Kalpastatin zabraňuje poškození podocytů zprostředkovaného angiotensinem II prostřednictvím udržování autofagie
Mar 17, 2022
další informace:ali.ma@wecistanche.com
Imane Bensaada1,3, Blaise Robin1,3, Joe¨lle Perez2, Yann Salemkour1, Anna Chipontová1, Marine Camus1,Mathilde Lemoine1, Lea Guyonnetová1, He'le`ne Lazareth1, Emmanuel Letavernier2, Carole He´nique1Pierre-Louis Tharaux1a Olivia Lenoir1
1Université de Paris, PARCC, Inserm, Paříž, Francie; a2Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité, Paříž, Francie
Silná prediktivní hodnota proteinurie u chronických glomerulárních patologií je pevně stanovena, stejně jako patogenní úloha angiotensinu II podporujícího progresi glomerulárního onemocnění se změněnou glomerulární fi-filtrační bariérou, poškozením podocytů a zjizvením glomerulů. Zde jsme zjistili, že chronická hypertenze indukovaná angiotensinem II inhibovalaautofagieeflux v myších glomerulech. Delece Atg5 (genu kódujícího protein zapojený do autofagie) specificky v podocytu vedla k akcelerované podocytopatii indukované dangio tensinem II, akcentované albuminurii a glomeruloskleróze. To ukazuje, že autofagie je v tomto stavu klíčovým ochranným mechanismem v podocytu. Aktivita calpainu v podocytech indukovaná angiotensinem II inhibujeautofagievýtok. Podocyty z myší s transgenní expresí endogenního inhibitoru calpainucalpastatinvykazoval vyšší podocytautofagieve výchozím stavu, který byl rezistentní k inhibici závislé na angiotenzinu II. Také trvalá autofagie scalpastatinomezené poškození podocytů a albuminurie. Tato zjištění naznačují, že hypertenze má patogenní účinky na glomerulární strukturu a funkci, částečně prostřednictvím aktivace calpainů vedoucí k blokádě autofagie podocytů. Tato zjištění odhalují originální mechanismus, kterým hypertenze zprostředkovaná angiotensinem II inhibuje autofagii prostřednictvím vápníkem indukovaného náboru calpainu s patogenními důsledky v případě nerovnováhy.calpastatinaktivita. Tím se zabrání poklesu zprostředkovanému calpainemautofagiemůže být slibnou novou terapeutickou strategií pro nefropatie spojené s vysokou aktivitou renin-angiotenzinového systému.
KLÍČOVÁ SLOVA: angiotenzin II;autofagie; calpastatin; hypertenze; podocyt
Překladové prohlášení
Vzhledem k zásadní roli autofagie ve vývojiledvinaonemocnění, farmakologická modulaceautofagiemůže být slibnou strategií pro prevenci a léčbu několikaledvinanemocí. Současně bylo zjištěno, že nadměrná aktivace aktivity calpainu v podocytech má škodlivé účinky na funkci podocytů, zatímco jeho škodlivé mechanismy účinku nebyly identifikovány. Zde poskytujeme důkaz, že calpain spojuje škodlivé působení angiotenzinu II se škodlivou blokádouautofagiev podocytech a naznačují, že inhibice calpainu by mohla být slibným terapeutickým cílem pro onemocnění podocytů částečně prostřednictvím udržování autofagie podocytů.
Klikněte naCistanche deserticola ma pro chronické onemocnění ledvin
Hypertenze je na druhém místě po diabetu jako hlavní příčina progresivní chronickéledvinaonemocnění1–3 a dokonce i mírné zvýšení krevního tlaku je nezávislým rizikovým faktorem pro konečné stadium onemocnění ledvin.4 Rostoucí počet experimentálních studií zdůrazňoval význam podocytů ve vývojiledvinazranění. Progresivní ztráta podocytů a mikrovaskulární změny se objevují časně s poklesem funkčních ledvin u experimentální hypertenzní nefropatie.5 U pacientů se ukázalo, že vylučování životaschopných podocytů močí je citlivým a specifickým markerem preeklampsie,6,7 a pacienti s nefrosklerózou měli významně nižší hustota glomerulárních podocytů než tomu byloledvinadárců.8,9 Patogenní úloha angiotenzinu II (AngII) podporujícího progresi glomerulárního onemocnění je dobře prokázána, a to nejen u hypertenzních stavů, ale také u některých glomerulárních onemocnění.10–21
Glomerulární hypertenze má za následek natažení glomerulárních kapilár, poškození endotelu a zvýšenou filtraci glomerulárních proteinů způsobující glomerulární kolaps a glomerulosklerózu. Působí také přímo na glomerulární struktury, což způsobuje signalizační regulační reakce zaměřené na kompenzaci. Aktivovaný systémový a lokální renin-angiotenzin-aldosteronový systém (RAAS) podporuje mezangiální hyperplazii a syntézu faktorů vaskulární permeability. Současně podocyty vykazují kalciovou signalizaci22,23 a modifikují svůj tvar po stimulaci závislé na receptoru AngII typu 1 (AT1).24–28 Tyto adaptivní mechanismy se z dlouhodobého hlediska stávají maladaptivními, což nakonec vede ke glomeruloskleróze. AT1 zprostředkovává prominentní zapojení RAAS pro krevní tlak a homeostázu soli a vody. Inhibitory angiotenzin-konvertujícího enzymu a blokátory AT1 se klinicky používají k léčbě hypertenze a srdečního selhání u pacientů. Zajímavé je, že oba blokátory také vykazují ochranný účinek naledvinafunkce.
Bylo prokázáno, že autofagie je nezbytná pro udržení buněčné homeostázy, zejména v postmitotických buňkách29,30 a zejména v podocytech.31–34Autofagieje lysozomálně asociovaný degradační systém pro cytoplazmatické proteiny s dlouhou životností a dysfunkční organely35,36 a zahrnuje sekvestraci proteinů a organel v autofagosomech. Tvorba autofagozomů je závislá na indukci několika genů včetně Map1lc3a/b, Beclin 1 a Tags. 37 Přibývá důkazů, že dysregulace autofagické dráhy se podílí na patogenezi stárnutí ledvin a několikaledvinaonemocnění, jako je akutní poškození ledvin, polycystické onemocnění ledvin, stárnutí a diabetická nefropatie.31,32,38–41
Regulaceautofagiev podocytech, fyziologické a především v patologickém kontextu, není dobře znám. Nedávno jsme prokázali, že autofagie podocytů je nezávislá na mechanistickém cíli regulace rapamycinu (mTOR) za fyziologických podmínek, což z tohoto typu buněk činí výjimku.42 Aktivace AT1 stimuluje syntézu proteinů a obrat proteinů v buňkách. Usoudili jsme tedy, že aktivace RAAS může také ovlivnit stimulaci obratu proteinů a proteostázu.
V této studii jsme se zaměřili na roli AngII signalizace v podocytechautofagienařízení. Identifikovali jsme vápníkem aktivované proteázy calpainy zprostředkovávající chronický blokující účinek AngII na podocytyautofagie. Dále jsme zjistili, že endogenní inhibitor calpainucalpastatinbyl schopen zabránit inhibici autofagie závislé na AngII a poškození podocytů během hypertenze.
Tato zjištění odhalují originální mechanismus, kterým AngII-zprostředkovaná hypertenze inhibujeautofagieprostřednictvím vápníku indukovaného náboru calpainu s patogenními důsledky v případě nerovnováhy aktivitou calpastatinu.
METODY
Zvířata
calpastatintransgenní (CSTTg) myši laskavě poskytl Dr. E. Letavernier.43 Myši s podocytově specifickým narušením genu Atg5 (Nphs2.cre Atg5lox/lox) byly vytvořeny, jak bylo popsáno dříve31 křížením myší Nphs2.cre44 s Atg5lox/lox myši45 na pozadí C57BL6/J. V této studii byly použity myši Nphs2.cre Atg5lox/lox a kontrolní samci ze stejného vrhu ve věku 10 až 12 týdnů. Hypertenzní model byl indukován sc infuzí AngII (Sigma-Aldrich, A9525) v dávce 1 mg/kg/min po dobu 4 až 6 týdnů pomocí osmotických minipump (Alzet Corp, model 2006). Pumpy byly implantovány sc na záda mezi lopatky a boky. Myši dostávaly doplněk soli (3 procenta NaCl) v potravě. Ve všech studiích byly jako kontroly použity myši Atg5lox/lox (divokého typu [WT]). V případě soli deoxykortikosteronacetátu (DOCA) s modelem redukce nefronů dospělí samci myší podstoupili jednostrannou levou nefrektomii. Dva týdny po nefrektomii dostali pelety DOC s implantovaným 21-denním uvolňováním (Innovative Research of America) sc. Druhá peleta byla implantována 3 týdny po prvním implantátu. Všechny myši dostávaly 0,9 procenta NaCl v pitné vodě ad libitum a byly usmrceny po 6 týdnech podávání DOC.46 Pokusy byly prováděny podle francouzských veterinárních pokynů a podle pokynů Evropského společenství pro použití na pokusných zvířatech (L358-86/ 609EEC) a byly schváleny francouzským ministerstvem výzkumu a etickou komisí místního univerzitního výzkumu (APAFIS-7646 a -22373).
Primární experiment s kultivací podocytů
Diferencované primární podocyty byly kultivovány, jak bylo popsáno dříve.47,48 Stručně, čerstvě izolovaný ledvinový kortex byl smíchán a štěpen kolagenázou I (Gibco, 17100-017) v Roswell Park Memorial Institute 1640 (Life Technologies, 61870-044). Tkáně pak prošly přes 70 mm a 40 mm buněčná síta (BD Falcon, 352340 a 352350). Glomeruli, které ulpívají na 40mm buněčném sítku, byly odstraněny fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS; Life Technologies, 10010023) + 0,5 procenta hovězího sérového albuminu (Eurobio, HALALB07-65) injikovaným pod tlakem a poté byly dvakrát promyty v PBS. Čerstvě izolované glomeruly byly umístěny do 6-jamkových misek v Roswell Park Memorial Institute 1640 (Gibco, 61870036) doplněné 10 procenty fetálního telecího séra a 1 procentem penicilinu/streptomycinu (Life Technologies, 15140122), aby mohly podocyty opustit glomeruly a růst. Obohacení podocytů bylo ověřeno analýzou Western blot, jak bylo popsáno dříve31,48,49 (doplňkový obrázek S1). Podocyty byly kultivovány v nepřítomnosti nebo přítomnosti bafilomycinu AI (100 nmol/l, Sigma-Aldrich, B1793) po dobu 4 hodin. Pro imunofluorescenční experimenty byly primární podocyty naneseny na 4 štítky misek (Dutcher, 055071). Podocyty byly poté fixovány v paraformaldehydu 4 procenta po dobu 10 minut a zpracovány pro imunofluorescenci.
