, kyseliny močové a prolinu byly u stárnoucích myší změněny, ale byly obnoveny pomocí CDPS. Tato zjištění prokázala, že CDPS zlepšuje kognitivní funkce v modelu stárnutí vyvolaného D-galaktózou u myší obnovením homeostázy mozkové osy střevní mikrobioty, což zmírnilo nerovnováhu aminokyselin, periferní zánět a oxidační stres. CDPS tak ukazuje terapeutický potenciál pro pacienty s poruchami paměti a učení, zejména těmi, které souvisí s gutmikrobiální dysbiózou.

Cistanchebylina

ÚVOD

Dlouhodobé podávání D-galaktózy (D-gal) a solí berylia indukuje stárnutí v experimentálních zvířecích modelech a in vitro primárních buněčných kulturách a používá se k identifikaci mechanismů, které jsou základem přirozeného procesu stárnutí [1–4]. Předchozí studie ukazují, že kognitivní pokles u myší s modelem stárnutí vyvolaného D-galaktózou souvisí se sníženými hladinami proteinu nervového růstového faktoru (NGF) a zvýšenými reaktivními formami kyslíku (ROS) v mozku, což obojí způsobuje degeneraci hipokampálních neuronů a snižuje neurogeneze [3, 4]. Nedávné studie také ukázaly, že složení a počet lidské střevní mikroflóry se během procesu stárnutí významně mění[5].

Cistanche deserticola je bylina, která roste především v severozápadní pouštní oblasti Číny a používá se v tradiční čínské medicíně. Je běžně známý jako „ženšen pouště“. Extrakty Cistanche deserticola obsahují několik farmakologicky aktivních sloučenin, včetně fenylethanoidových glykosidů, iridoidů, lignózy, oligosacharidů, polysacharidů a aminokyselin; tyto sloučeniny jsou spojeny s protizánětlivými, antioxidačními, antisenescentními, neuroprotektivními a imunomodulačními vlastnostmi [6, 7]. Například polysacharidy extrahované z Cistanche deserticola byly používány v tradiční čínské medicíně k léčbě kolorektálního karcinomu [8]. Široká škála slabě toxických polysacharidů s užitečnými bioaktivitami byla izolována z několika organismů, jako je polysacharid Chuanqiong, polysacharid Ganoderma lucidum a polysacharid Lycium barbarum [9–11]. CDA 0.05 je galaktoglukan izolovaný z Cistanche deserticola, který podporuje růst několika prospěšných střevních bakterií, včetně několika druhů Bacteroides a Lactobacillus [12].

Základní mechanismy normálního procesu stárnutí se také účastní několika lidských onemocnění, jako jsou neurodegenerativní poruchy, koronární ateroskleróza, diabetes 2. typu (T2DM) a hypertenze [13, 14]. Nedávné studie ukázaly, že změny ve střevní flóře hrají významnou roli ve stárnutí člověka [15]. Několik studií ukázalo, že prodloužené podávání D-galaktózy u experimentálních myší a potkanů ​​napodobuje normální proces stárnutí a je užitečným modelem pro studium fenotypů souvisejících se stárnutím, jako je pokles kognice [16]. Navíc D-galaktózou indukované modely stárnutí myší vykazují změny ve složení střevní mikroflóry [17]. Proto jsme předpokládali, že změny ve složení střevní mikroflóry mohou způsobit kognitivní pokles u myší s modelem stárnutí vyvolaným D galaktózou a zkoumali jsme, zda polysacharidy Cistanche deserticola (CDPS) mohou zmírnit kognitivní pokles obnovením dysbiózy střevní mikrobioty.

cistanche stonek

VÝSLEDEK

D-galaktózou indukovaný model stárnutí myší demonstruje pokles kognitivních funkcí a střevní mikrobiální dysbiózu

Analyzovali jsme behaviorální výkonnost myší divokého typu (WT) a myší léčených 150 mg D-gal na kg tělesné hmotnosti po dobu 2 měsíců (model nebo Mod) pomocí nových testů rozpoznávání objektů a Morrisova vodního bludiště (MWM). Hodnoty preferenčního indexu v novém testu rozpoznávání objektů byly významně sníženy u myší skupiny Mod ve srovnání s myšmi skupiny WT (obrázek 1A, 1B). Výsledky testu MWM ukázaly, že doba únikové latence po šestém dni byla významně zvýšena ve skupině Mod ve srovnání se skupinou WT (obrázek 1C, 1D). Kromě toho byly přechody cílové plošiny a doby plavání v rámci cílového kvadrantu významně sníženy ve skupině Mod ve srovnání se skupinou WT (obrázek 1E, 1F). Tyto výsledky prokázaly významný pokles schopností učení a paměti u myší s modelem stárnutí vyvolaného zákonem.

