Biochemické a histopatologické odezvy Biomphalaria Alexandrina na RIPEX (regulátor růstu rostlin)Ⅰ

Abstraktní

Pozadí

Růstové regulátory rostlin jsou v zemědělství široce používány pro zvýšení růstu a dozrávání rostlin, ohrožují však vodní ekosystém. Současná studie hodnotila účinek subletální expozice RIPEX 48% koncentracím EC (8 a 16 µL/L) na parametry oxidačního stresu, pohlavní hormony, imunitní potenciální enzymy, diferenciální počty hemocytů a histopatologii trávicích žláz a ovotestes v Biomphalaria alexandrina šneci.

Klikněte pro cistanche herba pro testosteron

Výsledek

Expozice RIPEX způsobila celkové zvýšení aktivit superoxiddismutázy a glutathion-S-transferázy u B. Alexandriny. Extrémní expozice RIPEXu však inhibuje aktivitu SOD u hlemýžďů. Aktivita malondialdehydu ukázala zvýšení B. Alexandrina vystavené oběma koncentracím po všech expozičních obdobích. RIPEX také způsobil významné zvýšení testosteronu u hlemýžďů vystavených 16 µL/L, ale snížil hladiny hormonů u hlemýžďů vystavených 8 µL/L po 7 dnech. Pokud jde o estradiol, došlo k významnému zvýšení po 3 dnech expozice 16 µl/l a 7 dnech expozice 8 µl/l. Expozice RIPEX také zvýšila aktivity enzymů myeloperoxidázy a adenosindeaminázy v trávicích žlázách hlemýžďů. Zvýšil celkový počet hemocytů exponovaných hlemýžďů i počet granulocytů. Trávicí žlázy hlemýžďů a ovotestes vykazovaly patologické změny po 7 dnech expozice RIPEXu.

Závěry

Tato zjištění naznačují, že RIPEX je toxický pro B. Alexandrina a že tohoto hlemýždě lze použít jako bioindikátor kontaminace životního prostředí pomocí regulátorů růstu rostlin.

Klíčová slova

Biomphalaria alexandrina, RIPEX, Testosteron, Estradiol, Myeloperoxidáza, Adenosindeamináza, Histopatologie

1 Pozadí

Agrochemické znečištění povrchových vod je rostoucím globálním problémem životního prostředí, zejména v oblastech, kde se zemědělství rychle rozšiřuje a zintenzivňuje. Různé syntetické chemikálie, jako jsou pesticidy nebo hnojiva, se používají k úpravě množství a kvality plodin, aby uspokojily potřeby zákazníků [7, 40]. Promotory růstu rostlin jsou běžnými agrochemikáliemi v mnoha zemích [18].

Když jsou tyto chemikálie přímo vdechovány nebo konzumovány s kontaminovanou zeleninou, poškozují lidské zdraví [39]. Organofosforový pesticid, ethefon (2-chlorethylfosfonová kyselina) je syntetická chemická látka uvolňující etylen, která se běžně používá jako regulátor růstu rostlin (PGR) k podpoře indukce růstu, dozrávání plodů a dalších fyziologických reakcí. Je schválen pro použití na různých potravinách, krmivech, nepotravinářských rostlinách, ve skleníkových školkách a okrasných rostlinách pěstovaných venku [3, 50]. Laboratorní hodnocení toxicity ethephonu prokázalo, že ethephon indukoval morfometrické malformace druhé antény, senzorických štětin, ocasní páteře a řečiště u Daphnia magna, které vedly ke ztrátě funkce a smrti [54].

Abd-El Azeem [1] zaznamenal snížení rychlosti růstu, poškození DNA a apoptotických účinků v buňkách trávicích žláz slimáka Deroceras reticulatum po expozici ethefonu. Mnoho autorů schválilo toxicitu Ethephonu na krysy a ptáky [2, 17, 55]. Kromě toho expozice ethefonu způsobila genotoxicitu, oxidační stres a reprodukční toxicitu u myší [16]. Teratogenita a dysfunkce gonadálního systému u myší byly také spojeny s expozicí ethefonu [2, 16]. Ethephon se také ukázal jako imunotoxický, má mutagenní účinky [26], zvyšuje oxidační stres a snižuje koncentrace deoxyribonukleových a ribonukleových kyselin [4].