Test aktivity calpainu
Intracelulární aktivita kalpainu byla stanovena v primárních podocytech, jak bylo popsáno dříve.50–52 Celkem 100000 buněk bylo kultivováno v 24-jamkových tkáňových kultivačních miskách v Roswell Park Memorial Institute 1640 doplněných 10 procenty fetálních buněk telecí sérum a 1 procento penicilin/streptomycin. Po uvedené kultivační periodě bylo médium nahrazeno roztokem Krebs-Ringer HEPES bikarbonátu (KRH) (pH 7,4) obsahujícím 4 mM CaCl2, s nebo bez 10 mM inhibitoru calpainu-1 a inkubováno 10 minut před přidáním 50 mM calpainového substrátu N-sukcinyl-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amino-4-methylkumarinu (Sigma-Aldrich, S6510). Po 90-minutové inkubační době byla aktivita calpainu stanovena jako rozdíl mezi fluorescencí FL (měřenou při excitaci 360 nm a emisi 430 nm) s a bez inhibitoru calpainu-1.
Western blot
Primární podocyty byly seškrábnuty 80 ml radioimunoprecipitačního testovacího pufru obsahujícího fosfatázu a inhibitor proteázy. Koncentrace proteinu byla měřena pomocí soupravy BCA Protein Assay Kit (Merck Biochemistry, 71285). Dvacet mikrogramů proteinů bylo podrobeno elektroforéze na prefabrikovaném gelu Criterion XT (12 procent Bis-Tris, Bio-Rad, 3450124). Proteiny byly přeneseny na polyvinylidendifluoridovou membránu (Thermo Fischer Scientific, 88518). Po zablokování v 5% mléce v Tris Buffer Saline 0,1% Tween (TBS-T) byly membrány inkubovány s králičím polyklonálním anti-LC3 (1:1000, Cell Signaling Technology, 2575), králičím polyklonálním anti-ATG5 (1:2000, Cell Signaling Technology, 2630), morčecí polyklonální anti-sekvestozom 1 (SQSTM1)/P62 (1:10 000, PROGEN, GP62), králičí polyklonální anti-calpain 1 doména IV (1:1000, Abcam, ab3917 ), králičí polyklonální anti-calpain 2 amino-terminální konec domény I (1:1000, Abcam, ab39165), myší monoklonální IgG1 anti-calpain 4 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, sc{41}}), králík anti podocin (1:1000, Abcam, ab50339), morčecí anti-nefrin (1:500, PROGEN, GP-N2) a potkaní monoklonální anti-tubulin (1:5000, Abcam,ab6160) protilátka. Po promytí byly membrány inkubovány s protilátkou navázanou na křenovou peroxidázu (1:2000, Cell Signaling Technology, 7074, 7076, 7077). Detekce specifických signálů byla provedena pomocí ECL Chemiluminescent Kit (Bio-Rad, 170-5070) na zařízení LAS 4000 (Fuji). Pro kvantifikaci byla použita denzitometrická analýza pomocí softwaru ImageJ (National Institutes of Health).
Měření krevního tlaku a fyziologická vyšetření
Systolický krevní tlak myší byl zaznamenáván pomocí metody manžety na ocasu (Visitech Systems Inc., BP-2000). Bylo provedeno deset měření od každé myši a poté byla stanovena střední hodnota. Systolický krevní tlak byl měřen na začátku (12 týdnů věku) a poté jednou týdně až do konce léčebného období. Všechny myši byly umístěny do metabolických klecí s volným přístupem k vodě na 6-hodinový sběr moči. Koncentrace kreatininu v moči a plazmatické močoviny byly analyzovány spektrofotometricky pomocí kolorimetrické metody (Olympus, AU400). Vylučování albuminu močí bylo měřeno pomocí specifického enzymatického imunosorbentního testu pro kvantitativní stanovení albuminu v moči myší (Crystal Chem, 80630).
Histologie
Ledvinybyly sklizeny a fixovány ve 4% PBS-pufrovaném formalínu. Řezy zalité v parafínu (tloušťka 3- mm) byly obarveny Massonovým strichromem, aby se vyhodnotila morfologie ledvin. Abnormality v ledvinách byly odstupňovány na základě přítomnosti a závažnosti dílčích abnormalit, včetně glomerulosklerózy, mezangiální expanze, tubulární atrofie nebo odlitků a fibrózy. Podíl sklerotických glomerulů byl hodnocen slepým vyšetřením alespoň 50 glomerulů naledvinasekce.
Imunofluorescenční barvení řezů ledvin a primárních podocytů
Fixované primární podocyty byly blokovány v TBS-T 3% bovinním sérovém albuminu a inkubovány přes noc při 4 stupních s primárními protilátkami morčete anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C) a králičí anti -zelený FL fluorescenční protein (GFP; 1:500, Abcam, ab290). Po propláchnutí TBS-T se sekundární protilátky konjugované s FL fluoroforem oslí anti-morčecí IgG AF594-konjugovaná protilátka (JacksonImmunoResearch, 706-585-148) a oslí anti-králičí IgG AF488-konjugovaná protilátka ( Invitrogen, A21206). Snímky byly pořízeny pomocí fluorescenčního mikroskopu Zeiss 2 stop, AxioCam HRccamera a softwaru Axiovision 4.3.
Pro formalín fixovaný v parafínu (FFPE)ledvinyřezy (3 mm) byly zbaveny parafinu a hydratovány a získání antigenu bylo provedeno v zahřátém citrátovém pufru (pH 6). Řezy byly poté permeabilizovány Tritonem 0,1 procenta (Euromedex) a blokovány v TBS-T 3% hovězím sérovém albuminu před inkubací přes noc při 4 C. Použili jsme kozí anti-nefrin (1:100, PROGEN, GP -N2), morče anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C), králičí anti-GFP (1:1000, Abcam, ab290), kozí anti-Podokalyxin (PODXL; 1: 1000, Bio-Techne, AF-1556) a králičí protilátka proti Wilm's Tumor 1 (WT1;1:100, Abcam, ab192). Sekundárními protilátkami byly Alexa488– a Alexa 568–konjugované protilátky od společnosti Invitrogen. Jádra byla obarvena modře pomocí Hoechst. Sklíčka byla upevněna pomocí fluorescenčního montážního média (Dako, S3023). Mikrofotografie byly pořízeny fotomikroskopem Zeiss Axiophot a softwarem Axiovision. Poloautomatické kvantifikace na Fidži byly použity pro kvantifikaci nefrin-pozitivních a PODXLþ oblastí na glomerulární řez na alespoň 30 glomerulech na myš. Počet podocytů byl počítán jako počet WT1+ jader na glomerulární řez na alespoň 30 glomerulech na myš.
Postup transmisní elektronové mikroskopie
Malé kousky ledvinové kůry (1 mm3) byly fixovány v 3% glutaraldehydu (Electron Microscopy Sciences) po dobu 1 až 30 dnů a třikrát promyty v PBS. Vzorky byly postfixovány v 1 procentu oxidu osmičelého 0,1 M (Electron Microscopy Science) v 0,1 M PBS (pH 7,4) a promyty vodou. Vzorky byly dehydratovány v alkoholech a 100% propylenoxidu (Electron Microscopy Science). Infiltrace pryskyřice byla provedena následovně: míchat Epikote 812 a propylenoxid v poměru 1:1 po dobu 30 minut a následně míchat Epikote 812 a propylenoxid v poměru 1:2 při pokojové teplotě přes noc. Vzorky byly zality do 4mm želatinových kapslí ve 100% Epikote 812 a polymerovány v peci vyhřáté na 60 C. Ultratenké řezy byly nařezány ultramikrotomem UFC7 (Leica MicrosystemsGmbH) a umístěny na Gilder Grids 200 mesh (Electron Microscopy Science). Byly kontrastně obarveny acetátem uranylu 7 procent (LFG Distribution) a Reynoldovým olovnatým citrátem (LFG). Vzorky byly zkoumány v transmisním elektronovém mikroskopu JEM1011 (JEOL) s CCD kamerou Orius SC1000 (Gatan), provozovanou se softwarem Digital Micrograph (Gatan) pro získání.
Cistanche-nemoc ledvin
Pole kvantitativní polymerázové řetězové reakce
Čerstvě izolované glomeruly byly zmraženy v reagencii QIAzol Lysis (Qiagen) na -80 stupeň. Celková extrakce RNA metodou na bázi fenolu byla zpracována podle doporučení výrobce. cDNA byly syntetizovány pomocí RT2 First Strand Kit (Qiagen, 330401) a polymerázová řetězová reakce v reálném čase (PCR) byla provedena pomocí Custom RT2 Profiler PCR Array (Qiagen, CLAM36771C) s RT2 SYBR Green qPCR Mastermix (Qiagen, 330502) . Kvantitativní PCR destičky byly spuštěny na cykléru Applied Biosystems StepOnePlus. Každé pole obsahuje kontrolu kvality pro účinnost reverzní transkripce a kontaminaci genomové DNA. Kvantitativní PCR analýza byla provedena pomocí metody 2-DDCT s pomocí GeneGlobe Data Analysis Center (www. Qiagen. com/shop/genes-and-pathways/data-analysis-center-overview-page) a vyjádřena jako Log2 násobek změny v genové expresi.
In silico proteomická analýza
In silico predikce místa štěpení calpainu byla provedena pomocí DeepCalpain (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php), GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org) a CaMPDB (http:// calpain.org/) online nástroje. Aminokyselinová sekvence myšího proteinu byla získána od Uniprot (https://www.uniprot.org). Výsledky jsou shrnuty v doplňkových tabulkách S1 a S2.