Poté jsme analyzovali rozdíly v množství a složení střevních mikrobiálních kmenů, rodů a druhů ve vzorcích stolice myší skupiny Mod a WT pomocí sekvenačních dat 16S ribozomální RNA (rRNA) ze vzorků stolice. Převládající střevní flórou u myší skupiny WT a Mod byly Firmicutes a Bacteroides. Nicméně četnost Bacteroides byla významně snížena a četnost Firmicutes byla významně zvýšena ve skupině Mod ve srovnání se skupinou WT (obrázek 2A). Dále jsme provedli lineární diskriminační analýzu (LDA) ke stanovení skóre velikosti účinku LDA (LEfSe) následovanou Kruskal-Wallisovým a Wilcoxonovým testem k vyhodnocení relativního množství různých taxonů u myší skupiny WT a Mod. Výsledky LDA jsou uvedeny na obrázku 2B. Dále jsme zkonstruovali kladogramy ukazující rozdílné obohacení různých rodů a druhů patřících do Bacteriodes a Firmicutes phyla ve WT a modelových skupinách (obrázek 2C). Celkově naše výsledky prokázaly zhoršenou kognitivní schopnost a střevní mikrobiální dysbiózu u myší s modelem stárnutí vyvolaným D-galaktózou.

cistanche zdravotní přínosy: antioxidace

Léčba CDPS zlepšuje kognitivní schopnosti u myší s modelem stárnutí indukovaného D-gal

Analyzovali jsme, zda léčba CDPS zmírňuje kognitivní pokles u myší s modelem stárnutí vyvolaného D-gal. Během 2 měsíců podávání byla tělesná hmotnost měřena každý druhý den. Tělesné hmotnosti modelových a CDPS skupin myší byly podobné (obrázek 3A). Po poslední dávce proveďte behaviorální experimenty. Nové rozpoznávání objektů a výsledky testu Morrisova vodního bludiště ukázaly, že krátkodobá paměť byla významně vyšší ve skupinách myší CDPS ve srovnání s modelovou skupinou myší; dlouhodobá paměť ve skupině myší CDPS byla vyšší, ale statisticky nevýznamná ve srovnání s modelovou skupinou myší (obrázek 3B, 3C). To naznačuje, že léčba CDPS zrušila ztrátu krátkodobé paměti pro rozpoznávání objektů u myší léčených D-gal.

Prostorové učení a paměť těchto myší byly vyhodnoceny Morrisovým testem ve vodním bludišti a výsledky ukázaly, že doby únikové latence skupiny myší CDPS byly srovnatelné se skupinou myší WT a významně kratší než u skupinových myší Mod (obrázek 3D) . Kromě toho byly doby únikové latence významně nižší šestý den po podání CDPS ve srovnání s modelovou skupinou (obrázek 3E). Doba plavání v cílovém kvadrantu byla významně vyšší ve skupinách CH a CM ve srovnání s modelovou skupinou. Skupina CL je vyšší než modelová skupina, ale nemá žádnou statistickou významnost (obrázek 3F). Kromě toho byl počet přejezdů nástupišť výrazně vyšší ve skupinách CM a CL ve srovnání s modelovou skupinou. Skupina CH je však vyšší než modelová skupina a nemá žádnou statistickou významnost (obrázek 3G). Tyto výsledky ukázaly, že léčba CDPS zlepšila prostorové učení a paměť u myší s modelem stárnutí vyvolaného D-gal.

Obrázek 1. Dlouhodobé podávání D-galaktózy indukuje u myší poruchy učení a paměti.

Obrázek 2. Prodloužené podávání D-galaktózy indukuje střevní mikrobiální dysbiózu u myší.

Léčba CDPS obnovuje homeostázu složení střevní mikroflóry u myší modelu stárnutí D-galaktózy

Monosacharidy a polysacharidy jsou základními živinami potřebnými pro růst bakterií [18–21]. Uvádí se také, že CDPS reguluje složení střevní mikroflóry [22]. Proto jsme analyzovali, zda ošetření CDPS zmírnilo střevní mikrobiální dysbiózu u myší v modelové skupině, a to vyhodnocením dat sekvenování 16S rRNA vzorků výkalů ze skupin WT, modelu a CDPS myší.

