Skóre modulu uCRM (Urinary Common Rejection Module) pro neinvazivní monitorování transplantace ledvin

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Abstraktní

Již dříve bylo popsáno, že společný modul rejekce (CRM) sestávající z 11 genů exprimovaných v biopsiích aloštěpu slouží jako biomarker pro akutní rejekci (AR), koreluje s rozsahem poškození štěpu a předpovídá budoucí poškození aloštěpu. Zkoumali jsme použití tohoto genového panelu na peletu buněk moči pacientů po transplantaci ledviny. Sedimenty močových buněk byly odebrány pacientům s biopsií potvrzenou akutní rejekcí, hraniční AR (bAR), BK virovou nefropatií (BKVN) a stabilní ledvinové štěpy s normálními protokolovými biopsiemi (STA) byly analyzovány na expresi těchto 11 genů pomocí kvantitativního polymerázového řetězce reakce (qPCR). U těchto 11 genů CRM jsme hodnotili jejich hojnost, autokorelaci a individuální úrovně exprese. Exprese 10/11 genů byla zvýšená u AR ve srovnání s STA.Psmb9 a Cxcl10 mohly klasifikovat AR oproti STA stejně přesně jako 11-genový model ( citlivost=93.6 procent, specificita=97.6 procent). Skóre Au CRM, založené na geometrickém průměru hladin exprese, mohlo rozlišit AR od STA s vysokou přesností (AUC= 0.9886) a korelovalo specificky s histologickými měřeními tubulitidy a intersticiálního zánětu spíše než tubulární atrofie, glomerulosklerózy, intimální proliferace, tubulární vakuolizace nebo akutní glomerulitida. Toto skóre založené na genové expresi v moči může umožnit neinvazivní a kvantitativní monitorování AR.

ÚČINKY CSITANCHE: PROTIZÁNĚTLIVÉ

Úvod

Transplantace ledviny (KTx) je preferovanou modalitou pro léčbu konečného stádia renálního onemocnění (ESRD) z jakékoli příčiny [1]. I když se tento terapeutický přístup stal celosvětově rutinní praxí, která významně zlepšuje kvalitu života a přežití pacientů[2], dlouhodobé výsledky aloštěpu ledviny se nezlepšily, jak se očekávalo, navzdory lepšímu pochopení imunitní biologie odmítnutí aloštěpu a příchodu nových a silnější imunosupresiva [3]. Hlavní příčinou přetrvávajícího a špatného přežití štěpu je neschopnost neinvazivně kvantifikovat zátěž imunitního poškození štěpu a předvídat akutní odmítnutí před podstatným funkčním poklesem a histologickým poškozením. I když je dobře známo, že pacienti s KTx jsou nepřetržitě vystaveni imunitním a neimunitním poraněním [4, 5], periodické monitorování KTx je závislé na necitlivých náhradních markerech dysfunkce aloštěpu, jako je sérový kreatinin (6, Z] a sporadické monitorování KTx je založeno na protokolárních biopsiích aloštěpu k detekci subklinického histologického poškození štěpu v nepřítomnosti poruchy sérového kreatininu. má nízkou specificitu pro diagnózu akutní rejekce (AR), protože vzestup sérového kreatininu může být způsoben jinými důvody, které přímo nesouvisejí s rejekcí aloštěpu, jako je nefrotoxicita související s imunosupresivy (IS), akutní tubulární nekróza, infekce a intersticiální fibróza a tubulární atrofie (IFTA). Navíc, zatímco použití kontrolních biopsií bylo postulováno jako zlatý standardní nástroj pro diagnostiku lograftové léze, tento přístup je nákladný, invazivní, s morbiditou výkonu (riziko krvácení; postup vyžadující sedaci, zejména u dětských pacientů s KTx)[9], zatížený variabilitou čtení mezi operátory a často nedostatečně reprezentativní pro fokální histologické poškození. imunitní poškození v aloštěpu by bylo významným pokrokem pro přesné monitorování KTx [10-12].

Dotazování proteomických, RNA a mikroRNA biomarkerů v moči pacientů s KTx prokázaly naše skupiny a další[13-17] jako optimální biologickou tekutinu pro sériové monitorování aloštěpu ledviny, protože se jedná o ultrafiltrát ledviny a odráží biologické procesy a zánětlivou zátěž nacházející se v ledvinovém štěpu [18]. Navzdory řadě studií, které dříve hodnotily biomarkery moči jako neinvazivní diagnostický přístup pro analýzu AR při transplantaci ledviny, se výhradní zaměření na jednotlivé biomarkery, jako jsou konkrétní chemokiny a receptory, jako CXCR3, CXCL9 nebo CXCL10 [{{ 6}}] je obtížné zachytit molekulární komplexitu a heterogenitu AR u různých pacientů s KTx. Zachycení této heterogenity je zásadní pro kvantifikaci zátěže poranění způsobem využitelným pro prospektivní monitorování AR a zotavení poranění štěpu po terapeutické intervenci [25, 26].