Statistické analýzy
Všechny grafy představují jednotlivé hodnoty a průměr ± SEM. Statistické analýzy byly provedeny pomocí softwaru GraphPad Prism, verze 9. Porovnání mezi těmito 2 skupinami bylo provedeno pomocí parametrického Studentského t-testu, když vzorky prošly Anderson-Darlingovým a D'Agostinovým testem normality a F testem na rovnost rozptylu. Jinak byl použit neparametrický Mann-Whitney test. Srovnání mezi více skupinami bylo provedeno pomocí 1-way nebo 2-way analýzy rozptylu následované vícenásobným srovnávacím testem se Simakovou korekcí. Hodnoty P < 0.05="" byly="" považovány="" za="" významné.*p="">< 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p=""><>
Obrázek 1|Hypertenze indukovaná angiotensinem II (AngII) D dietou s vysokým obsahem soli (HSD) inhibuje glomerulárníautofagie. (a–c) Imunofluorescence Podocalyxinu (PODXL; červená) a P62 (zelená) v glomerulech (a,a0 ) z myší divokého typu (WT), (b,b0) z WT myši po 6 týdnech AngII þ HSD a (c,c0 ) z myší Nphs2.cre Atg5lox/lox vykazující akumulaci P62 v podocytech během hypertenze a v podocytech specifických ATG{{1{{12 }}}}deficientní myši. Šipky označují P62þ bodů ve WT v (a0 ). Jádra byla kontrastně obarvena Hoechst (modrá). Dílčí části obrázku s prvočíslem označují vyšší zvětšení. Tyče=50 mm. (d) Související kvantifikace oblasti P62þ vyjádřená jako procento glomerulární oblasti. n=4 myší WT a n=5 WT s AngII þ HSD a myší Nphs2.cre Atg5lox/lox. Hodnoty jsou prezentovány jako jednotlivé grafy a průměr ± SEM. Mann-Whitney test: *P=0.0159. Chcete-li optimalizovat zobrazení tohoto obrázku, podívejte se na online verzi tohoto článku na adrese www.ledvina-international.org.
VÝSLEDEK
Hypertenze vyvolaná dietou s vysokým obsahem soli AngII D inhibovala autofagii podocytů
Podocyty představují vysokou hladinuautofagiein vivo, jak ukazuje silná exprese GFP u transgenních myší s fúzí GFP s LC3 (myši GFP-LC3), klíčovým markerem autofagie (doplňkový obrázek S2A). Autofagie je dynamický proces s neustálou tvorbou autofagozomů a degradací autofagolyzozomů. Blokování autofagozomální degradace chlorochinem vedlo k akumulaci bodů GFPþ, což naznačuje vysoký autofagický eflux v podocytech (doplňkové obrázky S2A a B). Potvrzení, že tečky GFPþ byly autofagozomy, bylo prokázáno dvojitou imuno-FL fluorescencí pro GFP a SQSTM1/P62, chaperonový protein degradovanýautofagie(Doplňkový obrázek S2C a D). Opět platí, že léčba chlorochinem indukovala akumulaci bodů GFP+ P62®, což prokázalo důležitý autofagický eflux v podocytech. Nakonec byl in vitro konzervován vysoký autofagický eflux, jak ukazuje exprese GFP a P62 v primárních podocytech izolovaných z myší GFP-LC3 a silná akumulace teček GFPþ a P62þ při léčbě bafilomycinem A1, dalším blokátorem autofagozomální degradace (doplňkový obrázek S2E–H) .
Schopnost hypertenze modulovat autofagické reakce podocytů byla poté hodnocena u myší infuzí AngII s dietou s vysokým obsahem soli (HSD) po dobu 6 týdnů a u nehypertenzních kontrol. Jak je znázorněno na obrázku 1, AngII + HSD indukoval akumulaci P62 v glomerulech se silnou akumulací v podocytech, což naznačuje, že AngII + HSD byl zodpovědný za podocyty.autofagieblokáda (obrázek 1a–d). Je zajímavé, že akumulace P62 v podocytech byla podobná té, která byla pozorována u myší s deficitem autofagie podocytů (myši Nphs2.cre Atg5lox/lox). V jiném modelu hypertenze, modelu DOC-sůl, jsme také pozorovali progresivní akumulaci P62 v podocytech v průběhu onemocnění (doplňkový obrázek S3).
Delece Atg5 specificky v podocytech vede ke zvýšené albuminurii, ztrátě podocytů a glomerulárnímu poškození v modelu AngII D HSD
Poté jsme zkoumali, zdaautofagieblokáda pouze u podocytů (myši Nphs2.cre Atg5lox/lox) ovlivňuje glomerulární poškození v modelu AngII þ HSD. Nejprve jsme potvrdili, že Nphs2. cre Atg5lox/lox myši měly normální krevní tlak, normálníledvinafunkce a žádné glomerulární histologické léze do 10 měsíců věku, jak bylo dříve hlášeno (doplňkový obrázek S4).32 Poté Atg5lox/lox (WT) a Nphs2. Myším cre Atg5lox/lox byla po dobu 6 týdnů podávána infuze AngII s HSD. Důležité je, že systolický krevní tlak byl podobný ve 2 skupinách po infuzi AngII v průběhu studie (obrázek 2a), ačkoli metoda manžety na ocasu použitá k měření krevního tlaku nemusela mít schopnost vyřešit malé rozdíly v krevním tlaku. Infuze AngII s HSD výrazně zvýšila poměr albuminu ke kreatininu v moči u myší WT a tento účinek byl dále významně zvýšen u myší Nphs2.cre Atg5lox/lox (obrázek 2b). Hypertenzní myši Nphs2.cre Atg5lox/lox také vykazovaly významně zvýšenou glomerulární sklerózu ve srovnání s WT sourozenci (obrázek 2c–e). V souladu s naměřenou proteinurií byly proteinové odlitky a tubulární dilatace významně častější u myší s deficitem podocytů v ATG5 (obrázek 2f–h).
Obrázek 2|Delece Atg5 specificky v podocytech vede k významnému zvýšení albuminurie,ledvinaporanění a ztráta podocytů po 6 týdnech infuze angiotensinu II (AngII) D s vysokým obsahem soli (HSD). (a) Systolický krevní tlak u myší Atg5lox/lox a Nphs2.cre Atg5lox/lox během 36 dnů AngII + HSD. n=9 myší na genotyp. Hodnoty jsou uvedeny jako průměr ± SEM. Dvoucestná analýza rozptylu (ANOVA): ns. U (b–m) n=10 myší na genotyp. V (b,g,h,k) jsou hodnoty prezentovány jako jednotlivé grafy a průměr ± SEM. (b) AngII þ HSD (pokračování)
Obrázek 2|(pokračování) vedlo k dramatickému zvýšení albuminurie v Nphs2. cre Atg5lox/lox myši ve srovnání s Atg5lox/lox kontrolními myšmi. Dvoucestná ANOVA: genotyp, P=0.013; čas, P=0.0018. (c–f) Reprezentativní snímky Massonových řezů glomerulů obarvených trichromem z kontroly Atg5lox/lox a myší Nphs2.cre Atg5lox/lox po 6 týdnech AngII + HSD. Pruhy=50 mm in (c,d). Pruhy=100 mm in (e,f). (g,h) Porovnání (g) podílu sklerotických glomerulů a (h) počtu tubulárních odlitků na mikroskopické pole. Mann-Whitney test: **P=0,0026 in (h), ***P=0,0003 in (g). (i,j) Reprezentativní imunofluorescenční snímky exprese Wilmova tumoru 1 (WT1; červená) a Podokalyxinu (PODXL; zelená) v glomerulech z kontroly Atg5lox/lox a myší Nphs2.cre Atg5lox/lox po AngII + HSD po dobu 6 týdnů. Jádra byla obarvena Hoechst (modrá). Tyče=50 mm. (k) Kvantifikace počtu buněk WT1þ na glomerulární řez. Mann-Whitney test: **P=0,0029 in (l,m). Reprezentativní imunofluorescenční snímky exprese CD44 (zelená) v glomerulech z kontroly Atg5lox/lox a myší Nphs2.cre Atg5lox/lox po AngII + HSD po dobu 6 týdnů. Jádra byla obarvena Hoechst (modrá). Tyče=50 mm. (n,o) Reprezentativní mikrofotografie řezů glomerulů z kontroly Atg5lox/lox a myší Nphs2.cre Atg5lox/lox z transmisní elektronové mikroskopie po AngII þ HSD po dobu 6 týdnů, ukazující vymazání procesu podocytů (šipky) u hypertenzních Nphs2. cre Atg5lox/lox myši. Tyče=1 mm. n=3 myší na genotyp. Chcete-li optimalizovat zobrazení tohoto obrázku, podívejte se na online verzi tohoto článku na www.kidney-international.org.
Obrázek 3|Exprese a aktivita kalpainu v podocytech. (a) Western blot analýza exprese calpainu-1, calpainu-2 a calpainu-4 v primárních podocytech. Exprese tubulinu slouží jako normalizace. (b) Aktivita kalpainu byla měřena na primárních podocytech ošetřených nebo neošetřených angiotensinem II (AngII; 100 nM) po dobu 24 hodin s nebo bez kalpeptinu (10 mM). n=5 nezávislých experimentů. Hodnoty jsou prezentovány jako jednotlivé grafy a průměr ± SEM. Jednosměrná analýza rozptylu (ANOVA): léčba, P=0.0035. Sidakův vícenásobný srovnávací test: *P=0.0128 pro AngII versus výchozí hodnota, ##P=0.0056 pro AngII + kalpeptin versus AngII. (c) Aktivita calpainu byla měřena na primárních podocytech divokého typu (WT) nebocalpastatintransgenní (CSTTg) myši ošetřené nebo neošetřené AngII (100 nM) po dobu 24 hodin. n =7 nezávislých experimentů. Hodnoty jsou prezentovány jako jednotlivé grafy a průměr ± SEM. Dvoucestná ANOVA spárovaná pro léčbu: genotyp, P=0.0483. Sidakův vícenásobný srovnávací test: ***P=0,0009 pro WT AngII versus výchozí hodnota, *P=0,0420 pro CSTTg AngII versus výchozí hodnota, #P=0,0424 pro WT versus CSTTg AngII. Chcete-li optimalizovat zobrazení tohoto obrázku, podívejte se na online verzi tohoto článku na adrese www.ledvina-international.org.
Počet podocytů na glomerulus byl významně snížen v Nphs2. cre Atg5lox/lox myši léčené AngII + HSD (obrázek 2i–k). Poškození podocytů u myší Nphs2.cre Atg5lox/lox s infuzí AngII + HSD dokonce progredovalo do fokální a segmentální glomerulosklerózy, jak ukazuje exprese aktivačního markeru parietálních epiteliálních buněk (PEC) CD44 v glomerulech (obrázek 2l a m). Analýza elektronovou mikroskopií identifikovala významné změny spojené s nedostatkem ATG5 po chronické infuzi AngII s HSD, včetně vymazání procesu nohy u hypertenzního Nphs2. cre Atg5lox/lox myši. Na rozdíl od toho bylo v podocytech z myší WT nalezeno několik ultrastrukturálních defektů i po 10 týdnech infuze AngII s HSD (obrázek 2n a o), což naznačuje, že autofagická aktivita podocytů je nutná pro jejich odolnost vůči poškození vyvolanému AngII + HSD. Celkově naše výsledky ukázaly, že v modelu AngII þ HSD,autofagieinhibice zhoršuje poškození a ztrátu podocytů a vyvolává následnou fokální a segmentální glomerulosklerózu.