Nejprve jsme vypočítali indexy alfa diverzity, abychom vyhodnotili celkovou bohatost fekální mikrobioty a strukturální rozdíl mezi těmito skupinami. Analyzovali jsme indexy alfa diverzity (-diverzity), jako jsou pozorované druhy, hodnoty indexu Shannon, Chao 1, ACE a Simpson, abychom určili změny ve složení různých bakteriálních druhů ve vzorcích stolice různých myších skupin. Indexy diverzity (pozorované druhy, indexy Shannon, Chao 1, ACE a Simpson) byly vyšší ve skupinách myší WT a CDPS ve srovnání s modelovou skupinou, ale statistická významnost byla pozorována pouze pro hodnoty indexu Chao 1 mezi CM. skupina a skupina Mod. Ukázalo se, že podávání s CDPS zvyšuje bohatost mikrobiomu (obrázek 4A–4E). Dále jsme analyzovali - indexy diverzity, abychom identifikovali rozdíly ve střevních mikrobiálních druzích mezi skupinami WT, modelem a CDPS myší pomocí nemetrického vícerozměrného škálování (NMDS), analýzy hlavních souřadnic (PCoA) a analýzy hlavních složek (PCA). . PCA vykazovala změny ve střevním mikrobiálním složení myší modelové skupiny během procesu stárnutí, včetně redukce rozměrů a udržování vzorů a trendů (obrázek 4F). Rozdíly ve fekální mikrobiotě mezi skupinami WT,model a CDPS byly identifikovány na základě PCoA nevážených vzdáleností UniFrac pro geny 16S rRNA (obrázek 4G). Shluková analýza ukázala významné rozdíly v NMDS mezi modelovou skupinou a skupinami WT a CDPS (obrázek 4H).

Vyhodnotili jsme 10 nejlepších kmenů střevní mikroflóry a zjistili jsme, že množství Bacteroides phyla bylo významně vyšší ve skupinách CH, CM a CL ve srovnání s modelovou skupinou (obrázek 4I). To naznačuje, že CDPS obnovil homeostázu střevní mikroflóry u myší ošetřených D-gal. Kladogramy ukázaly rozdílné obohacení různých rodů a druhů patřících do Bacteriodes a Firmicutes phyla ve skupinách WT, modelu a CDPS (obrázek 4J). Jak je znázorněno na teplotních mapách, ošetření CDPS snížilo relativní množství Thermoplasmata, Bacilli, neidentifikovaných Actinobacteria, Fusobacteria a neidentifikované Elusimicrobia a zvýšilo relativní množství Methanobacteria, Spirochaetia, Deltaproteobacteria, neidentifikované_,Moderribacteria,Nitrosphaticeria. ,Erysipelotrichia a neidentifikované_sinice ve srovnání s modelovou skupinou (obrázek 4K). Tyto výsledky ukázaly, že léčba CDPS významně obnovila homeostázu střevní mikroflóry u myší s modelem stárnutí indukovaného D-gal.

Obrázek 3. Léčba CDPS zlepšuje učení a paměť u myší s modelem stárnutí D-gal.

Léčba CDPS zmírňuje neurodegeneraci u myší s modelem stárnutí vyvolaným D-gal snížením oxidačního stresu

Dále jsme analyzovali účinky CDPS na zánět analýzou sérových hladin prozánětlivých cytokinů (IL-2 a TNF- ) a protizánětlivých cytokinů (IL-4 a IL-10 ) v různých skupinách myší. Sérové ​​hladiny IL-2 a TNF- byly významně nižší a sérové ​​hladiny IL-4 a IL-10 byly významně vyšší ve skupinách CH, CM a CL ve srovnání s modelem skupina. Je prokázáno, že CDPS má protizánětlivé účinky (obrázek 5A–5D).

Oxidační stres je způsoben zvýšenou produkcí reaktivních forem kyslíku (ROS) a je jedním z hlavních faktorů podporujících stárnutí [23]. Proto jsme analyzovali účinky CDPS na oxidační stres v modelu stárnutí myší vyvolaném D-gal vyhodnocením sérových hladin antioxidačního enzymu, SOD, a produktu peroxidace lipidů, malondialdehydu (MDA). Sérové ​​hladiny MDA byly významně vyšší a sérové ​​hladiny SOD byly významně sníženy ve skupině Mod ve srovnání se skupinou WT, ale léčba CDPS tyto účinky zvrátila (obrázek 5E, 5F). Tyto výsledky ukázaly, že oxidační stres byl zvýšen u myší s modelem stárnutí vyvolaného D-gal, ale byl snížen působením CDPS.

