Studie chemických profilů a metabolitů syrové a zpracované Cistanche Deserticola u potkanů ​​podle UPLC-Q-TOF-MSE

Kontaktní e-mailtina.xiang@wecistanche.comPro více informací

Abstraktní

Pozadí: Čínské zpracování materia medica je význačná a jedinečná farmaceutická technika v tradiční čínské medicíně (TCM) používaná ke snížení vedlejších účinků a zvýšení nebo dokonce změně terapeutické účinnosti surových bylin. Změny základních složek vyvolané optimalizovaným procesem zpracování jsou zodpovědné především za zvýšenou účinnost léčivých rostlin. Ledvinovo-jangový povzbuzující účinek rýžového vína dušeného v pářeCistanche deserticola(C. deserticola) byl silnější než surový C. deserticola (CD).

Metody: Byla provedena srovnávací analýza pomocí UPLC-Q-TOF-MS' s ​​informační platformou UNIFl, aby se určil vliv zpracování. Pro charakterizaci složek byly rovněž provedeny studie in vitrometabolityin vivo. Chemické složky byly stanoveny v CD a jeho zpracovaných produktech. Byly provedeny vícerozměrné statistické analýzy k vyhodnocení variací mezi nimi, zatímco OPLS-DA byl použit pro párové srovnání.

Výsledek: Výsledky této studie odhalily značné rozdíly ve fenylethanoidových glykosidech (PhGs) airidoidypo zpracování. V extraktech CD a jeho zpracovaného produktu bylo detekováno celkem 97 sloučenin. PhG s 4-O-kafeoylovou skupinou v 8-O- -D-glukopyranosylové části, jako je akteosid, cistanosid C, kamneosid II, osmanthusid, se po zpracování snížily, zatímco PhG s 6' -O-kafeoylová skupina v 8-O- -D-glukopyranosylové části, jako je isoacetosid, isocistanosid C, isokampneosid l, isomartynosid zvýšený, zejména ve skupině CD-NP. Zvýšila se také intenzita echinakosidu a cistanosidu B, jejichž struktura má 6'-O- -D-glukopyranosylovou skupinu. Ve studii in vivo bylo v potkaní plazmě, stolici a moči detekováno 10 prototypových složek a 44 metabolitů. Získané výsledky odhalily, že zpracování vede ke značným variacím v chemických složkách CD a ovlivňuje dispozice sloučenin in vivo, přičemž metabolické procesy fáze Ⅱ jsou klíčovými kaskádami každé sloučeniny a většina metabolitů je spojena s echinakosidem resp. akteosid.

Závěry: Toto je první globální srovnávací výzkum nezpracovaných a zpracovaných CD. Tato zjištění přispívají k našemu chápání dopadu zpracování CD a poskytují důležitá data pro budoucí zkoumání účinnosti.

Klíčová slova: Cistanche deserticola, Zpracování, UPLC-Q-TOF-MS5, Chemické profily, Metabolity in vivo

Úvod

Zpracování čínské materia medica (CMM) prokázalo významnou použitelnost v klinické praxi tradiční čínské medicíny (TCM) a po několik staletí bylo považováno za životaschopnou léčbu. Jedná se o unikátní farmaceutickou technologii, která byla odvozena z teorie TCM. Po zpracování byly identifikovány významné rozdíly ve vzhledu, chemických složkách, vlastnostech a lékařském významu všech typů TCM, což vedlo k předpokladu, že zpracování by mohlo zlepšit účinnost nebo snížit toxické účinky TCM.

Po stovky let,Cistanche deserticola(Rou Cong Rong v čínštině, CD) se běžně používá v klinické praxi TCM pro doplnění funkcí ledvin. Pomáhá také při zvlhčování střeva, což vede k uvolnění střev [1].Cistanchebyl poprvé zaznamenán v ShenNongBencaoJing. Běžně se vyskytuje v suchých a polosuchých stanovištích napříč Eurasií a severní Afrikou, včetně Íránu, Číny, Indie a Mongolska [2]. Zpracování CD bylo provedeno napařováním s rýžovým vínem za normálního tlaku, což je způsob přípravy dokumentovaný v čínském lékopisu (čínsky Jiucongrong, dále jen "CD-NP"). A paření CD s rýžovým vínem pod vysokým tlakem je efektivnější způsob přípravy (dále jen „CD-HP“) [3, 4]. Několik studií odhalilo, že farmakologické účinky CD se liší od jeho zpracovaných produktů [5]. CD může tonizovat ledviny-jang a uvolnit střeva, zatímco po spaření rýžovým vínem se účinek doplnění ledvin-jangu zesílí. V naší dřívější studii bylo zjištěno, že CD-NP může zvýšit tonifikaci ledvin a podpořit jang a zmírnit účinek zvlhčování střev a vyprazdňování [6–8]. V klinické praxi jsou nejčastěji používanou formou zpracované produkty.

Dosud několik studií analyzovalo chemické složky CD, následovala izolace a identifikace více než 100 sloučenin [9–11], jako jsou fenylethanolové glykosidy (PhGs),iridoidy, lignany a oligosacharidy jako jeho hlavní chemické složky. Bylo také popsáno, že existuje mnoho farmakologických aktivit PhG včetně imunomodulačních, neuroprotektivních, hepatoprotektivních, protizánětlivých, antioxidačních atd.[12–14]. Iridoidy mají protizánětlivé účinky [15, 16]. Dřívější studie také odhalily, že některé chemické složky vykazovaly během zpracování odchylky [17–20]. Na základě těchto zpráv lze předpokládat, že změny chemického složení po následném zpracování vedou k různým farmakologickým účinkům, které je třeba dále prozkoumat.