AngII D HSD aktivuje aktivitu calpainu v podocytech, což přispívá k autofagické blokádě
Bylo zjištěno, že aktivita calpainu (i) je aktivována AngII v několika typech buněk a (ii) štěpí několikautofagieproteinů souvisejících s AngII, 53 nás zajímalo, zda by blokáda autofagie zprostředkovaná AngII + HSD mohla být přisouzena zvýšené aktivitě calpainu indukované AngII. Nejprve jsme zjistili, že primární podocyty exprimují 3 všudypřítomné formy calpainů (obrázek 3a). Poté jsme ukázali, že AngII stimuloval aktivitu calpainu v primárních podocytech. Toto zvýšení aktivity calpainu bylo blokováno selektivním inhibitorem calpainu (obrázek 3b). Použili jsme vyklepávací myš s přídavnýmicalpastatinexprese transgenu (vedoucí ke snížení aktivity calpainu)43 k posouzení role calpainů v AngII þ HSD zprostředkovanéledvinazranění a blokáda autofagie. Primární podocyty z myší CSTTg vykazovaly sníženou aktivitu calpainu v reakci na AngII ve srovnání s podocyty z kontrolních myší (obrázek 3c). Tím pádem,calpastatinnadměrná exprese v podocytech snížila aktivaci calpainu zprostředkovanou AngII.
Dále jsme hodnotiliautofagiehladiny v podocytech od CSTTg myší. Vytvořili jsme myši CSTTg s transgenem GFP-LC3. Reportér LC3-GFP umožnil počítání autofagozomů jako teček GFPþ/P62þ. P62 se bude akumulovat v agregátech v buňkách, když je blokován autofagický eflux. V bazálním stavu jsme v podocytech CSTTg GFP-LC3 myší napočítali méně GFPþ P62þ teček (obrázek 4a, b a e) a menší akumulaci P62 (obrázek 4c, d a f) než v podocytech normálních GFP-LC3 myší. , což naznačuje zvýšený autofagický eflux v podocytech myší s vysokou abundancí calpastatinu.
Obrázek 4|Hodnocení autofagického efluxu v podocytechcalpastatintransgenní (CSTTg) myši. (a,b) Reprezentativní imunofluorescenční snímky exprese zeleného fluorescenčního proteinu FL (GFP) (zelená) a P62 (červená) v glomerulech od 12-týdenních myší GFP-LC3 a CSTTg GFP-LC3. Šipky označují autofagozomy GFPþ P62þ. (c,d) Reprezentativní imunofluorescenční snímky exprese P62 (zelená) a Podokalyxinu (PODXL; červená) v glomerulech od 12-týdenních myší GFP-LC3 a CSTTg GFP-LC3. Dílčí části obrázku s prvočíslem označují vyšší zvětšení. Jádra byla obarvena Hoechst (modrá). Tyče=50 mm. (e) Kvantifikace počtu LC3þ P62þ teček na podocyt. Mann-Whitney test: **P= 0.0065. (f) Kvantifikace plochy P62þ na glomerulární řez. Mann-Whitney test: *P=0.0420. U (e,f) n=5 myší GFP-LC3 a n=8 myší CSTTg GFP-LC3. Hodnoty jsou prezentovány jako jednotlivé grafy a průměr ± SEM. Chcete-li optimalizovat zobrazení tohoto obrázku, podívejte se na online verzi tohoto článku na adrese www.ledvina-international.org.
Autofagický eflux lze monitorovat měřením konverze cytoplazmatické formy LC3, LC3-I, na autofagozomálně štěpenou a fosfatidylethanolaminem spojenou formu LC3, LC3-II, na Western blotu . Podocyty z myší CSTTg vykazovaly zvýšenou konverzi LC3-I na LC3-II a sníženou expresi P62, a to jak v přítomnosti, tak v nepřítomnosti bafilomycinu A1 (obrázek 5a a b), což ukazuje na zvýšený autofagický eflux v podocyty s nadměrnou expresí kalpastatinu. Konečně, akumulace bodů GFP+ P62þ v podocytech po podání chlorochinu byla důležitější u myší CSTTg GFP-LC3 než u myší GFP-LC3, což potvrzuje, žecalpastatinnadměrná exprese indukuje autofagický eflux v podocytech in vivo (obrázek 5c–e). Celkově naše data naznačují, že AngII stimuluje aktivitu calpainu v podocytech, žeautofagieje inhibován calpainem v podocytech a že inhibice endogenní aktivity calpainu nadměrnou expresí calpastatinu je dostatečná ke stimulaci autofagického efluxu v podocytech.
Myši CSTTg jsou chráněny před poškozením podocytů vyvolaným AngII D HSD
CSTTg myši nevykazovaly žádnéledvinazměna do věku alespoň 12 měsíců (doplňkový obrázek S5). Analyzovali jsme poškození podocytů u myší CSTTg během léčby AngII + HSD. Ačkoli se u WT myší po 4 týdnech hypertenze vyvinula mírná glomeruloskleróza a poškození podocytů, jak ukazuje abnormální exprese podokalyxinu a nefrinu, myši CSTTg vykazovaly méně sklerotických glomerulárních lézí (obrázek 6a a b) a zachovaly expresi podokalyxinu a nefrinu (obrázek 6c–h) . Takové rozdíly ve fenotypu podocytů byly pozorovány ve fázi, kdy se hustota podocytových jader nelišila mezi WT a hypertenzními CSTTg myšmi (obrázek 6i–k).
Obrázek 5|Blokování autofagozomální degradace potvrdilo zvýšený autofagický eflux podocytů vcalpastatintransgenní (CSTTg) myši. (a) Western blot analýza exprese LC3, sekvestozomu 1 (SQSTM1)/P62 a ATG5 v primárních podocytech z myší divokého typu (WT) nebo CSTTg. Exprese tubulinu slouží jako normalizace. Podocyty byly nebo nebyly ošetřeny bafilomycinem A1 (BafA1; 100 nM) po dobu 4 hodin před zastavením kultivace. (b) Kvantifikace poměrů LC{{10}}II/tubulin a P62/tubulin. n=10 myší WT a n{13}} myší CSTTg. Hodnoty jsou prezentovány jako jednotlivé grafy a průměr ± SEM. Obousměrná analýza rozptylu spárované pro léčbu: pro LC3-II/tubulin: genotyp, P=0.{{30}}008; ošetření, P < 0,0001;="" pro="" p62/tubulin:="" genotyp,="" p="0.0884;" ošetření,="" p="">< 0,0001.="" sidakův="" vícenásobný="" srovnávací="" test:="" pro="" lc3-ii/tubulin:="" ***p="">< 0,0001="" pro="" wt="" plus="" bafa1="" versus="" wt="" þ="" bafa1,="" ***p="">< 0,0001="" pro="" csttg="" plus="" bafa1="" versus="" csttg="" þ="" bafa1,="" ##p{="" {34}}.0028="" pro="" wt="" þ="" bafa1="" versus="" csttg="" þ="" bafa1;="" pro="" p62/tubulin:="" ***p="">< 0,0001="" pro="" wt="" plus="" bafa1="" versus="" wt="" +="" bafa1,="" ***p="">< 0,0001="" pro="" csttg="" plus="" bafa1="" versus="" csttg="" +="" bafa1.="" (c,d)="" reprezentativní="" imunofluorescenční="" snímky="" exprese="" zeleného="" fluorescenčního="" proteinu="" fl="" (gfp;="" zelená)="" a="" p62="" (červená)="" v="" glomerulech="" od="" 12-="" týden="" starých="" myší="" gfp-lc3="" a="" csttg="" gfp-lc3.="" dílčí="" části="" obrázku="" s="" prvočíslem="" označují="" vyšší="" zvětšení.="" jádra="" byla="" obarvena="" hoechst="" (modrá).="" tyče="50" mm.="" myši="" byly="" ošetřeny="" chlorochinem="" (cq;="" 80="" mg/kg)="" 4="" hodiny="" před="" usmrcením.="" šipky="" označují="" autofagozomy="" gfpþ="" p62þ.="" (e)="" kvantifikace="" počtu="" lc3þ="" p62þ="" teček="" na="" podocyt.="" n="5" myší="" na="" genotyp.="" hodnoty="" jsou="" prezentovány="" jako="" jednotlivé="" grafy="" a="" střední="">±SEM. Nespárovaný t-test se stejnou SD: *P=0.0302. Chcete-li optimalizovat zobrazení tohoto obrázku, podívejte se na online verzi tohoto článku na adrese www.ledvina-international.org.
Obrázek 6 |calpastatinnadměrná exprese zabraňuje poškození podocytů zprostředkovanému angiotensinem II (AngII) D dietou s vysokým obsahem soli (HSD). (a, b) Reprezentativní snímky Massonových trichromem obarvených řezů glomerulů z myší divokého typu (WT) a calpastatinových transgenních (CSTTg) myší po 6 týdnech AngII + HSD. Pruhy=50 mm. (c,d,f,g) Reprezentativní imunofluorescenční snímky exprese (c,d) podokalyxinu (PODXL) a (f,g) nefrinu (NPHS1) u myší WT a CSTTg po 6 týdnech AngII + HSD a (e ,h) související kvantifikace. Pruhy=50 mm. (i,j) Reprezentativní imunofluorescenční snímky exprese Wilmova tumoru 1 (WT1; zelená) a PODXL (červená) v glomerulech od myší WT a CSTTg po 6 týdnech AngII + HSD a (k) související kvantifikace počtu WT1þ buněk na glomerulární sekci. Jádra byla obarvena Hoechst (modrá). Pruhy=50 mm. V (e,h,k) jsou hodnoty prezentovány jako jednotlivé grafy a průměr ± SEM. n=9 myší WT a n{13}} myší CSTTg. Nepárový t-test se stejnou SD: **P=0,0095 in (e), *P=0,0249 in (h), P=0,7891 in (k). Chcete-li optimalizovat zobrazení tohoto obrázku, podívejte se na online verzi tohoto článku na adrese www.ledvina-international.org.