Dále jsme hodnotili hladiny oxidačního stresu v mozkových tkáních analýzou hladin pokročilého oxidovaného proteinového produktu (AOPP), přímé peroxidace lipidů (LPO) a MDA a také aktivit antioxidačních enzymů, jako je glutathionperoxidáza (GSH-Px). ) a superoxiddismutáza (SOD) v homogenátech mozkové tkáně. Mozky myší skupiny Mod vykazovaly významně snížené aktivity SOD a GSH-PX a významně zvýšené hladiny AOPP, LPO a MDA ve srovnání se skupinou WT, ale tyto účinky byly obráceny ve skupině CH, CM a CL (obrázek 6A– 6E).

Dále jsme provedli histologické barvení mozkových řezů pomocí H&E a Nissl barvení, abychom vyhodnotili ochranné účinky CDPS na mozek myší s modelem stárnutí indukovaného D-gal. Myši skupiny Mod vykazovaly významné snížení počtu a objemu neuronů, zvýšenou mezeru mezi neurony, nepravidelné uspořádání neuronů a jadernou pyknózu v oblasti hippocampu CA1 ve srovnání se skupinou WT, ale tyto patologické změny byly významně sníženy léčbou CDPS ( Obrázek 6F). Tyto výsledky ukázaly, že ošetření CDPS významně snížilo oxidační stres a mozkovou patologii u myší s modelem stárnutí vyvolaným D gal.

Obrázek 4. Léčba CDPS obnovuje střevní mikrobiální složení u myší modelu stárnutí indukovaného D-galaktózou.

Léčba CDPS snižuje periferní zánět a oxidační stres udržováním střevní mikrobiální homeostázy u modelových myší vyvolaných D-gal

Dále jsme analyzovali, zda změny ve složení střevní mikroflóry byly spojeny se zvýšeným periferním zánětem a oxidačním stresem během stárnutí. K tomu jsme použili trojitý antibiotický koktejl (skupina ABX) nebo cyklofosfamid (skupina Cy; také viz Materiály a metody) k odstranění střevní mikroflóry nebo indukci imunosuprese u stárnoucích myší léčených CDPS. Léčba antibiotiky zrušila příznivé účinky léčby CDPS u stárnoucích modelových myší. Pozorovali jsme zhoršené učení a paměť (obrázek 7A) a změny ve složení střevní mikroflóry (obrázek 7B, 7C) u myší skupiny ABX ve srovnání se skupinou léčenou CDPS. Výše uvedené výsledky naznačují, že ani podávání CDPS nemůže zvýšit schopnost učení a paměti myší po změně střevní flóry. Navíc jsme pozorovali zvýšené hladiny prozánětlivých cytokinů v mozku a séru myší skupiny ABX ve srovnání se skupinou CDPS (obrázek 7D–7N). Výsledky skupiny ABX a skupiny CY ukázaly, že po zničení střevní flóry a imunitních funkcí ani podávání CDPS nemohlo zlepšit schopnost učení a paměti myší. Tyto výsledky naznačují, že léčba CDPS snížila periferní zánět, oxidační stres a kognitivní pokles u myší s modelem stárnutí vyvolaného Legal prevencí střevní dysbiózy.

Poté jsme použili imunosupresivní lék, cyklofosfamid [24], abychom určili roli zánětu v příznivých účincích CDPS. Myši CDPS léčené cyklofosfamidem (skupina Cy) vykazovaly zhoršenou schopnost učení a paměti, změny ve složení střevní mikroflóry a odchylné hladiny prozánětlivých a protizánětlivých cytokinů v mozku a séru ve srovnání s myší divokého typu a myší skupiny CDPS. Ve srovnání s modelem a skupinou ABX však neexistuje žádný význam. (Obrázek 7A–7N). Tato data ukazují, že změny ve složení střevní mikroflóry zvyšují periferní zánět u myší s modelem stárnutí vyvolaným D-gal.

Obrázek 5. Léčba CDPS moduluje cirkulující hladiny prozánětlivých a protizánětlivých cytokinů a faktorů souvisejících s oxidačním stresem u myší s modelem stárnutí indukovaného D-galaktózou.