V současné studii byla pro srovnávací analýzu provedena citlivá a účinná metoda, tj. ultra vysokoúčinná kapalinová chromatografie spojená s TOF-MSE (UPLC-Q-TOF-MSE), a ke kvalitativní analýze extraktů byly provedeny studie in vitro. CD, CD-NP a CD-HP pro objasnění jejich chemických profilů. Obecně byly exogenní chemikálie s vysokou expozicí v cílových orgánech považovány za účinné složky. Proto byly u krys CD a jeho zpracované produkty podávány orálně, po čemž následovala jejich charakterizace. Stávající studie poprvé odhaluje srovnávací studii (in vitro i in vivo) surového a zpracovaného CD. Získané výsledky by rozšířily naše chápání vlivu zpracování CD, což by mohlo být užitečné pro další studie.

Materiály a metody

Materiály

Standardní sloučeniny ajugol (180120) a 2'-acetylacetosid (M0601AS) poskytla společnost Chendu Pure Chem-Standard Co., Ltd (Chengdu, Čína). Cistanoside F(MUST-17022620), echinacosid (D1105AS), cistano-side A (M0906AS) a isoacteoside (M0106AS) byly poskytnuty společností Must (Sichuan China); akteosid (O0618AS), salidroside (J0526AS), catalpol (S0728AS), geniposid (A0407AS) a kyselina geniposidová (MB6001-S) byly získány od Dalian Meilun Bio.Co.,Ltd (Dalian, Čína).8-epide oxyloganová kyselina (B31123) byla získané od Shanghai Yuanye Biological Technology Co., Ltd, Čína. Methanol a acetonitril byly MS kvality a byly získány od Merck KGaA, Darmstadt, Německo. Kyselinu methanovou (CH, O,) HPLC čistoty poskytla společnost Merck KGaA (Darmstadt, Německo). Voda použitá ve stávající studii byla zpracována systémem Milli-Q (18,2 MQ, Millipore, Ma, USA). Rýžové víno dodala společnost Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Čína).

Cistanch deserticola byl získán od Neimenggu wangyedi cistanche Co.Ltd. Vzorky identifikoval prof. Yanjun Zhai (farmaceutická škola, Liaoning University of TCM). Vzorky byly předloženy Liaoningské univerzitě tradiční čínské medicíny.

Zvířata

Krysí samci Sprague–Dawley (třída SPF) s celkovou tělesnou hmotností 180–220 g byli poskytnuti společností Liaoning Changsheng biotechnology Co. Ltd. (Laboratory Animal Resource Center of Liaoning Province, licenční číslo: SCXK-2015–0001). Tyto krysy byly umístěny v chovné místnosti s dobře udržovanou teplotou a vlhkostí, tj. 20–26 stupňů, 50–70 procent po dobu jednoho týdne. Před experimentem byly krysy krmeny obvyklou laboratorní potravou a vodou. Zvířata hladověla přes noc, nicméně před experimentem byla poskytnuta voda ad libitum. Krysy byly popraveny 10% anestetikem chloralhydrátu. Institucionální výbor pro etiku zvířat provinční nemocnice čínské medicíny Liaoning schválil všechny experimentální protokoly (25. 3. 2019, 2019015).

Příprava CD, CD-NP a CD-HP extraktu

CD-NP, CD-HP byly zpracovány ze stejné šarže Cistanch deserticola. K přípravě CD-NP byly suché kousky CD (5 mm silné, 100 g) navlhčeny rýžovým vínem (30 ml) a byly vařeny v páře při 100 stupních po dobu 16 hodin, poté sušeny při 55 stupních v sušicí peci. Zatímco CD-HP byl připraven infiltrací suchých kousků CD (5 mm silných, 100 g) rýžovým vínem (30 ml), následovalo vaření v páře při 1,25 atmosférického tlaku po dobu 4 hodin. a poté se suší v sušárně při 55 stupních.

V odměrné baňce o objemu 100 ml byl jeden gram prášku proset přes síto #4, následovalo přidání 50 procent methanolu (50 ml) a poté byl těsně uzavřen a promíchán. Tato směs byla zvážena a následovala půlhodina. macerace. Po maceraci byla směs podrobena ultrazvuku (výkon 250 W, frekvence 35 kHz) po dobu 40 minut, následovalo ochlazení a znovu zvážení. Ztráta hmotnosti byla doplněna 50% methanolem, řádně promíchána a ponechána stát, následovala filtrace supernatantu a poté použití získaného filtrátu jako testovacího roztoku.

MSE analýza aktivních složek

Příprava standardních látek: tubulosid-A (3.02 mg), echinakosid (3.00 mg), 2'-acetylakteosid (2,34 mg), akteosid (2,45 mg), isoakteosid (0,61 mg), cistanosid-F (2,14 mg), salidrosid (3,39 mg), geni posid (2,84 mg), ajugol (1,58 mg), katalpol (2,39 mg), kyselina geniposidová (2,56 mg) a 8-epideoxyloganová kyselina (2,34 mg) byla přidána do 10ml odměrné nádoby, přidán konstantní objem methanolu podle měřítka, konfigurován na odpovídající koncentrační referenční roztok. Každý ze 100 μl byl konfigurován do smíšeného referenčního roztoku.

Podmínky MS analýzy: Hodnota hmotnosti Te byla před experimentem korigována a byl použit režim záporných iontů. Rozsah hmotnosti byl 50–1200 Da a vzorek byl vstřikován průtokovým injekčním čerpadlem. Rychlost kužele byla 100 l/h, rychlost průtoku rozpouštědla byla nastavena na 800 l/h. Napětí kapiláry a kužele bylo podle toho fixováno na 2500 a 40 V. Teplota zdroje iontů a rozpouštěcího plynu byla 100 stupňů a 400 stupňů a frekvence akvizice signálu byla 0,5 S-1.

UPLC-Q-TOF-MS analýza CD extraktu (15–16 minut), 65 procent až 55 procent A (16–18 minut). Průtok byl 0,3 ml min-1, zatímco teplota místnosti autosampleru a kolony byla 30 stupně a 8 stupňů odděleně. Objem nástřiku byl 1,0 μl.