Podobně po 6 týdnech hypertenze vykazovaly myši GFP-LC3 a CSTTg GFP-LC3 poškození podocytů, ale léze byly výraznější u myší GFP-LC3 (obrázek 7). Poměr albuminu a kreatininu v moči byl vyšší u myší GFP-LC3 po 4 týdnech AngII + HSD (obrázek 7a). Počet podocytů se mezi těmito 2 genotypy nelišil, ale exprese nefrinu byla významně více snížena u GFP-LC3 (kontrolní) myší (obrázek 7b–e). Korelující scalpastatin- zprostředkovaná ochrana, ultrastrukturální analýza ukázala mírné a fokální vymazání výběžků podocytů u myší GFP-LC3 léčených AngII + HSD s lepším zachováním vymazání výběžků nohy u myší CSTTg, ačkoli globální kvantifikace počtu výběžků nohy na glomerulární baze délka membrány (GBM) nebyla statisticky odlišná, s největší pravděpodobností proto, že poškození podocytů je v našem modelu fokální a segmentální (obrázek 7f–h). Za zmínku stojí makrofágy a infiltrace T-lymfocytů vledvinyse mezi skupinami nelišily (doplňkový obrázek S6). Dohromady to tyto výsledky prokázalycalpastatinzabránila poškození podocytů indukovaného AngII þ HSD.
Nadměrná exprese calpastatinu obnovuje autofagický eflux v podocytech z myší po léčbě AngII D HSD
Nakonec nás zajímalo, zdacalpastatin- zprostředkovaná glomerulární ochrana v modelu AngII + HSD implikovala udržování autofagie v podocytech. Je zajímavé, že akumulaci P62 v podocytech indukovanou AngII + HSD bylo zabráněno u myší CSTTg a GFP-LC3 CSTTg (obrázek 8a–d), což naznačuje, že calpastatin zabránil blokádě podocytůautofagie. Je třeba poznamenat, že počet GFPþ P62þ teček značení autofagozomů byl podobný u podocytů z hypertenzních GFP-LC3 a GFP-LC3 CSTTg myší, což naznačuje, že AngII + HSD vyvolalo zpomalení autofagického efluxu podocytů spíše než úplné zastavení (obrázek 8e– G).
In silico predikce místa štěpení kalpainu v podocytových proteinech
Použili jsme několik nástrojů in silico k predikci potenciálních cílů calpainu v podocytech (doplňkové tabulky S1 a S2). Byly porovnány tři online databáze: GPS-CCD,54 CaMPDB,55 a DeepCalpain.56 Analýza In silico identifikovala několik podocytových proteinů, mezi nimi nefrin a podocin, které by mohly být štěpeny kalpainy. Tím pádem,calpastatin- zprostředkovaná glomerulární ochrana by mohla být spojena se snížením enzymatické aktivity calpainu, což vede ke snížené degradaci některých proteinů podocytů.
Dále minimálně 3autofagieproteiny příbuzné jsou přímým cílem calpainů. ATG5 je štěpen calpainy, což vede k narušení tvorby komplexu ATG12-ATG5.57,58 Podávání inhibitorů calpainu in vivo také zabránilo štěpení autofagického proteinu Beclin-1.59 Analýza in silico domnělé místo štěpení na proteinech souvisejících s autofagií podporuje hypotézu, že calpain by mohl regulovat autofagii prostřednictvím enzymatického štěpení autofagií proteinů.
Cistanche-funkce ledvin
mRNA exprese endoplazmatického retikula (ER) a markerů oxidačního stresu v glomerulech z myší léčených AngII plus HSD
Hodnotili jsme stres endoplazmatického retikula (ER) a oxidační stres pomocí kvantitativní PCR v glomerulech během léčby AngII þ HSD (Tabulka 1). Na začátku jsme nepozorovali žádnou změnu v expresi mRNA analyzovaných genů v glomerulech z myší WT a Nphs2.cre Atg5lox/lox (doplňkový obrázek S7). Po 6 týdnech hypertenze glomeruly z Nphs2. Myši cre Atg5lox/lox vykazovaly odlišný profil mRNA genů drah ER stresu a oxidačního stresu se zvýšenou expresí Sod1, Prdx1, Atf4, Gpx1 a Hsp90b1 ve srovnání s glomeruly WT, což naznačuje, žeautofagiedeplece v podocytech podporovala AngII þ HSD-indukovaný ER stres a oxidační stres. Naopak glomeruly z myší CSTTg vykazovaly downregulaci několika genů drah ER stresu a oxidačního stresu a také sníženou expresi některých proapoptotických genů (obrázek 9).
Dohromady tomu tyto výsledky naznačujícalpastatinnadměrná exprese by mohla zabránit glomerulárnímu poškození snížením AngII þ HSD-indukovaného ER a oxidačního stresu.
DISKUSE
V této studii jsme prokázali, že u AngII þ HSD-indukované hypertenze je autofagie podocytů výrazně downregulována. Navíc myši s podocytově specifickou delecí Atg5 byly náchylnější k AngII + HSD-indukované glomeruloskleróze a ztrátě podocytů, což ukazuje, žeautofagiev podocytech zabraňuje rozvoji hypertenzní nefropatie, což zdůrazňuje kritickou roli autofagie v poškození podocytů indukovaném AngII þ HSD. Málo je známo o extracelulárních stimulech, které regulují buněčnou autofagii, a tyto výsledky vrhají světlo na patofyziologickou regulaci autofagie podocytů pomocí AngII.
U většiny lidských glomerulopatií je vymazání podocytového výběžku charakteristickým znakem glomerulárního poškození vedoucího k proteinurii. Autofagie pravděpodobně hraje zásadní roli při udržování funkce podocytů, protože tyto terminálně diferencované buňky vykazují vysokou míruautofagiei bez stresu. Předchozí studie ukázala, že AngII podporuje autofagii prostřednictvím generování reaktivních forem kyslíku v podmíněně imortalizované buněčné linii myších podocytů.60 Produkce reaktivních forem kyslíku je skutečně obecným induktorem autofagie u mnoha typů buněk a důvody pro takový rozpor s našimi zjištěními jsou nejasný. Na rozdíl od této poslední studie jsme použili myší primárně kultivované podocyty zachovávající expresi podocinu a nefrinu a in vivo přístupy a nikoli myší buněčné linie. Potvrzujeme předchozí zprávy, že postmitotické podocyty vykazují neobvykle vysokou úroveň konstitutivníautofagie. Měření zvýšeného množství LC3-II po stimulaci AngII v přítomnosti nebo nepřítomnosti lysozomálních inhibitorů je nezbytné k určení, zda je autofagický eflux zvýšen nebo blokován. Předchozí studie tento fenomén opomíjely.60
Obrázek 7 |calpastatinnadměrná exprese zabraňuje poškození podocytů zprostředkovanému angiotensinem II (AngII) D dietou s vysokým obsahem soli (HSD) u myší se zeleným FL fluorescenčním proteinem (GFP) – LC3. (a) AngII + HSD vedly k dramatickému zvýšení albuminurie u GFP-LC3 myší ve srovnání s CSTTg (kalpastatin transgenní) GFP-LC3 myší. n=8 až 13 myší na genotyp. Hodnoty jsou prezentovány jako jednotlivé grafy a průměr ± SEM. Dvoucestná analýza rozptylu: genotyp, P=0.0429; čas, P=0.0165. Sidakův vícenásobný srovnávací test: *P=0.0453 pro GFP-LC3 versus CSTTg GFP-LC3 myši v den 28. (b,c) Reprezentativní imunofluorescenční snímky exprese Wilmova nádoru 1 (WT1; zelená) a nefrinu (NPHS1) (červená) v glomerulech od 18-týdenních myší GFP-LC3 a CSTTg GFP-LC3 po 6 týdnech infuze AngII + HSD. Jádra byla obarvena Hoechst (modrá). Tyče=50 mm. Kvantifikace (d) plochy NPHS1þ na glomerulární sekci a (e) počtu WT1þ buněk na glomerulární sekci u 18-týdenních myší GFP-LC3 a CSTTg GFP-LC3 po 6 týdnech infuze AngII + HSD. n=19 myší GFP-LC3 a n=25 myší CSTTg GFP-LC3. Hodnoty jsou prezentovány jako jednotlivé grafy a průměr ± SEM. Nepárový t-test se stejnou SD: **P=0.0010 v (d), P= 0.1158 v (e). (f,g) Snímky glomerulů z myší GFP-LC3 a CSTTg GFP-LC3 z transmisní elektronové mikroskopie po 6 týdnech AngII + HSD. Šipky označují proces vymazání chodidla. Tyče=1 mm. (h) Kvantifikace počtu procesů chodidla na mikrometr glomerulární bazální membrány (GBM). n=3 myší na genotyp. Hodnoty jsou prezentovány jako jednotlivé grafy a střední SEM. Každý graf představuje průměrný počet podocytů na mikrometr GBM na 1 souvislou délku GBM. Nepárový t-test se stejnou SD: P=0.7512. Chcete-li optimalizovat zobrazení tohoto obrázku, podívejte se na online verzi tohoto článku na adrese www.ledvina-international.org.
Zde jsme použili hypertenzní model založený na AngII perfuzi a HSD. Podocyty vykazují AT1 receptory a jsou vystaveny volně filtrovaným peptidům, jako je AngII.13,16,26,61–65 Předpokládá se, že pozorované renoprotektivní účinky inhibice RAAS by mohly být – alespoň částečně – způsobeny blokádou těchto podocytů. konkrétní RAAS. Podobně studie in vivo potvrdily účinek AngII na poškození podocytů a cílení genu AT1 specifického pro podocyty prokázalo, že aktivace receptorů AT1 v glomerulu u experimentální lupusové nefritidy je dostatečná k urychleníledvinaporanění v nepřítomnosti hypertenze.66,67 Calpainem zprostředkovanéautofagiedysregulace v našem modelu by mohla být spojena s přímou signalizací AngII-AT1 na podocytech nebo by mohla být důsledkem hypertenze. Na tuto otázku můžeme poskytnout brzkou odpověď. V modelu DOC-sůl jsme také našli akumulaci P62 v podocytech hypertenzních myší (doplňkový obrázek S3). To naznačuje, že v tomto modelu dochází v podocytech k autofagické blokádě, která má být nezávislá na AngII.68 Další studie hodnotící poškození podocytů související s aktivitou calpainu a autofagickým efluxem u myší s deficitem AT1 v podocytech selektivně by bylo nutné vymezit, zda taková regulace Autofagie podocytů závisí na přímých nebo nepřímých účincích AngII.