Ethefon ve vodních útvarech může ohrozit vodní faunu; údaje o jeho vlivu na vodní organismy jsou však vzácné. K detekci růstových hormonů rostlin ve vodních systémech bylo použito několik vodních druhů. S některými z těchto organismů je však obtížné manipulovat a udržovat je v laboratoři, což ztěžuje jejich použití v ekotoxikologických hodnoceních [54]. Vodní měkkýši, včetně hlemýžďů, si v poslední době získali pozornost jako testovací organismy kvůli potřebě vyvinout modely bezobratlých pro environmentální monitorování vodních kontaminantů [21, 45]. Plži jsou nejhojnější skupinou měkkýšů ve vodních systémech. Plži představují méně vykořisťovatelskou alternativu k vyšším obratlovcům jako bioindikátorům, protože je lze použít v různých experimentech bez hledání etického souhlasu a jejich pořízení a údržba jsou levné [13].

V tomto ohledu je šnek Biomphalaria alexandrina široce používán jako indikátorový organismus znečištění sladkých vod pesticidy [29, 30]. Kromě svého potenciálu bioindikátoru působí tento hlemýžď ​​jako mezihostitel pro přenos Schistosoma mansoni [35]. Proto mohou agrochemické koncentrace v prostředí ovlivnit přenos schistosomiázy přímými a nepřímými účinky na mezihostitele a hustoty parazitů [27]. Toto šetření bylo zaměřeno na prozkoumání dopadu subletální expozice regulátoru růstu rostlin, RIPEX 48 procent EC (obchodní název ethephon, 2-chlorethylfosfonová kyselina) na různé biochemické, imunologické a histologické aspekty B. alexandrina šneci jako bioindikační organismus.

2 Metody

2.1 Testovací organismus

Šneci Biomphalaria alexandrina byli shromážděni z jezera Manzalah v El-Matareya, Dakahlia Governorate, Egypt (31 stupňů 11′ N 32 stupňů 2′ E) a udržováni v dobře provzdušňované vodě z vodovodu při konstantní teplotě 20 stupňů. Denně byli krmeni čerstvými listy salátu. Po 4 týdnech udržování v laboratorních podmínkách byli v následných experimentech použiti zdraví dospělí šneci (průměr ulity 10–12 mm).

2.2 Experimentální materiál a podmínky expozice

Regulátor růstu rostlin, RIPEX (forma roztoku obsahující 48 procent etefonu [2- chloroethylfosfonové kyseliny (C2H6ClO3P)] a 52 procent inertních složek) byl zakoupen od Chema Industries (město New Nubaria, Behira, Egypt; registrační licence č. 1840). Byla připravena řada koncentrací. Byly vystaveny repliky stromů s deseti šneky. Po 1-dnu expozice byli mrtví šneci spočítáni a odstraněni a LC50 a LC90 byly vypočteny statistickým softwarem společenských věd (SPSS; IBM Corp. Armonk, NY, USA).

2.3 Experimentální design

Byly použity dvě subletální koncentrace představující LC10 a LC20 (8 a 16 µL/L). 90 hlemýžďů bylo rozděleno do tří skupin, každá skupina se třemi replikáty (deset hlemýžďů/replikace): kontrolní skupina, skupina vystavená 8 ul/l a skupina vystavená 16 ul/l. V 1-, 3- a 7-denních intervalech byly v trávicí žláze hodnoceny biomarkery oxidačního stresu a imunitní potenciální enzymy. steroidní hormony byly hodnoceny v Ovotestis. Byl hodnocen diferenciální počet hemocytů a histologie trávicích žláz a ovotestes. Pro biochemická vyšetření bylo 0,5 g tkáně (trávicí žlázy nebo ovotestis) z každé skupiny homogenizováno v 0,5 ml fosfátového pufru (pH 6,5) pomocí skleněného homogenizátoru a centrifugováno při 10,000×g, 4 stupních po dobu 10 minut . Výsledné supernatanty byly použity pro následné testy.

2.4 Stanovení markerů oxidačního stresu

2.4.1 Superoxiddismutáza (SOD, EC 1.15.1.1)

Aktivita SOD byla stanovena pomocí soupravy EnzyChrom™ Superoxide Dismutase Assay Kit (kat. č.: ESOD{{0}}; BioAssay Systems, Hayward, CA, USA) podle pokynů výrobce. Tkáňový homogenát s použitím studeného lyzačního pufru (50mM fosforečnan draselný, 0,1mM EDTA a 0,5% Triton X-100) byl centrifugován při 12,000g po dobu 5 minut při 4 stupních a supernatant byl odebrán pro stanovení SOD [43]. Aktivita SOD byla měřena při optické hustotě (OD) při 440 nm.