Hmotnostní spektrometrické vyhodnocení bylo provedeno pomocí Waters XEVO G{{0}}}XS QTOF MS (Waters Corporation, Milford, MA, USA), zahrnujícího zdroj ESI. Průtok plynného dusíku byl pevně nastaven na 800 l·h−1 s teplotou 400 stupňů, teplota zdroje byla pevně nastavena na 100 stupňů a kuželový plyn byl nastaven na 50 l h−1. Napětí kužele a kapiláry bylo podle toho upraveno na 40 a 2000 V. Kolizní energie rampy byla použita v rozsahu 20–30 V. Te centroidní data všech vzorků byla získána od 50 do 1200 Da, s 5-časem skenování 0,5 s během doby analýzy 10 minut . Pro ověření přesnosti hmotnosti byl použit LockSpray TM. Jako hmota zámku byl použit Te [M–H]− ion leucinenkefalinu (200 pg·μL−1 průtok infuze 10 μL min−1) při m/z 554,2615. Pro přesnou hmotnost, složení prekurzorových iontů a výpočet fragmentových iontů byl použit software Te MassLynx V4.1 (Waters Co., Milford, USA).

Analýza dat na platformě Masslynx

Kromě toho byla na základě literatury vytvořena interní knihovna obsahující název sloučeniny, její strukturu a molekulární vzorec (v mol.). Všechny sloučeniny byly zaznamenány ve speciální šabloně vytvořené v Excelu. Kromě toho byly soubory mol (Chemdraw Ultra 8.0, Cam-bridge soft, USA) a soubory Excel všech jednotlivých složených struktur také uloženy na místním počítači. Zavedený excelový list s důležitými údaji byl přímo importován do vědecké knihovny v UNIFI

UNIFI 1.8.2, Waters, Manchester, UK byl použit pro hodnocení strukturních charakteristik, zejména pro charakteristické fragmenty a MS fragmentaci. Pro detekci 2D píku byla nastavena minimální plocha píku 500. Během odhalování 3D vrcholů byla zvolena nízká intenzita energetického vrcholu více než 300 impulsů a zvýšená intenzita energetického vrcholu více než 80 impulsů. U známých sloučenin byla zjištěna chyba hmotnosti až ±10 ppm a tolerance retenčního času byla nastavena v rozsahu ±0,1 min. Vybrali jsme negativní adukty obsahující -H plus HCOOH. Zpracování nezpracovaných dat získaných z MS bylo provedeno pomocí efektivního softwaru UNIFI, aby bylo možné rychle určit chemické složky, které splňují standardy, pomocí vlastní databáze a vlastní knihovny tradiční medicíny.

Dále, aby se ověřila chemická struktura každé cílové sloučeniny, byly izomery rozlišeny podle jejich charakteristických MS fragmentačních vzorů, které byly odhaleny v uvedených studiích, a porovnáním retenčních časů referenčních standardů.

Metabolomická analýza založená na vícerozměrné statistické analýze

Před zpracováním nezpracovaných dat byly nastaveny parametry, jako je hmotnost v rozmezí od 150 do 1200 Da, rozsah doby uchování (0 až 20 minut), prahová intenzita ( 2000 impulzů), hmotnostní tolerance, tj. 5 MDA, zatímco hmotnostní a retenční časové okno bylo 0,20 min a 0,05 Da, v daném pořadí. V následujícím seznamu databáze byly identifikátory iontů páry RT-m/ s ohledem na jejich eluční časy. Stejné hodnoty pro RT a m/z v různých šaržích vzorků byly považovány za stejnou sloučeninu.

Pro vyhodnocení účinných biomarkerů, které významně přispěly k variacím mezi různými skupinami, byla provedena vícerozměrná statistická analýza. Během analýzy byla použita analýza hlavních komponent (PCA) k indikaci maximálních rozdílů a rozpoznávání vzorů pro získání přehledu a klasifikace. OPLS-DA je modelovací nástroj, který poskytuje vizualizaci prediktivního zatížení komponent OPLS-DA pro usnadnění vyhodnocení modelu. Variabilní význam pro projekci (VIP) byl použit pro posouzení hodnocení různých komponent, a tometabolitywith VIP values>1.0 a P-hodnota<0.05 were="" regarded="" as="" effective="" markers.="" furthermore,="" a="" permutation="" test="" was="" conducted="" for="" providing="" reference="" distributions="" for="" the="" r²/o²values="" that="" could="" show="" the="" statistical="">

Pokusy na zvířatech Krysy byly náhodně rozděleny do čtyř skupin (n{0}} pro každou skupinu), po kterých následovalo orální podávání různých extraktů: (1) Slepá kontrolní skupina: potkanům byl podán fyziologický roztok (2 ml/100 g) ; (2) CD skupina: krysám byl podán CD extrakt (2 ml/100 g); (3) CD-NP skupina: krysám byl podán CD-NP extrakt (2 ml/100 g); (4) Skupina CD-HP: krysám byl podán extrakt CD-HP (2 ml/100 g). Další kategorizace všech skupin byla provedena do tří podskupin pro plazmu, moč a výkaly. O dvě hodiny později bylo každé kryse orálně podáno stejné a stejné množství extraktů.

Po podání byl odběr vzorků krve proveden v 1.0 h, 2.0 h a 4.0 h do heparinizovaných 1,5ml polyethylenových zkumavek (z orbitálních žil) s následnou centrifugací (při 4500 ot./min.) všech vzorků po dobu 15 minut.

Pro vzorky moči a trusu byly krysy drženy v metabolických klecích a poté byl sběr vzorků moči a trusu prováděn po dobu 24 hodin po podání. Centrifugace vzorků moči byla prováděna při 4500 otáčkách za minutu po dobu 15 minut, zatímco vzorky výkalů byly sušeny ve stínu, rozemlety na prášek, poté bylo odebráno 0,2 g a přidáno do 0,5 ml fyziologického roztoku roztokem, ultrazvukem po dobu 5 minut a centrifugací při 12,000 otáčkách za minutu po dobu 15 minut. Všechny biologické vzorky byly až do analýzy udržovány při -80 stupních.