CDPS zabraňuje stárnutí vyvolanému D-gal regulací metabolismu aminokyselin

Imunitní systém hostitele je ovlivněn metabolity vytvářenými střevní mikroflórou [25]. Fekální metabolity představují funkční výstup střevního mikrobiálního metabolismu a střevního mikrobiálního složení[26]. Navíc metabolity střevní mikroflóry vstupují do krevního oběhu a ovlivňují metabolismus a zdraví hostitele [26, 27]. Ve vzorcích séra myší FWT, Mod a CDPS bylo identifikováno celkem 1058 metabolitů. Poté jsme tyto metabolity analyzovali pomocí BioCyc, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) a Human Metabolome Database (HMDB) a zjistili jsme, že 65 metabolitů bylo odlišně exprimováno ve skupině Mod ve srovnání se skupinou WT. Dále jsme zjistili, že hladiny 8 metabolitů (kreatinin, valin, L-(-)-methionin, o-toluidin, N-etylanilin, kyselina močová, prolin a fenylalanin) se významně lišily mezi skupinami WT, Mod a CDPS. Analýza obohacení dráhy těchto 8 metabolitů pomocí MetaboAnalyst [28, 29] ukázala, že tyto metabolity souvisely s metabolismem argininu, histidinu, argininu, prolinu a purinu (obrázek 8A, 8B). 7 různých metabolitů skupiny MOD a skupiny CDPS ve skupině WT.

Poté jsme analyzovali, zda změny v metabolismu aminokyselin souvisely se změnami ve složení střevní mikroflóry. Pozorovali jsme, že 7 různých metabolitů skupin WT, Mod a CDPS (kreatinin, valin, L-(-)-methionin, o-toluidin, N-ethylanilin, kyselina močová a prolin) bylo významně sníženo v ABX, Cy, a Mod skupiny ve srovnání se skupinami WT a CDPS. Navíc mezi skupinami ABX a Cy není žádný význam (obrázek 8C). Konečně, abychom prozkoumali, existuje korelace mezi rozdílným metabolismem a jinými nemocemi souvisejícími se stárnutím. Analyzovali jsme korelaci mezi těmito sedmi odlišně exprimovanými metabolity a lidskými chorobami pomocí databáze MetaboAnalyst a zjistili jsme, že tyto metabolity byly spojeny s Alzheimerovou chorobou (p=0.00173; obrázek 8D, 8E). Celkově tato data naznačují, že CDPS chrání před stárnutím vyvolaným D-gal regulací metabolismu aminokyselin.

Obrázek 6. Léčba CDPS snižuje oxidační stres v mozcích modelových myší stárnutí vyvolaného D-galaktózou

DISKUSE

Progresivní pokles kognitivních funkcí je charakteristickým rysem stárnutí. Předchozí studie ukázaly, že léčba CDPS významně zlepšila učení a paměť u stárnoucích myší [30–33]. V této studii jsme prokázali, že léčba CDPS zlepšila kognitivní funkce inhibicí periferního zánětu a oxidačního stresu prostřednictvím obnovení střevní mikrobiální homeostázy u myší s modelem stárnutí vyvolaným D-gal (obrázek 9). Potkani Sprague-Dawley krmení polysacharidy Cistanche vykazovali zvýšený růst prospěšných střevních bakterií a zvýšenou mikrobiální diverzitu střeva [34]. CDA-0.05, neutrální polysacharid Cistanche, zlepšil růst probiotických Lactobacilli [22]. Tyto údaje naznačují, že polysacharidy Cistanche zlepšily homeostázu střevních bakterií.

V této studii jsme prokázali, že CDPS má protizánětlivé účinky a zlepšuje kognitivní schopnosti stárnoucích modelových myší modulací množství střevních bakteriálních rodů, jako jsou Bacteroidetes, Firmicutes a Proteobacteria. CDP tedy mohou být terapeuticky prospěšné pro nemoci související se stárnutím tím, že přetvářejí složení střevní mikroflóry [35,36]. Předchozí studie navíc ukázaly, že hladiny zánětlivých cytokinů v séru a tlustém střevě jsou spojeny s relativním množstvím bakteriálních rodů, jako jsou Bacteroidetes, Firmicutes a Proteobacteria [37, 38]. Střevní mikrobiální složení navíc reguluje funkci mozku modulací cirkulujících hladin několika cytokinů [39–43]. Naše výsledky ukázaly, že léčba CDPS snížila relativní četnost Thermoplasmata, Bacilli, neidentifikovaných Actinobacteria, Fusobacteria a neidentifikované Elusimicrobia a zvýšila relativní četnost Methanobacteria, Spirochaetia, Deltaproteobacteria, neidentifikovaných{8}}Deferribacteres, Nitroseroseria, Anatrosphaeroline Erysipelotrichia a neidentifikované_sinice.