Obrázek 8 |calpastatinnadměrná exprese zabraňuje indukci angiotensinu II (AngII) D dietou s vysokým obsahem soli (HSD).autofagiedownregulace v podocytech. (a,b) Reprezentativní imunofluorescenční snímky exprese P62 (zelená) a Podokalyxinu (PODXL; červená) v glomerulech ze zeleného fluorescenčního proteinu FL (GFP) – LC3 a CSTTg (calpastatintransgenní) myši GFP-LC3 po 6 týdnech AngII + HSD. Dílčí části obrázku s prvočíslem označují vyšší zvětšení. Jádra byla obarvena Hoechst (modrá). Pruhy=50 mm. (c,d) Kvantifikace plochy P62þ na glomerulární řez. n=9 myší divokého typu (WT) a n=7 myší CSTTg v (c) a n=16 myší GFP-LC3 a n=16 myší CSTTg GFP-LC3 v (d). Hodnoty jsou prezentovány jako jednotlivé grafy a průměr ± SEM. Mann-Whitney test: **P=0,0033 v (c), **P=0,0011 v (d). (e, f) Reprezentativní imunofluorescenční snímky exprese GFP (zelená) a P62 (červená) v glomerulech z myší GFP-LC3 a CSTTg GFP-LC3 po 6 týdnech AngII + HSD. Dílčí části obrázku s prvočíslem označují vyšší zvětšení. Šipky označují autofagozomy GFPþ P62þ. (g) Kvantifikace počtu LC3þ P62þ teček na podocyt. n=11 myší GFP-LC3 a n=16 myší CSTTg GFP-LC3. Hodnoty jsou prezentovány jako jednotlivé grafy a průměr ± SEM. Nepárový t-test se stejnou SD: P=0.1014. Chcete-li optimalizovat zobrazení tohoto obrázku, podívejte se na online verzi tohoto článku na adrese www.ledvina-international.org.
Tabulka 1|Vlastní RT2 Profiler PCR Array
Calpain-1 a calpain{1}} jsou všudypřítomné prozánětlivé proteázy, jejichž aktivita je řízenacalpastatin, jejich specifický inhibitor. Kalpastatin skutečně selektivně inhibuje calpainy a dosud žádné jiné proteázy. Aktivace Calpainu byla nedávno spojena sledvinaporanění v několika patologických kontextech.69,70 Bylo zjištěno, že kanál C6 přechodného potenciálu přenašeče kalciového kanálu aktivuje calpain-1 v podocytech prostřednictvím aktivace Ca2þ/kalcineurin. Ledviny pacientů s fokální a segmentální glomerulosklerózou měly zvýšenou expresi kanálu C6 přechodného receptorového potenciálu, zvýšenou aktivitu calpainu a kalcineurinu a sníženou expresi cílového talinu calpainu-1, který je kritický pro stabilitu cytoskeletu podocytů.71 Kanál přechodného potenciálu receptoru C6 se také přímo váže na calpain-1 a calpain-2. Tato interakce je klíčová pro regulaci štěpení talinu{11}} a kontrolu motility podocytů.72
Nadměrně exprimující transgenní myšicalpastatinjsou chráněni proti vaskulární remodelaci a AngII-dependentnímu zánětu73; proti zánětu u modelů glomerulonefritidy,43 sepse,74 nebo odmítnutí aloštěpu75; a proti zánětu souvisejícímu s věkem.76 Poškození podocytů u těchto myší nebylo prozkoumáno. Peltier a kol. ukázal, že nadměrné vyjádřenícalpastatinzabránil AngII-dependentnímu perivaskulárnímu zánětu v ledvinách.43 Ochrana ledvin u CSTTg myší by tedy mohla být zprostředkována, alespoň částečně, protizánětlivým mechanismem. Hodnotili jsme infiltraci makrofágů a lymfocytů v našem modelu a nenašli jsme žádný významný rozdílledvinazánět mezi CSTTg a kontrolními myšmi při analýze globálníledvinainfiltrace leukocytů (doplňkový obrázek S6).
Calpain se nedávno podílel na regulaci autofagie (nedávno přezkoumaný ve Weber et al.53) se zajímavými a bioprotektivními vlastnostmi inhibice calpainu v diabetickém kontextu prostřednictvím obnoveníautofagie.77 Zde jsme uvedli, že inhibice calpainu prostřednictvímcalpastatinnadměrná exprese (i) zabránila poškození podocytů během hypertenze a (ii) obnovila autofagii v podocytech, čímž se zdůrazňuje nová škodlivá úloha aktivace calpainu během hypertenze prostřednictvím inhibiceautofagie.
Bylo prokázáno, že téměř všechny proteiny ATG jsou štěpeny calpainy in vitro. 78 Zde jsme to předpokládaliautofagieudržování u hypertenzních CSTTg myší bylo zprostředkováno inhibicí kalpainu. Abychom podpořili naši hypotézu, ukázali jsme, že podocyty z CSTTg mají sníženou aktivitu calpainu, když jsou vystaveny AngII in vitro (obrázek 3c). Zjistili jsme zvýšenou hladinu proteinu ATG5 v podocytech z myší CSTTg, což naznačuje, že nadměrná exprese kalpastatinu v tomto kontextu zabránila štěpení ATG5 zprostředkovanému kalpainem (obrázek 5a). Naproti tomu bylo prokázáno, žecalpastatin-zprostředkovaná inhibice calpainu by mohla být nezávislá na inhibici jejich proteázové aktivity79; nemohli jsme tedy vyloučit regulaci autofagie calpastatinem nezávislou na enzymatické aktivitě calpainu.
Stručně řečeno, tato zjištění odhalila dříve nepoznanou rolicalpastatinv regulaci podocytůautofagiea poskytly vodítko pro výzkum nových terapeutických strategií pro zvýšení přežití podocytů během hypertenzních nefropatií.
ZVEŘEJNĚNÍ
Všichni autoři deklarovali žádné konkurenční zájmy.
PODĚKOVÁNÍ
Tato práce byla podporována Institut National de la Santé Et de la recherche Médicale (Inserm) a Université de Paris. IB byla podporována absolventským stipendiem z Ministère de l'EducationNationale, de la Recherche et de la Technologie. OL byl financován prostřednictvím ceny Evropské nadace pro studium diabetu (EFSD) podporované programem EFSD/Novo Nordisk pro výzkum diabetu v Evropě a grantem Société Francophone duDiabète (SFD). BR a CH byly financovány Starting Grantem 107037 od Evropské výzkumné rady a Evropské unie (P-LT). YS byl podpořen absolventským stipendiem z Fondation de France.
Děkujeme Elizabeth Huc, Nicolas Perez, Corina Suldac a týmu ERIU970 (Université de Paris, PARCC, Inserm, Paříž, Francie) za pomoc při péči o zvířata a manipulaci, Nicolas Sorhaindo za biochemická měření (ICB-IFR2, Laboratoire de Biochimie, Hôpital Bichat , Paříž, Francie) a Alain Schmitt a Jean-Marc Massefor transmisní elektronová mikroskopie (Institut Cochin, Paříž, Francie). Děkujeme Morgane Le Gall (Cochin proteomické zařízení 3P5, Paříž, Francie) za pomoc při analýze silico. Uznáváme administrativní podporu od Véronique Oberweis, Bruno Pillard a Cyrille Mahieux (Université de Paris, PARCC, Inserm, Paříž, Francie).
DOPLŇKOVÝ MATERIÁL
Doplňkový soubor (PDF)
Obrázek S1. Primární podocytární kultura exprimuje podocytové markery. Western blot analýza exprese podocytových markerů NPHS1 a NPHS2 v primární kultuře podocytů od WT a CSTTg myší. Tubulin (TUBA) slouží jako kontrola plnění. Zástupce n=4 myší na genotyp.
Obrázek S2. Vysoká bazální hladina podocytůautofagie. (A, B) Reprezentativní imunofluorescenční snímky exprese GFP (zelená) a NPHS1 (červená) v glomerulech z myší GFP-LC3 léčených nebo neléčených CQ (80mg/kg) 4 hodiny před usmrcením. Šipky ukazují autofagozomy GFPþ. (C,D) Reprezentativní imunofluorescenční snímky exprese GFP (zelená) a P62 (červená) v glomerulech z myší GFP-LC3 léčených nebo neléčených CQ (80 mg/kg) 4 hodiny před usmrcením. Šipky ukazují GFPþ P62þ autofagozomy. (A–D) (0 ) představují vyšší zvětšení. Jádra byla obarvena Hoechst (modrá). Tyč=50 mm. N=4 myší na stav (E–H) Reprezentativní imunofluorescenční snímky exprese GFP (zelená) a P62 (červená) v primárních podocytech od myší GFP-LC3 léčených (F, H) nebo neléčených (E, G Bafifilomycin A1 (100 nM) po dobu 4 hodin. N=5 myší na stav.
Obrázek S3. P62 se akumuluje v podocytech v DOC-solném modelu hypertenze. (A–C) Reprezentativní imunofluorescenční snímky exprese P62 (zelená) a PODXL (červená) v glomerulech z myší WT po 2 až 6 týdnech modelu DOC-sůl. (0 ) představují větší zvětšení. Jádra byla obarvena Hoechst (modrá). Tyč ¼ 50 mm. (D) Kvantifikace plochy P62 na plochu podocytu (v procentech). N=5–6 myší na stav. Jednosměrná analýza rozptylu: čas P=0.0059, Sidakův vícenásobný srovnávací test: D42 versus D14 **P=0.0055, D28 versus D14 P=0.8590.
Obrázek S4. Podocytautofagieje postradatelný pro vývoj podocytů. (A) Systolický krevní tlak, (B) poměr albuminu ke kreatininu v moči a (C) hladiny dusíku močoviny v krvi u myší Atg5lox/lox a Nphs2.cre Atg5lox/lox. N=5–6 myší na genotyp. Hodnoty jsou prezentovány jako jednotlivé grafy a průměry±SEM. Mann-Whitney test: P=0.7273 (A), P=0.4286 (B) a P=0.6623 (C). (D–E) Reprezentativní snímky Massonových trichromem obarvených řezů glomerulů z myší Atg5lox/lox a Nphs2.cre Atg5lox/lox. (F–G) Reprezentativní imunofluorescenční snímky exprese PODXL (zelená) a WT1 (červená) u myší Atg5lox/lox a Nphs2.cre Atg5lox/lox. Jádra byla obarvena Hoechst (modrá). (D–G) Tyč=50 mm. N ¼ 6 myší na genotyp. (H–I) Reprezentativní mikrofotografie řezů glomerulů z transmisní elektronové mikroskopie z myší Atg5lox/lox a Nphs2.cre Atg5lox/lox. Tyč=1 mm. N=3 myší na genotyp.