Příprava biologických vzorků. Přidání vzorků plazmy, moči a stolice se provádělo se 3 objemy methanolu s následným mícháním na vortexu po dobu 3 minut. Dále byla prováděna centrifugace (při 12, 000 rpm) směsí po dobu 10 minut, následovalo přenesení supernatantu do EP zkumavky a poté vysušení dusíkem při 37 stupních. Dále bylo provedeno přidání 200 μl roztoku HCN–H2O (50 procent). Deset, vír byl použit pro míchání (1 min), následované centrifugací (při 12,000 rpm) po dobu 5 min. Supernatant (5 ul) ošetřených vzorků byl injikován do systému UPLC-Q-TOF-MSE.

Podmínky kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie Analýza prometabolitybyla také provedena přístrojem Waters UPLC přes rozhraní ESI. Separace byly provedeny pomocí Acquity UPLC HSS T3 kolony (100 mm×2,1 mm, 1,8 µm), mobilní fáze byla 0,1% kyselina mravenčí (A): acetonitril (B), gradientová eluční podmínka byla 0-3 min (99,8 procent →98 procent A).3-5 min (98 procent →95 procent A),5-8 min (95 procent →90 procent A), { {18}} min (90 procent →85 procent A),12-17 min (85 procent →70 procent A), 17-22 min (70 procent →60 procent A), 22-23 min (60 procent →58 procent A), 23-25 min (58 procent A),25-32 min (58 procent →45 procent A) a 32-37 min (45 procent →35 procent A) ),0,4 ml min-1 byl průtok. Teplota pro kolonu a vzorkovnu byla nastavena na 40 stupňů, respektive 8 stupňů. Byly použity výše uvedené podmínky hmotnostní spektrometrie.

Pro zpracování dat byla použita strategie pro systematickou analýzu metabolitů v bio-samplesUNIFI (1.8.2) software. K identifikaci účinných metabolitů byla použita funkce Binary Compare. Vyhodnocené metabolity nebyly přítomny v ekvivalentním kontrolním vzorku nebo existují s nízkou iontovou intenzitou. Práh relativní intenzity byl nastaven na 3 nebo 5 a mohly být hodnoceny metabolity, které splnily podtržená kritéria. Běžné a předvídatelné metabolity pak byly stanoveny pomocí EIC. Pro vyhledávání dvoufázových metabolitů byla použita funkce NLF. Například v softwaru UNIFI lze nastavit parametry na 176,0321 pro hledání možných konjugátů kyseliny glukuronové. Po zpracování lze v metodě nastavit nebo identifikovat neutrální ztrátu. MassFragment byl použit pro stanovení nebo charakterizaci struktur detekovaných metabolitů, funkce spektrální interpretace UNIFI je hlavní funkcí používanou k analýze sekundární fragmentace rodičovských komponent. Tuto funkci lze použít pro rychlé ověření cesty fragmentace, pokud je to rozumné.

Výsledek

Pravidlo hmotnostní fragmentace fenylethanoidových glykosidů a iridoidů

Fenylethanoidové glykosidy jsou hlavními chemickými složkami CD. Standardní roztoky isoacteosidu,

byly odebrány cistanosid F, tubulosid A, echinakosid, akteosid a 2'-acetyl-akteosid, následovalo poskytnutí různé úrovně srážkových energií (tabulka 1) a poté byly získány odpovídající mapy MS2 (obr. 1).

Hmotnostní spektrometrická analýza odhalila, že fenylethanoidové glykosidy mají podobné vzorce fragmentace hmotnostního spektra, štěpné dráhy v režimu negativních iontů zahrnují hlavně (1) štěpení esterové vazby: ztráta neutrální kafeoylové skupiny (C, H, O162.03) a neutrální acetyl skupina (C, H, O,42.00);(2) Glykosidické štěpení: ztráta neutrálních zbytků rhamnózy (C.HIO, 146,05) a neutrálního glukózového zbytku (CgHO, 162,05). Z hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením bylo možné rozlišit caffeoyl (162,03) a glukózový zbytek (162,05).

Byly odebrány standardní roztoky iridoidů ajugol, katalpol, kyselina geniposidová, geniposid a 8-epide kyselina oxyloganová s následným poskytnutím různých srážkových energií a byly získány odpovídající mapy MS (obr. 2).

Iridoidní glykosidy mají podobné vzorce fragmentace hmotnostního spektra, štěpné dráhy v režimu negativních iontů zahrnují hlavně (1)Glykosidické štěpení: Ztráta neutrálního glukózového zbytku (CHOO,162,05);(2)Ztráta neutrálního CO,(43,99)a H O(18,01).

Identifikace sloučenin v CD, CD-NP a CD-HP extraktech

Analýza UPLC-QTOF-MSE

Byla provedena optimalizace chromatografických podmínek. Dále byly sloučeniny CistancheHerba hodnoceny v negativním i pozitivním iontovém módu s vysokými i nízkými CE. Získané výsledky ukázaly, že kompatibilita negativního módu byla vyšší ve srovnání s pozitivním módem pro tyto sloučeniny. Obrázek 3 ukazuje chromatogram základního píku iontu (BPI) MS s číslovanými píky. Intenzita každého detekovaného iontu v UPLC-Q-TOF-MS' analýze byla normalizována s ohledem na celkový počet iontů pro vytvoření datové matice, která se skládala z hodnoty m/z, normalizované plochy píku a retenčního času.

Hodnocení komponent z CD a jím zpracovaných produktů na platformě UNIFl

Celkem 97 sloučenin bylo identifikováno s -SEM (n{2}}) módem z CD a jeho zpracovaného produktu (Tabulka 2), včetně fenylethanoidových glykosidů (PhGs), iridoidů, lignanů a oligosacharidů. Složky 95, 91 a 94 byly detekovány v CD, CD-NP a CD-HP. Mezi nimi bylo 64 fenylethanoidů, 13 iridoidů a bylo stanoveno 20 dalších druhů sloučenin. V chemickém složení CD a jeho zpracovaného produktu byla podobnost, avšak bylo zjištěno, že množství složek se mezi CD a jeho zpracovaným produktem liší.