Střevní mikrobiální metabolity se uvolňují do krevního řečiště a regulují zdraví a metabolismus hostitele [26, 27]. Střevní mikrobiální metabolity lze odhadnout vyhodnocením složení fekálních metabolitů, které se mění se změnami ve složení střevních mikrobů [44]. Nedávné studie ukázaly, že plazmatické hladiny citrulinu, prolinu, argininu, asparaginu, fenylalaninu a threoninu jsou spojeny s neurodegenerativními poruchami včetně Alzheimerovy choroby [45, 46]. Naše studie ukázala, že sérové ​​hladiny kreatininu, valinu, L-methioninu, o-toluidinu, N-ethylanilinu, kyseliny močové a prolinu byly spojeny se stárnutím vyvolaným D-gal u myší.

Extrakt z cistanche: anti-Alzheimerova choroba

Vrozená a adaptivní ramena imunitního systému hrají významnou roli při udržování hostitelsko-mikrobiální homeostázy ve střevním luminálním povrchu [47]. Střevní mikrobiota také hraje významnou roli v regulaci centrálního nervového systému (CNS) a imunity uvolňováním cytokinů a metabolitů do krevního řečiště [48, 49]. Prozánětlivé cytokiny hrají klíčovou roli u několika neurodegenerativních onemocnění [50–52]. Například věkem podmíněná makulární degenerace (AMD) a glaukom jsou spojeny s extracelulární akumulací amyloidu (A ) a intracelulárním ukládáním hyperfosforylovaného tau (p tau) a železa v gangliových buňkách sítnice (RGC) [44]. Zánět navíc hraje významnou roli v patogenezi spojené s glaukomem [53]. Zrakové postižení je časným příznakem Alzheimerovy choroby (AD) a projevuje se před nástupem kognitivního poklesu [54]. Naše studie prokázala, že CDPS chrání před poklesem kognitivních funkcí a periferním zánětem udržováním homeostázy střevní mikroflóry.

Tato studie má několik omezení. Za prvé, vztah mezi metabolismem aminokyselin a složením střevní mikroflóry není dobře znám. Za druhé, složení a molekulární struktura CDPS není známa. Proto jsou nutné budoucí studie k dalšímu prozkoumání regulační role CDPS při zmírňování AD prostřednictvím osy signalizace střevní mikrobioty a mozku.

Závěrem, naše studie prokázala, že CDPS zlepšila kognitivní schopnosti u myší s modelem stárnutí vyvolaného D-gal obnovením homeostázy střevní mikroflóry, čímž se obnovila nerovnováha aminokyselin, periferní zánět a oxidační stres. Tato zjištění naznačují, že CDPS je potenciální terapeutikum pro pacienty s poruchami učení a paměti, zejména u těch, které jsou spojené se střevní dysbiózou.

MATERIÁLY A METODY

Příprava CDPS

Asi 1.0 kg vyčištěné Cistanche deserticola bylo sušeno na vzduchu v peci při 40 °C a rozmělněno na surový prášek. Prášek byl extrahován horkým ethanolem po dobu 3 hodin. Zbytek byl přefiltrován přes gázu, aby se odstranil filtrát, a poté zředěn vodou (8X) a refluxován postupně 2 h, 1,5 h a 1 h při 90 °C. V každém časovém bodě byl roztok odstředěn, aby se oddělil supernatant a v kombinaci s hnědočerveným filtrátem. Poté byl filtrát zahuštěn za sníženého tlaku, ochlazen na teplotu místnosti, pomalu přidán k 95% ethanolu (3X) a ponechán stát při teplotě 4 °C po dobu 24 hodin. Poté byl roztok odstřeďován při 6000 ot./min. po dobu 20 minut při teplotě 4 °C. Sraženina byla shromážděna po opakování třikrát extrakcí vodou a srážením alkoholem. Sraženina byla rekonstituována ve vodě, deproteinována, dialyzována a lyofilizována, čímž byl získán surový polysacharid Cistanche deserticola (CDP). Obsah polysacharidů byl více než 90 procent, jak bylo vyhodnoceno ultrafialovou spektrofotometrií.