Obrázek S5.calpastatinnadměrná exprese neovlivňujeledvinafungovat na základní linii. (A) hladiny močovinového dusíku v krvi a (B) hladiny albuminu v plazmě u 12-týdenních myší GFP-LC3 a CSTTg GFP-LC3. N=5 GFP-LC3 a N=6 CSTTg GFP-LC3. Hodnoty jsou prezentovány jako jednotlivé grafy a průměry±SEM. Mann-Whitney test: P=0.6623 (A) a P=0.9307 (B). (C, D) Reprezentativní obrázky Massonových trichromem obarvených řezů glomerulů z myší GFP-LC3 a CSTTg GFP-LC3. (E–H) Reprezentativní imunofluorescenční snímky exprese PODXL (E, F) a NPHS1 (G, H) u myší GFP-LC3 a CSTTg GFP-LC3. (C–H) Tyč=50 mm. (I, J) Přidružená kvantifikace PODXL a NPHS1 plochy na glomerulární řez. N=5 GFP-LC3 a N=6 CSTTg GFP-LC3. Hodnoty jsou prezentovány jako jednotlivé grafy a průměry±SEM. Mann-Whitney test: P=0.1898 (A) a P=0.8413 (B).
Cistanche-funkce ledvin
Obrázek S6.calpastatinnadměrná exprese neovlivňuje globální zánět ledvin. Reprezentativní imunohistochemie exprese F4/80 (A, B) a CD3 (D–E) u myší GFP-LC3 a CSTTg GFP-LC3 po 6 týdnech podávání angiotensinu II +HSD. Pruh=200 mm. (C, F) Přidružená kvantifikace plochy F4/80 a CD3 na perledvinasekce. N=7 myší CSTTg GFP-LC3 a N=8 GFP-LC3. Hodnoty jsou prezentovány jako jednotlivé grafy a průměry SEM. Mann-Whitney test: P=0.3969 (C) P= 0.3357 (F).
Obrázek S7. Podocytautofagiedeficiency does not induce ER stress or oxidative stress in young adults at baseline. qPCR analysis of the mRNA expression of genes of the ER stress, oxidative stress, and apoptosis pathway by Qiagen qPCR array in glomeruli from WT and Nphs2.cre Atg5lox/lox mice (A) and WT and CSTTg mice (B). N=4 mice per genotype. For Nox3, Ct >33.
Tabulka S1. In silico previze calpainových štěpných míst. Místa štěpení Calpainem byla předpovězena v proteinech souvisejících s podocyty a autofagií pomocí GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org), CaMPDB (HTTP:// calpain.org) a DeepCalpain Predict (http://deepcalpain. cancerbio. info/help.php). Doplňkový soubor (Excel)
Doplňková tabulka S2. Úplný soubor in silico prevision míst štěpení calpainem. Místa štěpení calpainem byla predikována u podocytů souvisejících aautofagieproteiny související s GPS-CCD (http://ccd. biocuckoo.org), CaMPDB (http://calpain.org) a DeepCalpain Predict (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php). Předpovědní místa štěpení jsou obnovena pro každý protein pro GPS-CCD a DeepCalpain Predict.
REFERENCE
1. Coresh J, Selvin E, Stevens LA a kol. Prevalence chronickýchledvinaonemocnění ve Spojených státech. JAMA. 2007;298:2038–2047.
2. Collins AJ, Vassalotti JA, Wang C, et al. Na koho by se měl zaměřit screening CKD? Vliv diabetu, hypertenze a kardiovaskulárních onemocnění. Am J Kidney Dis. 2009;53:S71–S77.
3. Chang TI, Li S, Chen SC, a kol. Rizikové faktory ESRD u jedinců se zachovanou odhadovanou GFR s albuminurií a bez ní: výsledky z programu Kidney Early Evaluation Program (KEEP). Am J Kidney Dis. 2013;61:S4–S11.
4. Hsu CY, McCulloch CE, Darbinian J, et al. Zvýšený krevní tlak a riziko konečného onemocnění ledvin u subjektů bez výchozího onemocnění ledvin. Arch Intern Med. 2005;165:923–928.
5. Nagase M, Shibata S, Yoshida S, a kol. Poškození podocytů je základem glomerulopatie Dahlových krys hypertenzních na sůl a je zvráceno blokátorem aldosteronu. Hypertenze. 2006;47:1084–1093.
6. Garovic VD, Wagner SJ, Turner ST, et al. Vylučování podocytů močí jako marker preeklampsie. Am J Obstet Gynecol. 2007;196, 320.e321–e327.
7. Craici IM, Wagner SJ, Bailey KR, et al. Podocyturie předchází proteinurii a klinické rysy preeklampsie: longitudinální prospektivní studie. Hypertenze. 2013;61:1289–1296.
8. Wang G, Lai FM, Kwan BC, a kol. Ztráta podocytů u lidské hypertenzní nefrosklerózy. Am J Hypertens. 2009;22:300–306.
9. Wang G, Kwan BC, Lai FM a kol. Intrarenální exprese miRNA u pacientů s hypertenzní nefrosklerózou. Am J Hypertens. 2010;23:78–84.
10. Ruggenenti P, Perna A, Gherardi G, et al. Chronické proteinurické nefropatie: výsledky a odpověď na léčbu v prospektivní kohortě 352 pacientů s různými typy poškození ledvin. Am J Kidney Dis. 2000;35:1155–1165.
11. Fukuda A, Wickman LT, Venkatareddy MP a kol. Trvalá ztráta podocytů z destabilizovaných glomerulů závislá na angiotenzinu II způsobuje progresi konečného stadialedvinachoroba. Kidney Int. 2012;81:40–55.
12. Tuncdemir M, Ozturk M. Účinky blokátorů receptoru angiotensinu-II na poškození podocytů a glomerulární apoptózu u potkaního modelu experimentální diabetické nefropatie vyvolané streptozotocinem. Acta Histochem. 2011;113:826–832.
13. Nijenhuis T, Sloan AJ, Hoenderop JG, et al. Angiotensin II přispívá k poškození podocytů zvýšením exprese TRPC6 prostřednictvím signální dráhy pozitivní zpětné vazby zprostředkované NFAT. Am J Pathol. 2011;179:1719–1732.
14. Studijní skupina EUCLID. Randomizovaná placebem kontrolovaná studie lisinoprilu u normotenzních pacientů s inzulín-dependentním diabetem a normoalbuminurií nebo mikroalbuminurií. Lanceta. 1997;349:1787–1792.
15. de Zeeuw D, Remuzzi G, Parving HH a kol. Proteinurie, cíl pro renoprotekci u pacientů s diabetickou nefropatií 2. typu: poučení z RENTALu. Kidney Int. 2004;65:2309–2320.
16. Benigni A, Gagliardini E, Remuzzi G. Změny v selektivitě glomerulární perm indukované angiotensinem II znamenají dysfunkci podocytů a přeuspořádání proteinu štěrbinové bránice. Semin Nephrol. 2004;24:131–140.
17. Wang L, Flannery PJ, Spurney RF. Charakterizace subtypů receptoru angiotenzinu II v podocytech. J Lab Clin Med. 2003;142:313–321.
18. Langham RG, Kelly DJ, Cox AJ a kol. Proteinurie a exprese proteinu diafragmy štěrbiny podocytů, nefrinu, u diabetické nefropatie: účinky inhibice enzymu konvertujícího angiotenzin. Diabetologie. 2002;45:1572–1576.
19. Nakamura T, Ushiyama C, Suzuki S, a kol. Účinky inhibitoru angiotenzin-konvertujícího enzymu, antagonisty receptoru angiotenzinu II a antagonisty vápníku na močové podocyty u pacientů s IgA nefropatií. Am J Nephrol. 2000;20:373–379.
20. Henger A, Huber T, Fischer KG a kol. Angiotensin II zvyšuje aktivitu cytosolického vápníku v podocytech potkanů v kultuře. Kidney Int. 1997;52: 687–693.
21. Praga M, Hernandez E, Montoyo C, a kol. Dlouhodobé příznivé účinky inhibice angiotenzin-konvertujícího enzymu u pacientů s nefrotickou proteinurií. Am J Kidney Dis. 1992;20:240–248.
22. Nitschke R, Henger A, Ricken S, a kol. Angiotensin II zvyšuje aktivitu intracelulárního vápníku v podocytech intaktního glomerulu.ledvinyInt. 2000;57:41–49.
23. Gloy J, Henger A, Fischer KG a kol. Angiotensin II moduluje buněčné funkce podocytů. Kidney Int Suppl. 1998;67:S168–S170.
24. Miceli I, Burt D, Taraba E, et al. Stretch snižuje expresi nefrinu prostřednictvím mechanismu závislého na angiotenzinu II-AT(1) v lidských podocytech: účinek rosiglitazonu. Am J Physiol Renální Physiol. 2010;298:F381–F390.
25. Endlich N, Endlich K. Natažení, napětí a adheze – adaptivní mechanismy aktinového cytoskeletu v podocytech. Eur J Cell Biol. 2006;85:229–234.
26. Durvasula RV, Petermann AT, Hiromura K, et al. Aktivace lokálního tkáňového angiotenzinového systému v podocytech mechanickým namáháním. Kidney Int. 2004;65:30–39.
27. Riser BL, Cortes P, Heilig C, a kol. Cyklická napínací síla selektivně up-reguluje transformující izoformy růstového faktoru-beta v kultivovaných krysích mezangiálních buňkách. Am J Pathol. 1996;148:1915–1923.
28. Kretzler M, Koeppen-Hagemann I, Kriz W. Poškození podocytů je kritickým krokem ve vývoji glomerulosklerózy u uni nefrektomizovaných-desoxykortikosteronových hypertenzních potkanů. Archiv Vircows. 1994;425:181–193.
29. Jung HS, Chung KW, Won Kim J a kol. Ztráta autofagie snižuje hmotnost a funkci pankreatických beta-buněk s následnou hyperglykémií. Cell Metab. 2008;8:318–324.
30. Ebato C, Uchida T, Arakawa M, et al.Autofagieje důležitý při homeostáze ostrůvků a kompenzačním zvýšení hmoty beta-buněk v reakci na dietu s vysokým obsahem tuků. Cell Metab. 2008;8:325–332.