2.4.2 Glutathion-S-transferáza (GST, EC 2.5.1.18)

Enzym Tis katalyzuje konjugaci GSH s {{0}}chlor-2,4-dinitrobenzenem (CDNB). Měří se spektrofotometricky při 340 nm. Reakční směs obsahuje pufr fosforečnanu draselného 0,1 M, pH 6,5, GSH rozpuštěný v pufru fosforečnanu draselného (140 mg/100 ml) a CDNB 4 mg/ml v ethylalkoholu. Jedna jednotka enzymové aktivity je definována jako množství enzymu, které katalyzuje tvorbu 1 μmol S-konjugátu za minutu [11].

2.4.3 malondialdehyd (MDA)

Malondialdehyd v celých homogenátech byl stanoven jako látky reaktivní s thiobarbiturovou kyselinou (TBARS) podle standardní metody Ohkawa et al. [37]. Reakční směs obsahovala 0,1 ml tkáňového homogenátu, stejný objem roztoku dodecylsulfátu sodného, ​​0,75 ml kyseliny octové, 0,75 ml kyseliny thiobarbiturové, a 0,3 ml destilované vody. Tyto složky byly smíchány ve vortexu a inkubovány ve vroucí vodní lázni po dobu 1 hodiny, poté ochlazeny na teplotu místnosti. Do každé zkumavky bylo přidáno 10 0,5 ml destilované vody a 2,5 ml n-butanolu a důkladně promícháno na vortexu a poté rotováno v odstředivce při 2500 x g po dobu 10 minut. Absorbance byla odečítána při 532 nm.

2.5 Stanovení hormonů

2.5.1 Testosteron

Testosteron byl stanoven pomocí soupravy testosteronu Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (kat. č.: ADI-900-065; Enzo Life Sciences, NY, USA). Testosteron je hlavním androgenem, který ovlivňuje primární i sekundární sexuální vývoj jako sexuální touha. 100 ul standardního ředidla (testovací pufr 3 nebo médium pro tkáňové kultury) bylo napipetováno do jamek pro nespecifickou vazbu a maximální vazbu (0 pg/ml standard). Poté 100 µl standardu #1 až #5 do příslušných jamek. Vzorek (100 ul) byl napipetován do příslušných jamek a 50 ul testovacího pufru 3 do jamek pro nespecifickou vazbu. Do každé jamky bylo také přidáno 50 ul žluté protilátky, kromě jamek pro slepý pokus, celkovou aktivitu a nespecifickou vazbu. Inkubace destičky při teplotě místnosti na třepačce destiček po dobu 1 hodiny při 500 ot./min. Poté bylo do každé jamky přidáno 50 ul modrého konjugátu, s výjimkou celkové aktivity a slepých jamek. Po vyprázdnění obsahu jamek bylo provedeno promytí přidáním 400 ul promývacího roztoku do každé jamky 3krát. Do jamek s celkovou aktivitou byl přidán modrý konjugát (5 ul) a do každé jamky bylo přidáno 200 ul roztoku p-nitrofenylfosfátu a inkubováno při 37 stupních po dobu 1 hodiny bez třepání. Odečítání destičky při 405 nm bylo provedeno po přidání 50 ul stop roztoku do každé jamky [12, 48].

2.5.2 Estradiol

Estradiol byl stanoven pomocí soupravy estradiol ELIZA (kat. č.: 501890; Cayman Chemical, Michigan, USA) podle protokolů výrobce. Princip této reakce je založen na tom, že koncentrace indikátoru estradiol acetylcholinesterázy (AChE) je konstantní, ale koncentrace nativního estradiolu se mění, takže množství indikátoru estradiol acetylcholinesterázy (AChE), které se váže na estradiolové antisérum, je nepřímo úměrné koncentraci nativního estradiolu. ve studni. 100 ul ELISA pufru bylo přidáno do jamek pro nespecifickou vazbu a maximální vazbu. Přidání 50 µl ze zkumavky č. 8 do obou jamek s nejnižším standardem (Standard 8) a 50 µl ze zkumavky č. 7 do každé z dalších standardních jamek (Standard 7). Do každé jamky byl přidán vzorek (50 ul). Estradiol AChE Tracer (50 ul) byl přidán do každé celkové aktivity a slepých jamek. Poté bylo do každé jamky přidáno antisérum Estradiol ELISA (50 ul) s výjimkou celkové aktivity, nespecifické vazby a slepých jamek. Po inkubaci na orbitální třepačce (2 h při teplotě místnosti) byla měřena absorbance při 414 nm [52].