Variace v chemických složkách zpracovaných produktů Pro analýzu vícerozměrné datové matice byl použit software Simca-P 13.0. Před PCA byly všechny proměnné centrovány na střední hodnotu a škálovány podle Pareto, následovala identifikace potenciálních diskriminačních proměnných. V grafu skóre PCA každý bod ukazoval individuální vzorek. Vzorky, které vykazovaly podobnost ve svých chemických složkách, byly rozptýleny vedle sebe, zatímco vzorky, které vykazovaly odchylky ve svých složkách, byly rozděleny. Jak je vidět na PCA (obr. 4), skupina CD-HP byla oddělena od skupin CD a CD-NP.

To distinguish CD from CD-HP and CD-NP, OPLS-DA, permutation test, S-plot, and VIP value were developed. (Figs.5, 6,7)The obtained results revealed that many components were key characteristic components of each product. The screening condition was the VIP>1 a P<0.05. from="" the="" date="" of="" the="" s-plot,="" the="" characteristic="" components="" were="" evaluated,="" which="" were="" commonly="" existing="" in="" the="" three="">

Z obr. 8 jsme zjistili intenzitu akteosidu (54), cistanosidu C (74), kamneosidu I (43), osmanthusidu (75) a 2'-aktylakteosidu (80) s 4'-O-kafeoylovou skupinou v část 8-O- -D-glukopyranosylu (viz obr. 9) se po zpracování rýžovým vínem snížila, zatímco intenzita isoacetosidu (60) je kastanosid (71), iso-campneosid I (69), isomartynosid (86) mající 6'-O-kafeoylovou skupinu (viz obr. 9) zvýšený, zejména u skupiny CD-NP. Ačkoli tubulosid B (72) má 6'-O-kafeoylovou skupinu, stejně jako isoakteosid, intenzita se snížila kvůli jeho 2'-acetylové skupině. Intenzita echinakosidu(38) a cistanosidu B s 6'-O- -D-glukopyranosylovými skupinami se zvýšila, ale intenzita tubulosidu A (55) se snížila také kvůli jeho 2'-acetylové skupině.

Náš výzkumný tým také studoval tepelnou stabilitu akteosidu a isoakteosidu a zjistil, že akteosid je nestabilní ve vodě, methanolu a roztoku žlutého rýžového vína a může být přeměněn na isoakteosid částečně za podmínek zahřívání. Ale termostabilita isoakteosidu byla lepší, zvláště v roztoku žlutého rýžového vína. Obrázek 10 ukazuje možné změny PhG v CD během zpracování:

Identifikace metabolitů u potkanů ​​Z údajů hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením byla analyzována a porovnána přesná molekulová hmotnost a elementární složení metabolitů a protomolekulárních sloučenin. Protože stejné druhy sloučenin v TCM vykazovaly podobnost v metabolických modifikacích, korelace fytochemických složek in vitro se mohou rozšířit na jejich metabolity in vivo. Mezitím byla na základě konvenčních biotransformačních drah odvozena rozumná změna molekulové hmotnosti. Nakonec byly metabolity identifikovány analýzou MSE hmotnostního spektra metabolitů a dráhy fragmentace protosloučenin v hmotnostním spektru [21, 22]. Ve srovnání se slepým vzorkem byly jeho složky identifikovány in vivo na základě informací poskytnutých chromatogramem-hmotnostním spektrem, možností metabolické reakce, charakteristikami struktury sloučeniny a pravidlem fragmentace jejího hmotnostního spektra. Viz tabulka 3.

Identifikace metabolitů souvisejících s fenylethanolglykosidy

Pro zpracování byla použita platforma UNIFI. Obrázek 11 ukazuje TIC chromatograf moči, stolice a plazmy pro CD a jeho zpracované produkty. Ve srovnání se slepými vzorky bylo u potkanů ​​identifikováno celkem 54 metabolitů, včetně 10 prototypových složek a 44 metabolitů, z nichž 24, 49 a 6 bylo ve výkalech, moči a plazmě.

Na základě přesné hmotnosti, fragmentační kaskády a předvídatelných neutrálních ztrát biotransformací bylo předběžně vyhodnoceno celkem 35 metabolitů spojených s fenylethanoidovými glykosidy. Příbuzné metabolity fenylethanoidových glykosidů mají podobné vzorce fragmentace hmotnostního spektra, jako typický dekafeoylový fragment m/z 461,1605, poté dále hydrolyzovány glykosidickými a esterovými vazbami in vivo a metabolizovány na hydroxytyrosol (HT)(m/ z153,0504, C.HO. 4,73 min) a kyselina kávová (CA) (m/z179,0389, CH, 0,77 min), viz obr. 12A.

M11 indikováno [MH]~ při m/ 153,0504 se vzorcem tj. C.HO, a identifikováno jako HT. M16 vykazovala [MH]- při m/z 329,0851, což bylo o 176 Da zvýšené než u HT, což ukazuje, že by mohlo jít o glukuronidovaný metabolit HT. [MH]-M26 byl při m/z 343,1037,14 Da vyšší než u HT-glukuronidu. Proto byl M26 identifikován jako HT-methylovaný glukuronid. M17 byl identifikován jako HT-sulfát na základě jeho [MH]-při m/z 233,0112,80 Da nad HT, který mohl být dále methylován, pak produkoval M22, který vykazoval m/z 247,0278, což naznačuje, že to byl HT- methylovaný sulfátovaný metabolit. M7 (m/167,0335) a M5 (m/z 167,0762) byly považovány za oxidační produkty a methylované HT (obr. 12B).