31. Lenoir O, Jasiek M, Henique C, a kol. Autofagie endoteliálních buněk a podocytů synergicky chrání před glomerulosklerózou vyvolanou cukrovkou. Autofagie. 2015;11:1130–1145.
32. Hartleben B, Godel M, Meyer-Schwesinger C, a kol. Autofagie ovlivňuje náchylnost k glomerulárním onemocněním a udržuje homeostázu podocytů u stárnoucích myší. J Clin Invest. 2010;120:1084–1096.
33. Sato S, Kitamura H, Adachi A, et al. Dva typy autofagie v podocytech ve vzorcích renální biopsie: ultrastrukturální studie. J Submikrosc Cytol Pathol. 2006;38:167–174.
34. Asanuma K, Tanida I, Shirato I, et al. MAP-LC3, slibný autofagozomální marker, je zpracováván během diferenciace a obnovy podocytů z nefrózy PAN. FASEB J. 2003;17:1165–1167.
35. Mizushima N, Levine B, Cuervo AM, et al.Autofagiebojuje s nemocí prostřednictvím buněčného samotrávení. Příroda. 2008;451:1069–1075.
36. Yang L, Li P, Fu S, a kol. Defektní autofagie jater u obezity podporuje ER stres a způsobuje inzulínovou rezistenci. Cell Metab. 2010;11:467–478.
37. Xie Z, Klionsky DJ. Tvorba autofagosomů: jádro a adaptace. Nat Cell Biol. 2007;9:1102–1109.
38. Kume S, Thomas MC, Koya D. Snímání živin, autofagie a diabetická nefropatie. Diabetes. 2012;61:23–29.
39. Kume S, Uzu T, Maegawa H, et al. Autofagie: nový terapeutický cíl proledvinanemocí. Clin Exp Nephrol. 2012;16:827–832.
40. Huber TB, Edelstein CL, Hartleben B, et al. Vznikající roleautofagieve funkci ledvin, nemocech a stárnutí. Autofagie. 2012;8:1009–1031.
41. Weide T, Huber TB. Důsledky autofagie pro glomerulární stárnutí a onemocnění. Cell Tissue Res. 2011;343:467–473.
42. Bork T, Liang W, Yamahara K, et al. Podocyty si udržují vysoké bazální hladiny autofagie nezávislé na signalizaci mtor. Autofagie. 2020;16:1932–1948.
43. Peltier J, Bellocq A, Perez J, et al. Aktivace a sekrece calpainu podporuje glomerulární poškození u experimentální glomerulonefritidy: důkaz zcalpastatin-transgenní myši. J Am Soc Nephrol. 2006;17:3415–3423.
44. Moeller MJ, Sanden SK, Soofifi A, et al. Podocytově specifická exprese Cre rekombinázy u transgenních myší. Genesis. 2003;35:39–42.
45. Hara T, Nakamura K, Matsui M, et al. Potlačení bazální autofagie v nervových buňkách způsobuje neurodegenerativní onemocnění u myší. Příroda. 2006;441: 885–889.
46. Lazareth H, Henique C, Lenoir O, a kol. Tetraspanin CD9 řídí migraci a proliferaci parietálních epiteliálních buněk a progresi glomerulárního onemocnění. Nat Commun. 2019;10:3303.
47. Bollee G, Flamant M, Schordan S, a kol. Receptor epidermálního růstového faktoru podporuje glomerulární poškození a selhání ledvin u rychle progresivní srpkovité glomerulonefritidy. Nat Med. 2011;17:1242–1250.
48. Lenoir O, Milon M, Virsolvy A, et al. Přímé působení endotelinu-1 na podocyty podporuje diabetickou glomerulosklerózu. J Am Soc Nephrol. 2014;25:1050–1062.
49. Henique C, Bollee G, Lenoir O a kol. Erytroidní faktor 2 související s nukleárním faktorem 2- řídí podocytově specifickou expresi receptoru g aktivovaného peroxizomovým proliferátorem, který je nezbytný pro rezistenci vůči srpkovité GN. J Am Soc Nephrol. 2016;27:172–188.
50. Perez J, Dansou B, Herve R, a kol. Calpainy uvolňované T lymfocyty štěpí TLR2, aby kontrolovaly expresi IL-17. J Immunol. 2016;196:168–181.
51. Raimbourg Q, Perez J, Vandermeersch S, et al. Calpain/calpastatinsystém má protichůdné role v růstu a metastatickém šíření melanomu. PLoS One. 2013;8:e60469.
52. Letavernier B, Zafrani L, Nassar D, et al. Calpainy přispívají k vaskulární reparaci u rychle progresivní formy glomerulonefritidy: potenciální role jejich externalizace. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2012;32:335–342.
53. Weber JJ, Pereira Sena P, Singer E, et al. Zabití dvou rozhněvaných ptáků jednou ranou:autofagieaktivace inhibicí calpainů u neurodegenerativních onemocnění a mimo ně. Biomed Res Int. 2019;2019:4741252.
54. Liu Z, Cao J, Gao X a kol. GPS-CCD: nový výpočetní program pro predikci calpainových štěpných míst. PLoS One. 2011;6:e19001.
55. duVerle D, Takigawa I, Ono Y, et al. CaMPDB: zdroj pro calpain a modulační proteolýzu. Genom Inform. 2010;22:202–213.
56. Liu ZX, Yu K, Dong J, et al. Přesná předpověď calpainových štěpných míst a jejich odchylek způsobených mutacemi u rakoviny. Přední Genet. 2019; 10: 715.
57. Yousefifi S, Perozzo R, Schmid I, et al. Calpainem zprostředkované štěpení Atg5 přepíná autofagii na apoptózu. Nat Cell Biol. 2006;8:1124–1132.
58. Xia HG, Zhang L, Chen G a kol. Kontrola bazální autofagie pomocí calpain1 zprostředkovaného štěpení ATG5.Autofagie. 2010;6:61–66.
59. Russo R, Berliocchi L, Adornetto A, et al. Calpainem zprostředkované štěpení Beclin-1 a autofagická deregulace po ischemickém poškození sítnice in vivo. Cell Death Dis. 2011;2:e144.
60. Yadav A, Vallabu S, Arora S, et al. ANG II podporujeautofagiev podocytech. Am J Physiol Cell Physiol. 2010;299:C488–C496.
61. Flannery PJ, Spurney RF. Transaktivace receptoru epidermálního růstového faktoru angiotensinem II v glomerulárních podocytech. Nephron Exp Nephrol. 2006;103:e109–e118.
62. Harrison-Bernard LM, Navar LG, Ho MM a kol. Imunohistochemická lokalizace receptoru ANG II AT1 u dospělých potkanůledvinapomocí monoklonální protilátky. Am J Physiol. 1997;273:F170–F177.
63. Liebau MC, Lang D, Bohm J, et al. Funkční exprese systému renin angiotensin v lidských podocytech. Am J Physiol Renální Physiol. 2006;290:F710–F719.
64. Cena Pavenstadta H. Franze Volharda 2000: signalizace angiotensinu II v podocytu. Kidney Blood Press Res. 2000;23:156–158.
65. Wennmann DO, Hsu HH, Pavenstadt H. Systém renin-angiotenzin aldosteron v podocytech. Semin Nephrol. 2012;32:377–384.
66. Jia J, Ding G, Zhu J a kol. Infuze angiotensinu II indukuje změny exprese nefrinu a apoptózu podocytů. Am J Nephrol. 2008;28:500–507.
67. Crowley SD, Vasievich MP, Ruiz P a kol. Glomerulární receptory angiotensinu typu 1 zvyšují poškození ledvin a zánět u myší autoimunitní nefritidy. J Clin Invest. 2009;119:943–953.
68. Song K, Stuart D, Abraham N, et al. Renin sběrných kanálků nezprostředkovává hypertenzi se solí DOCA nebo poškození ledvin. PLoS One. 2016;11: e0159872.
69. Liu Z, Ji J, Zheng D, et al. Ochranná role endoteliálního knockoutu calpainu u akutních stavů vyvolaných lipopolysacharidyledvinazranění prostřednictvím zeslabení dráhy p38-iNOS a produkce NO/ROS. Exp Mol Med. 2020;52:702–712.
70. Seremwe M, Schnellmann RG, Bollag WB. Aktivita calpainu-10 je základem produkce aldosteronu indukované angiotensinem II v buněčném modelu rulosa nadledvinek. Endokrinologie. 2015;156:2138–2149.
71. Verheijden KAT, Sonneveld R, Bakker-van Bebber M, et al. Na vápníku závislá proteáza calpain-1 spojuje aktivitu TRPC6 s poškozením podocytů. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2099–2109.
72. Farmer LK, Rollason R, Whitcomb DJ a kol. TRPC6 se váže a aktivuje calpain, nezávisle na aktivitě jeho kanálu, a reguluje cytoskelet podocytů, buněčnou adhezi a motilitu. J Am Soc Nephrol. 2019;30: 1910–1924.
73. Letavernier E, Perez J, Bellocq A, et al. Zacílení na systém calpain/calpastatin jako nová strategie k prevenci kardiovaskulární remodelace u hypertenze vyvolané angiotensinem II. Circ Res. 2008;102:720–728.
74. Zafrani L, Gerotziafas G, Byrnes C, et al.calpastatinkontroluje polymikrobiální sepsi omezením uvolňování prokoagulačních mikročástic. Am J Respir Crit Care Med. 2012;185:744–755.
75. Letavernier E, Dansou B, Lochner M, et al. Kritická úloha rovnováhy calpain/kalpastatin při akutní rejekci aloštěpu. Eur J Immunol. 2011;41: 473–484.
76. Hanouna G, Mesnard L, Vandermeersch S, et al. Specifická inhibice calpainu chráníledvinaproti zánětům. Sci Rep. 2017;7:8016.
77. Ong SB, Lee WH, Shao NY a kol. Obnovuje se inhibice kalpainuautofagiea zabraňuje mitochondriální fragmentaci v lidském iPSC modelu diabetické endo liopatie. Stem Cell Rep. 2019;12:597–610.
78. Norman JM, Cohen GM, Bampton ET. In vitro štěpení vysokých proteinů proteázami buněčné smrti. Autofagie. 2010;6:1042–1056.
79. De Tullio R, Averna M, Pedrazzi M, et al. Diferenciální regulace komplexu calpain-kalpastatin L-doménoucalpastatin. Biochim Biophys Acta. 2014;1843:2583–2591.