2.6 Stanovení imunitních potenciálních enzymů

2.6.1 Myeloperoxidáza (MPO, EC 1.11.2.2)

Jedna jednotka aktivity MPO je definována jako množství enzymu, který hydrolyzuje substrát a generuje taurinchloramin ke spotřebě 10 μmol TNB za minutu při 25 stupních . MPO byl stanoven pomocí soupravy pro stanovení kolorimetrické aktivity myeloperoxidázy (kat. č.: MAK068; Sigma-Aldrich, MO, USA). Absorbance byla měřena při 412 nm.

2.6.2 Adenosindeamináza (ADA, EC 3.5.4.4)

ADA je enzym, který katalyzuje přeměnu adenosinu a 2'-deoxyadenosinu na inosin a 2'-deoxyinosin. ADA byla stanovena podle principů soupravy pro stanovení aktivity adenosindeaminázy v technickém bulletinu (kat. č.: MAK400; Merck KGaA, Darmstadt, Německo). Jedna jednotka adenosindeaminázy je množství enzymu, který hydrolyzuje adenosin za vzniku 1,0 μmol inosinu za minutu při 37 stupních. Činidla jsou 1× ADA testovací pufr (41 μL), ADA Converter (2 μL), ADA vývojka (2 μL) a ADA substrát (5 μL).

2.7 Diferenciální počet hemocytů

Hemolymfa byla odebrána hlemýžďovi (kontrola, exponovaný) podle Sminia [47]. Poté, co se hlemýžď ​​dotkl Pasteurovou pipetou na hlavě a noze, byl nucen se stáhnout hluboko do své ulity a vytlačit hemolymfu, která byla odebrána pro diferenciální počet hemocytů. Hemolymfa byla nanesena na mikroskopické sklíčko za účelem rozšíření. Po fixaci v 99,8% methanolu po dobu 5 minut bylo sklíčko otočeno pod úhlem 45 stupňů pro sušení při teplotě místnosti a barveno barvivem Giemsa po dobu 20 minut. Diferenciace hemocytů byla stanovena jako úměrná počtu 100.

2.8 Histologická vyšetření

Histologická vyšetření byla provedena po 7 dnech expozice 8 a 16 µL/L RIPEX. Trávicí žlázy a ovotestes byly vypreparovány a okamžitě fixovány v Bouinově tekutině. Po 1 dni fixace byly vzorky dehydratovány řadou alkoholů a vyčištěny v xylenu. Byly vyrobeny parafínové bloky [42]. Deset sekt. (5–7 μm tloušťka) byly nařezány a obarveny hematoxylinem a eosinem (Mayerův H a E). Po barvení následovalo dobré omytí vodou z vodovodu. Histologické řezy byly fotografovány pomocí fotoautomatizovaného fotoaparátu (Optika, Itálie).

2.9 Statistická analýza

Data byla vyjádřena jako průměr ± standardní odchylka a analyzována statistickým softwarem společenských věd (SPSS; IBM Corp. Armonk, NY, USA). K identifikaci rozdílů mezi kontrolními a exponovanými skupinami, mezi různými koncentracemi a časovými body expozice byla použita dvoucestná analýza rozptylu ANOVA. Hladina významnosti byla nastavena na p Menší nebo rovno 0,05.

Mechanismus Cistanche zvyšuje účinek testosteronu

Bylo zjištěno, že Cistanche zvyšuje hladinu testosteronu několika způsoby. Za prvé, obsahuje sloučeniny známé jako echinakosid a akteosid, u kterých bylo prokázáno, že zvyšují produkci luteinizačního hormonu (LH) v hypofýze. LH stimuluje Leydigovy buňky ve varlatech k produkci testosteronu. Cistanche také obsahuje polysacharidy a fenylethanoidní glykosidy, u kterých bylo prokázáno, že mají antioxidační a protizánětlivé vlastnosti. To může pomoci snížit oxidační stres a zánět ve varlatech, což může narušit produkci testosteronu. Navíc bylo zjištěno, že Cistanche zvyšuje expresi genů zapojených do syntézy testosteronu a snižuje aktivitu enzymů, které rozkládají testosteron, jako je {{1} }alfa-reduktáza. Celkově se předpokládá, že kombinace těchto mechanismů přispívá k účinkům Cistanche na zvýšení testosteronu.

Hoda H. Abdel‑Azeem1*, Azza H. Mohamed1 a Mohamed R. Habib2