V této studii aplikujeme znalosti získané z využití modulu Common Rejection Module (CRM) 11 genů [27], původně vyvinutého pomocí vyčerpávající metaanalýzy veřejně dostupných souborů dat z mikročipů transplantované tkáně vzorků biopsie ze čtyř různých typů pevných látek. orgány. Všechny geny CRM ve tkáni (tCRM) byly mezi pacienty s AR nadměrně exprimovány, bez ohledu na typ orgánu, rozdíly v protokolech imunosuprese nebo rozdíly v platformách dotazujících se na genovou expresi. Kvantitativní práh určený výpočetní analýzou kombinovaného genového skóre (skóre tCRM) přesně předpověděl přítomnost AR křížovou validací signatur tkáňové genové exprese v 8 nezávislých kohortách (n= 236 vzorků) aloštěpu lidské ledviny biopsie[27]. Skóre tCRM bylo dále validováno pomocí qPCR v samostatné studii na vzorcích biopsie KTx jako diagnostika jak AR, tak chronického poškození aloštěpu (CAl) s různými prahovými hodnotami genové sady [28]. Kromě toho byla tato sada genů CRM validována v nezávislém souboru bioptické tkáně pacientů po transplantaci plic s chronickou dysfunkcí plicního aloštěpu (CLAD) [29].

V této studii hodnotíme sadu genů CRM pro použití ve vzorcích moči od pacientů s KTx, spárovanou s biopsií aloštěpu se známou histologií, pro neinvazivní diagnostiku AR a dalších imunitně zprostředkovaných poranění. Dále vyvíjíme skóre CRM (uCRM) v moči, které přesně rozlišuje mezi pacienty s STA a AR. Klinický potenciál tohoto skóre při detekci bAR hodnotíme korelací tohoto skóre s histologickým skóre tubulitidy a intersticiálního zánětu.

ÚČINKY CSITANCHE: ZLEPŠENÍ IMUNITY

Materiály a metody

Vzorky moči a studovaná kohorta

Do studie byly zahrnuty vzorky moči biobanky (n{0}}) od příjemců KTx zapsaných na Stanford University v letech 2000 až 2011 a UCSF Medical Center zapsaných v letech 2014 až 2016. Studie byla schválena Institutional Review Board a Ethics Committee of California San Francisco, CA. Všichni pacienti poskytli písemný informovaný souhlas s účastí na výzkumu v plném souladu s Helsinskou deklarací. Uvedené klinické a výzkumné aktivity jsou v souladu se zásadami Istanbulské deklarace, jak je uvedeno v Istanbulské deklaraci o obchodování s orgány a transplantační turistice. U vzorků moči použitých při stanovení prahové hodnoty uCRM pro AR bylo pomocí párových biopsií aloštěpu ledviny identifikováno 178 vzorků moči s jasně definovanými patologiemi buď AR klasifikované podle Banffa [30,31] nebo štěpů bez poškození/stabilní (STA) (Eig 1). Kromě toho jsme také hodnotili signaturu pro test uCRM u virové nefropatie BK, která je důležitým matoucím faktorem pro diagnostiku AR a často se projevuje významným zánětem na biopsii aloštěpu. Celkově bylo vyřazeno 28 vzorků kvůli problémům s kontrolou kvality souvisejícím s nízkým obsahem a nekvalitní RNA, což vedlo ke konečnému počtu 150 vzorků moči od 150 jedinců pro průřezovou analýzu imunitně zprostředkovaného poškození KTx. Každý vzorek moči byl porovnán s biopsií v době odběru moči, která byla vyhodnocena patologem centrálního personálu na Stanfordské univerzitě (Richard Sibley) nebo na UCSF (Zol-tan Laszik).

Charakteristika pacienta

150 unique urine samples were assessed for the uCRM assay in 150 unique kidney transplant patients. Baseline clinical and demographic variables by AR, bAR, BKVN, or STA phenotype are shown in Table1, There were no significant differences between the groups in the demographic variables, except in recipient age (p= 0.025) and in donor-source (p=0.0008). These samples were used in cross-sectional analyses for modeling of gene expression data and subsequent development and validation of the uCRM threshold for biopsy-proven AR. Samples were collected from both pediatric (n=94) and adult (n=56)patients to enable a model-independent of recipient age or baseline immunosuppression. Based on the matched biopsy diagnosis, urine samples were categorized in the following categories: AR(n=64;45 biopsies met criteria for Banff confirmed AR with >i2,t2, and infiltration by >4 mononukleární buňky /tubulární průřez, přičemž 19 splnilo kritéria pro hraniční AR s il/i2 a t0/t1 a infiltraci 1-4 mononukleárními buňkami/tubulární průřez), STA (n { {8}}), nefritida viru BK (n =43), pacienti dostávali režim ILS s inhibitorem kalcineurinu na bázi takrolimu a mykofenolát mofetilu, se steroidy nebo bez nich, a indukční terapii buď thymoglobulinem nebo anti-IL{{ 12}} receptor monoklonální protilátka (daklizumab nebo baz. infliximab)[32]. Vzorky moči byly získány v průměru 731 dnů po transplantaci (rozsah 169-1335 dnů).