M1 indikoval [MH]- při m/z 179,0389, objasněný molekulový vzorec byl CH-O a identifikoval se jako kyselina kávová (CA). že by to mohl být glukuronidovaný metabolit CA. M27 měl m/z 258,994, což bylo o 80 Da vyšší než u CA, takže jsme ho objasnili jako CA sulfát a mohl produkovat M35 (m/z 273,0064). Protože M4 poskytuje [MH]7 při m/z 193,0524,14 Da vyšší než CA, byl identifikován jako metylovaný metabolit CA. M39 byl dehydroxylační metabolit CA s m/z 163,04 a mohl být sulfatován na M32 (m/z 242,9951).

M33(m/z 181.0491, C.HO, 9,06 min) byl redukční produkt CA, tj. 3,4-dihydroxybenzenpropionové kyseliny, kterou bylo možné methylovat na M19 (m /z 195,0623, C10H12O4, 0,93 min). M33 by mohl být dehydratován na M43, to je 3-HPP (m/z 165,0558, C9H10O3, 11,29 min) a M31 (m/z 341,0942, C15H17O9, 8,90 min) a C29 (m/z,H0125245 8,52 min) byly glukuronidované a sulfatované produkty (obr. 12C).

Pro metabolity spojené s fenylethanoidními glykosidy byly klíčovými metabolickými kaskádami metabolické reakce fáze II, tj. glukuronidace, methylace a sulfatace. Navrhované metabolické kaskády fenylethanoidů jsou znázorněny na obr. 13.

Identifikace metabolitů souvisejících s iridoidy

Analýzou elementárního složení metabolitů, fragmentace MSE a související literatury bylo předběžně vyhodnoceno celkem 19 metabolitů spojených s iridoidy. Iridoidní glykosidy byly hydrolyzovány glykosidickými vazbami za vzniku jejich odpovídajících aglykonů. m/z 185,117 byla pro M8, 162 Da menší než ajugol, což bylo získáno ztrátou glukózového zbytku.

M40(m/z 199,0641, Rt 10,91 min) byl deglykosylovaný produkt katalpolu. M45 m/z 169,0487, Rt 12,15 min) byla nižší než 30 Da pro katalpol deglykosylovaný metabolit a byla identifikována jako odstranění molekuly metabolitu CH,O. M34(m/z 151,0352, Rt 9,08 min), byla další ztráta H,O metabolitu.

M44(m/z 211,0665, Rt 11,31 min) byl deglykosylovaný metabolit geniposidu a M37(m/z 197,0833, Rt 15,03 min) byla deglykosylace 8-epideoxyloganové kyseliny. Metabolické reakce pro iridoidy by mohly být odhaleny jako metabolismus fáze I deglykosylace (obr. 12D).

Srovnání metabolického profilování v plazmě, moči a stolici mezi CD a jeho zpracovanými produkty

Byly porovnány 2 prototypy v plazmě, 7 v moči a 3 ve stolici. Bylo 7 prototypů absorbovaných v CD, 7 prototypů absorbovaných v CD-NP a 8 prototypů v CD-HP. M21 byl detekován pouze ve stolici skupiny CD-NP a M38 a M51 byly detekovány pouze ve skupinách CD-HP v moči. Ve srovnání s metabolity bylo identických metabolitů v plazmě, moči a stolici 4, 42 a 21, v tomto pořadí. Ve skupině CD bylo absorbováno 34 metabolitů, 39 ve skupině CD-NP a 40 ve skupině CD-HP. M5, M7, M40 a M52 byly detekovány pouze ve skupinách CD-NP, zatímco M24, M41 a M48 byly detekovány pouze ve skupinách CD-HP.

V různých zpracovaných produktech CD byly pozorovány variace v absorpci a také metabolismu aktivních sloučenin. Z obr. 14 jsme zjistili, že intenzita konjugace HT-sulfátu (M17) byla nejvyšší v moči, následovala konjugace 3-HPP sulfát (M29), konjugace methylovaného HT sulfátu (M22), dehydroxylovaný CA sulfát konjugace (M32) a konjugace 3,4-dihydroxybenzenpropionové kyseliny sulfátové (M19). Obsah metabolických produktů ve zpracované skupině byl vyšší než ve skupině CD, zejména u M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2. Jejich prekurzor 6'-O-kafeoylová skupina v 8-O- -D-glukopyranosylové části, sloučeniny, jako je hydroxytyrosol, mají protinádorové, protizánětlivé, antibakteriální, antivirové a antifungální vlastnosti [ 23]. Kyselina kávová má protizánětlivé, protirakovinné a antivirové účinky [24]. Bylo to v souladu s klinickým používáním CD a jeho zpracovaných produktů.

Diskuse

CD je TCM a jeho hlavní bioaktivní složky, včetně PhG, iridoidů a polysacharidů, byly zdokumentovány různými výzkumnými studiemi. V klinické praxi TCM byly zpracované produkty CD široce používány ve srovnání se syrovými. Chemické složení se bude během zpracování měnit, což může vést ke změnám léčivých účinků (obr. 14).

PhG jsou typem fenolické sloučeniny charakterizované -glukopyranosidovou strukturou nesoucí hydroxyfenylethylovou skupinu jako aglykon. Tyto sloučeniny často obsahují kyselinu kávovou a rhamnózu připojenou ke zbytku glukózy prostřednictvím esterových nebo glykosidických vazeb. V současné studii jsou kvalitativní analýzy CD, CD-NP. a CD-HP a bylo identifikováno celkem 97 sloučenin, včetně fenylethanoidových glykosidů (PhGs), iridoidů atd. Získané výsledky ukázaly odchylky v chemickém složení před a po zpracování. Intenzita PhGs, které mají 4'-O-kafeoylovou skupinu v 8-O- -D-glukopyranosylové části, jako je akteosid, cistanosid C, kamneosid II, osmantusová strana, se po zpracování snížila, zatímco PhG s

jako isoacetosid, isocistanosid, isocampneoside I, isomartynosid zvýšené, zejména ve skupině CD-NP. Zvýšila se také intenzita echinakosidu a cistanosidu B, jejichž struktura má 6'-O- -D-glukopyranosylovou skupinu. PhG, které mají 2'-acetylovou skupinu, často klesají kvůli hydrolytické reakci během procesu, jako tubulosid B, 2-acetylakteosid.