extrakt z cistanche

Seskupování zvířat a léčba

Osmitýdenní samci myší Kunming (SCXK licenční číslo.{2}}) byli zakoupeni od společnosti SPF Biotechnology Co. Ltd (Peking, Čína), umístěni v místnosti s řízenou teplotou a světlem a krmeni jídlem a vodou. Všechny pokusy na zvířatech byly prováděny podle protokolů schválených Institutional Animal Care and Use Committee of Inner Mongolia Medical University. Experimenty byly prováděny podle pokynů National Institutes of Health (NIH) pro péči a použití laboratorních zvířat.

Po 1 týdnu adaptace na nové prostředí bylo 120 myší rozděleno do následujících 7 skupin: (1) kontrola divokého typu (WT); modelová skupina (150 mg/kg/den D-gal; Mod); (3) CH: D-gal plus 100 mg/kg CDPS; (4) CM: D-gal plus 50 mg/kg CDPS; (5) CL: D-gal plus 25 mg/kg CDPS; (6) skupina ABX: antibiotika plus D-gal plus 50 mg/kg CDPS; (7) Skupina Cy: cyklofosfamid plus D-gal plus 50 mg/kg CDPS.

Myši z modelových skupin, ABX, Cy a CDPS dostávaly každý den po dobu 2 měsíců subkutánní injekce 150 mg/kg D-gal rozpuštěného ve fyziologickém roztoku. Skupině WT byl subkutánně podáván stejný objem fyziologického roztoku po dobu 2 měsíců. Myším ve skupině CDPS byly také denně podávány intragastrické injekce obsahující 100 mg/kg, 50 mg/kg nebo 25 mg/kg CDPS po dobu 2 měsíců. Myši skupiny ABX dostávaly kromě injekcí D-gal a CDPS pitnou vodu s 0,1 mg/ml ampicilinu a 0,5 mg/ml streptomycinu po dobu 2 měsíců. Před podáním D-gal dostávaly myši injekce obsahující 0,1 mg/ml ampicilinu, 0,5 mg/ml streptomycinu a 0,1 mg/ml kolistinu po dobu 7 dnů ve skupině ABX. Myši skupiny Cy dostávaly intraperitoneální injekce 20 mg/kg cyklofosfamidu každý druhý den (qod) po dobu 2 měsíců navíc k denním injekcím D-gal a CDPS.

Nový test rozpoznávání objektů

Po poslední dávce proveďte behaviorální experimenty. Test rozpoznávání objektů zahrnoval fáze seznamování, školení a testování. Během fáze seznamování byly myši zvykány v prázdné testovací komoře po dobu 10 minut po dobu dvou dnů. Poté, třetí den (tréninkový den), byly dva předměty stejné velikosti, tvaru a barvy (A1 a A2) umístěny na opačné konce komory. Každá myš pak dostala 10 minut na prozkoumání dvou podobných objektů. Po 1-hodině (třetí den) a 24-hodině (čtvrtého dne) intervalech mezi tréninkem a testováním byl jeden z podobných objektů (A1 nebo A2) nahrazen B nebo C objekt, který se v den testování liší velikostí, barvou a tvarem. Během testovací fáze byla každá myš testována po dobu 5 minut a byl vypočítán preferenční index pro určení paměti rozpoznávání nového objektu (B nebo C) pomocí následujícího vzorce: Preferenční index=Čas na objektu B nebo C/ (Čas na objektu B nebo C plus čas na objektu A)×100 procent .

Morrisův test vodního bludiště

Test Morrisova vodního bludiště byl proveden v kulatém bazénu, který byl 45 cm hluboký a 90 cm v průměru. Protokol popsaný Ruediger S, et al. (2011) [55] a Wood RA, et al. (2018) [56] zde byl zaměstnán. Hloubka vody v bazénu byla 30 cm a teplota vody byla 20±1 °C. Plošina měla průměr 6 cm a 1 cm pod vodou. Čas na trénink a testování byl 60 s. Pro školení jsme provedli čtyři pokusy po 60 sekundách se skrytou platformou každý den po dobu pěti po sobě jdoucích dnů. Pokud myš neobjevila plošinu do 60 s, byly navedeny na plošinu a umístěny na plošinu na 5 sekund. Během testovací fáze byla zaznamenávána a analyzována latence k dosažení skryté platformy při tréninku a zkušebních relacích sondy, počet přejezdů přes odstraněné umístění platformy a čas strávený v cílovém (platformním) kvadrantu.