Zkoumání metabolitů absorbovaných in vivo bylo provedeno po perorálním podání CD a jeho zpracovaných produktů. Metabolické procesy fáze II byly klíčovými kaskádami a většina metabolitů byly sulfátové, glukuronidové a methylované konjugáty. Fenylethanolové glykosidy mají nízkou perorální absorpci a využití. Je obtížné je vstřebat do krve a působí jako progenitory, kteří hrají svou roli po metabolické aktivaci in vivo. Fenylethanoidy produkované na fenyletanolaglykon, jako je hydroxytyrosol (HT) a kyselina kávová (CA) a její derivát 3-kyselina hydroxyfenylpropionová (3-HPP), mohou být tyto metabolity snadněji absorbovány do plazmy a mají lepší léčivý účinek.

CD a jeho zpracované produkty. HT-sulfátová konjugace (M17) má nejvyšší intenzitu v moči, následuje 3-HPP sulfátová konjugace (M29), methylovaná HT sulfátová konjugace (M22), dehydroxylovaná CA sulfátová konjugace (M32) a 3, {{ 7}} konjugace se sulfátem kyseliny dihydroxybenzenpropionové (M19). Obsah metabolických produktů ve zpracované skupině byl vyšší než ve skupině CD, zejména u M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2.

Obecně mohou být účinné složky s vysokou expozicí v cílových orgánech. In vitro bylo hodnoceno a stanoveno dostatečné množství fenylethanoidů a jejich derivátů. Charakteristickou sloučeninou je akteosid, jehož obsah se po zpracování rýžovým vínem snížil a odpovídajícím způsobem vzrostl obsah isoakteosidu, isocistanosidu C, isokampneosidu I. Produkty degradace PhGs, jako jsou deriváty CA a HT, by mohly být hodnoceny v biologických vzorcích a zpracování rýžového vína může zvýšit absorpci metabolitů in vivo.

Závěr

V této studii bylo v extraktech CD a jeho zpracovaném produktu detekováno 97 sloučenin. K degradaci několika glykosidů došlo za zvýšené teploty a v důsledku toho byly syntetizovány některé nové izomery a komplexy. Ve studii in vivo byly prototypové složky (10) a metabolity (44) stanoveny nebo předběžně hodnoceny v potkaní plazmě, stolici a moči. Metabolické procesy fáze II byly klíčovými kaskádami, většina metabolitů byla spojena s echinakosidem nebo akteosidem, jako je HT, CA a jejich deriváty 3-kyselina hydroxyfenylpropionová 3-HPP. Tyto metabolity mohou být snadněji absorbovány do plazmy a mají lepší léčebný účinek. Získané výsledky ukázaly, že chemické složení CD bylo odlišné a ovlivnilo dispozice sloučeniny in vitro a in vivo.

Zkratky

PhGs: fenylethanoidní glykosidy; CD: Cistanche deserticola; CMM: Chinese Materia Medica; TCM: Tradiční čínská medicína; CD-NP: Gistanche deserticola Zpracováno v páře s rýžovým vínem za normálního tlaku; CD-HP: Cistanche deserticola Zpracováno v páře s rýžovým vínem pod vysokým tlakem; UPLC-Q-TOF-MS: Ultra-vysokoúčinná kapalinová chromatografie spojená s TOF-MS; PCA: Analýza hlavních komponent; VIP: Proměnná důležitost pro projekci; CA: Caffeicacid; HA: Hydroxytyrosol.

Poděkování

Nelze použít.

Příspěvky autorů

Na koncipování, psaní rukopisu se podíleli LZ, LBN, SJ. RJ, LPP asistovala při pokusech na zvířatech a vypracovala a dokončila všechny obrázky a tabulky. ZC, HY. ITZ pomohla s návrhem a provedením této studie a zkontrolovala rukopis. Všichni autoři přečetli a schválili konečný rukopis.

Financování

Tato práce byla podpořena National Natural Science Foundation of China (Grant č:81874345) a Natural Science Foundation of Liaoning Province (Grant no: 2020-MS-223).

Dostupnost dat a materiálů

Soubory dat použité a/nebo analyzované v průběhu aktuální studie jsou na přiměřenou žádost k dispozici od odpovídajícího autora.

Prohlášení

Etický souhlas a souhlas s účastí

Etické schválení pro použití experimentálních zvířat pro tuto studii bylo získáno od lékařské etické komise Liaoningské univerzity tradiční čínské medicíny (číslo schválení: 2018YS(DW)-044-01), všechny experimentální postupy v této studii byly v souladu s etickými standardy lékařský etický výbor Liaoningské univerzity tradiční čínské medicíny.

Souhlas se zveřejněním

Nelze použít.

Konkurenční zájmy

Autoři prohlašují, že nemají žádné střety zájmů, které by mohli zveřejnit.

Podrobnosti o autorovi

„Farmaceutické oddělení, Univerzita tradiční čínské medicíny Liaoning, Dalian, Liaoning, Čína.“ Ústav pro výzkum léčiv skupiny Monos, Ulánbátar 14250, Mongolsko.