Testy ELISA

Sérové ​​hladiny prozánětlivých cytokinů, jako je IL-2(), IL-4, IL-10 a TNF- byly analyzovány pro každou skupinu myší pomocí souprav ELISA zakoupených od Shanghai Yi Li Biological Technology Co., Ltd. (Shanghai, Čína) podle pokynů výrobce. Aktivita antioxidačního enzymu, superoxiddismutázy (SOD) a hladiny produktu peroxidace lipidů, malondialdehydu (MDA), v séru každé skupiny myší byly analyzovány testovacími soupravami zakoupenými od Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Čína). . Hladiny produktů pokročilé oxidace proteinů (AOPP) ve vzorcích myšího hippocampu byly odhadnuty pomocí soupravy ELISA od Shanghai Yi Li Biological Technology Co. Ltd. (Shanghai, Čína) podle instrukcí výrobce.

Odhad oxidačního stresu v myších mozcích

Homogenizovali jsme 100 mg tkáně hippocampu s 0,9 ml ledově chlazeného fyziologického roztoku a homogenát byl centrifugován při 12 000 ot./min po dobu 30 minut při teplotě 4 °C. Obsah proteinu v supernatantu byl analyzován pomocí soupravy BCA Protein Assay Kit ( Beyotime Biotechnology, Šanghaj, Čína). Hladiny peroxidace lipidů (LPO) a malondialdehydu (MDA) a aktivity GSH-Px a SOD ve vzorcích hippocampu byly analyzovány kolorimetricky za použití souprav z Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Čína) podle pokynů výrobce.

Doplněk Cistanche: zlepšuje paměť

Složení střevní mikroflóry

Vzorky stolice byly odebrány od všech myší a okamžitě uloženy při -80 stupni C. Oblast V3 plus V4 genu rRNA 16S byla sekvenována pomocí Illumina MiSeq (Beijing Novogene Co. Ltd., Peking, Čína) a analyzována pomocí QIIME otevřená platforma pro určení profilů střevní mikroflóry.

LC/MS analýza sérových metabolitů

Vzorky séra byly inkubovány po dobu 10 minuty s předem vychlazeným methanolem v poměru 1:3, aby se vysrážely proteiny. Vzorky byly odstřeďovány při 12000r/min po dobu 15 minut při 4 stupních C. Supernatanty byly analyzovány pomocí Thermo Scientific Dionex UltiMate3000 Rapid Resolution Liquid Chromatography a QExactive hmotnostním spektrem. Chromatografické podmínky jsou uvedeny v tabulce 1. Analyty byly separovány na XBridge BEH Amide chromatografické koloně (2,1 x 100 mm; Waters Co., Milford, MA, USA) s použitím 0,1% kyseliny mravenčí a acetonitrilu jako mobilních fází A a B , resp. Průtok byl nastaven na 0,4 ml/min, vstřikovaný objem byl 5 ul a teplota kolony byla nastavena na 25 °C (tabulka 1). Signály hmotnostního spektra byly získány za použití režimu skenování pozitivních a negativních iontů. Napětí iontového spreje a další specifické parametry MS jsou uvedeny v tabulce 2.

Statistická analýza

Statistical analysis was performed using the SPSS 13.0 software (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). The data plots were generated using GraphPad Prism 8.0.1 (GraphPad Software, La Jolla, California, USA). Partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) of SIMCA-P+13.0 (Umetrics, AB, Umeå, Sweden) and Principal Components Analysis (PCA) were used to assess normalized GC-MS spectral data. Variable Influence on Projection (VIP) values were used to identify significant variables with VIP values >1.{1} a str< 0.05.="" these="" significant="" variables="" were="" used="" to="" identify="" the="" spectral="" peaks.="" the="" student's="" t-test="" was="" used="" to="" analyze="" the="" differences="" between="" two="" groups="" of="" data.="" the="" taxonomic="" rank="" differential="" between="" groups="" was="" determined="" using="" student's="" test="" (v3.1.2;="" r="" programming="" language).="" the="" correlation="" between="" genera="" abundance="" and="" mouse="" behavior="" was="" calculated="" using="" spearman="" correlation="" coefficients="" (r="" language).="" p="" <="" 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant.="" the="" data="" are="" presented="" as="">