Přijato:31. května 2021 Přijato:17. září 2021 Zveřejněno online: 28. září 2021

Zhe Li1, Lkhaasuren Ryenchindorj2, Bonan Liu1, Ji Shi1*, Chao Zhang1, Yue Hua1, Pengpeng Liu1, Guoshun Shan1 a Tianzhu Jia1

Reference

1. Komise pro čínský lékopis. Pharmacopeia Čínské lidové republiky, sv. I. Peking: China Medical Science Press; 2020. str. 140.
2. Li Z, Lin H, Gu L, Gao J, Tzeng CM. Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): jeden z nejlepších farmaceutických darů tradiční čínské medicíny. Front Pharmacol. 2016;7:41.
3. Liu BN, Shi J, Zhang C, Li Z, Hua Y, Liu PP, Jia TZ. Vliv různých metod sušení pro Fresh Cistanche deserticola na obsah složek. J Chin Med Mater. 2020;10:2414–8.
4. Liu BN, Shi J, Jia TZ, Lv TT, Li Z. Optimalizace procesu vysokotlakého napařování pro Cistanches Herba. Chin Trad Patent Med. 2019;11:2576–80.
5. Fan YN, Huang YQ, Jia TZ, Wang J, La-Sika, Shi J. Účinky Cistanches herba před a po zpracování na funkci proti stárnutí a imunitní funkci stárnoucích potkanů ​​vyvolaných D-galaktózou. Chin Arch Trad Chin Med, 2017; 11:2882–2885.
6. Gao YJ, Jiang Y, Dai F, Han ZL, Liu HY, Bao Z, Zhang TM, Tu PF. Studie o laxativních složkách v Cistanche deserticola YMCA. Moderní Chin Med. 2015;17(4):307–10.
7. Liu BN, Shi J, Li Z, Zhang C, Liu P, Yao W, Jia T. Studie neuroendokrinně-imunitní funkce Cistanche deserticola a jejích produktů napařování rýžového vína na krysím modelu indukovaném glukokortikoidy. Evid Based Complement Alternat Med. 2020;22:5321976.
8. Guo Y, Wang L, Li Q, Zhao C, He P, Ma X. Zlepšení povzbuzující funkce ledvin u myšího modelu pomocí Cistanches herba rychle sušené při středně vysoké teplotě. J Med Food. 2019;22(12):1246–53.
9. Wang T, Zhang X, Xie W. Cistanche deserticola YC Ma, "Pouštní ženšen": recenze. Am J Chin Med. 2012;40(6):1123–41.
10. Fu Z, Fan X, Wang X, Gao X. Cistanches Herba: Přehled její chemie, farmakologie a farmakokinetických vlastností. J Ethnopharmacol col. 2018;219:233–47.
11. Lei H, Wang X, Zhang Y, Cheng T, Mi R, Xu X, Zu X, Zhang W. Herba Cistanche (Rou Cong Rong): přehled jeho fytochemie a farmakologie. Chem Pharm Bull. 2020;68(8):694–712.
12. Geng X, Tian X, Tu P, Pu X. Neuroprotektivní účinky echinakosidu u myšího MPTP modelu Parkinsonovy choroby. Eur J Pharmacol. 2007;564:66–74.

13. Deng M, Zhao JY, Ju XD, Tu PF, Jiang Y, Li ZB. Ochranný účinek tubulosidu B na apoptózu neuronových buněk indukovanou TNF alfa. Acta Pharmacol Sin. 2004;25(10):1276–84.
14. Nan ZD, Zhao MB, Zeng KW, Tian SH, Wang WN, Jiang Y, Tu PF. Protizánětlivé iridoidy ze stonků Cistanche deserticola kultivovaných v poušti Tarim. Chin J Nat Med. 2016;14(1):61–5.
15. Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y, Tu PF. Fenylethanoidové glykosidy s protizánětlivými účinky ze stonků Cistanche deserticola kultivovaných v poušti Tarim. Fitoterapie. 2013;89:167–74.
16. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Yuan D, Yoshikawa M, Hayakawa T, Muraoka O. Iridoidní a acyklické monoterpenové glykosidy, kankanosidy L, M, N, O a P z Cistanche tubulosa. Chem Pharm Bull. 2010;58(10):1403–7.
17. Li SL, Song JZ, Qiao CF a kol. Nová strategie pro rychlé prozkoumání potenciálních chemických markerů pro rozlišení mezi surovým a zpracovaným Radix Rehmanniae pomocí UHPLC-TOF-MS s vícerozměrnou statistickou analýzou. J Pharm Biomed Anal. 2010;51(4):812–23.
18. Peng F, Chen J, Wang X, Xu CQ, Liu TN, Xu R. Změny hladin fenylethanoidových glykosidů, antioxidační aktivity a dalších kvalitativních znaků v plátcích Cistanche deserticola zpracováním párou. Chem Pharm Bull. 2016;64:1024–30.
19. Ma ZG, Tan YX. Obsahové změny šesti fenylethanoidních glykosidů při paření zasahují do vína v Desertliving Cistanche. Chin Trad Pat ent Med. 2011;33(11):1951–4.
20. Peng F, Xu R, Wang X, Xu C, Liu T, Chen J. Vliv procesu vaření v páře na kvalitu posklizňové cistanche deserticola pro léčebné použití při sušení na slunci. Biol Pharm Bull. 2016;39(12):2066–70.
21. Cui Q, Pan Y, Zhang W, Zhang Y, Ren S, Wang D, Wang Z, Liu X, Xiao W. Metabolity dietárních akteosidů: profily, izolace, identifikace a hepatoprotektivní kapacity. J Agric Food Chem. 2018;66(11):2660–8.
22. Cui Q, Pan Y, Bai X, Zhang W, Chen L, Liu X. Systematická charakterizace metabolitů echinakosidu a akteosidu z Cistanche tubulosa v potkaní plazmě, žluči, moči a stolici na základě UPLC-ESI-Q-TOF -SLEČNA. Biomed Chromatogr. 2016;30(9):1406–15.
23. Bertelli M, Kiani AK, Paolacci S, Manara E, Kurti D, Dhuli K, Bushati V, Miertus J, Pangallo D, Baglivo M, Beccari T, Michelini S. Hydroxytyrosol: přírodní sloučenina se slibnými farmakologickými aktivitami. J Biotechnol. 2020;309:29–33.
24. Touaibia M, Jean-François J, Doiron J. Cafeic Acid, všestranný farmakofor: přehled. Mini Rev Med Chem. 2011;11(8):695–713.

Poznámka vydavatele

Springer Nature zůstává neutrální, pokud jde o jurisdikční nároky v publikovaných mapách a institucionálních přidruženích.