Definice fenotypů poranění

All kidney biopsies were blindly and centrally analyzed at each institution by staff pathologists (RS and ZL)and were graded by the Banff dassification[31,33] for acute rejection.Intragraft C4d stains were performed [34] to assess for acute humoral rejection(AHR)[35]. Transplant injury was defined as>20procentní zvýšení sérového kreatininu od jeho předchozí výchozí hodnoty v ustáleném stavu a související biopsie, která byla klasifikována jako AR nebo BKVN.AR, byla definována minimálně, podle Banffova schématu, skóre tubulitidy větší nebo rovné 1 doprovázené skóre intersticiálního zánětu Vyšší nebo rovno 1 s negativními Cd i DSA. Byly indukovány případy AR (TCMR) zprostředkované T-buňkami i rejekce zprostředkované protilátkami (ABMR), ačkoli všechny pozorované případy ABMR měly smíšený fenotyp TCMR a ABMR, protože pozorování čisté ABMR je zřídka pozorováno u nízkorizikových nesenzibilizovaných kohort. V některých případech TCMR byly pozorovány hraniční změny (bAR), charakterizované infiltrací mononukleárních buněk(<25% of="" the="" parenchyma)or="" foci="" of="" mild="" tubulitis(1-4="" mononuclear="" cells/tubular="" cross-section),="" and="" for="" purposes="" of="" molecular="" correlation="" analysis,="" these="" have="" been="" shown="" as="" bar,="" as="" the="" burden="" of="" histological="" inflammation="" was="" overall="" lower="" for="" these="" biopsy="" samples.="" bkvn="" was="" defined="" as="" the="" positivity="" of="" polyomavirus="" pcr="" in="" peripheral=""><1000-28,800,000), together="" with="" a="" positive="" sv40="" stain="" in="" the="" concomitant="" renal="" allograft="" biopsy.="" normal="" (sta)="" allografts="" were="" defined="" by="" an="" absence="" of="" significant="" injury="" pathology="" on="" the="" 6-month="" protocol="" biopsy,="" as="" defined="" by="" banff="" schema,="" stable="" graft="" function,="" no="" proteinuria,="" and="" no="">

Obr. 1. Výběr vzorku a schéma studie studie. V letech 2000 až 2016 bylo odebráno 1 760 vzorků moči,

z nichž 643 mělo odpovídající bioptické údaje. 178 z těchto 643 mělo dobře definované fenotypy AR, bAR, BKVN nebo STA.

Po extrakci RNA, syntéze cDNA a kvantifikaci qPCR neprošlo 28 vzorků QA/QC, takže 150

vzorky pro statistickou analýzu a modelování.

Sběr moči, zpracování, extrakce celkové RNA, syntéza cDNA a qPCR

Moč (50 ml; sterilní nádoba) byla odebrána pacientům po transplantaci ledviny před biopsií a před jakoukoli intenzifikací léčby pro AR. RNA byla extrahována ze sedimentu močových buněk podle našeho dříve popsaného protokolu [36]. Stručně řečeno, buňky moči byly získány centrifugací 50-ml vzorku moči při 2000xg po dobu 20 minut. RNA byla extrahována z pelet buněk moči pomocí Mikrosada RNeasy Plus (Qiagen, Valencia, CA). Kvalita RNA byla hodnocena pomocí spektrofotometru NanoDrop ND-2000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) s poměrem 260/280. Syntéza cDNA byla provedena s použitím 50 ng extrahované RNA pomocí SuperScript VILO "Master Mix (Invitrogen, Carlsbad, CA). qPCR byla provedena na cDNA syntetizované z 50 ng celkové RNA, poté bylo 1,56 ng cDNA zpracováno prostřednictvím specifické cílové amplifikace a vzorku ředění sdruženými testy Taqman pro 1 l genů uCRM v multiplexu, s Taqman PreAmp Master Mix (ABI) na konečný objem 5 ul, na 18 cyklů v tepelném cykléru, poté naředěné pufrem DNA Suspension Buffer (TEKnova, CA). Mikrofluidní qPCR byla provedeno na 96,96 dynamických polích (Fluidigm, South San Francisco, CA) s použitím 2,25 ul naředěného vzorku ze specifické cílové amplifikace, spolu s Taqman Assays (ABI) pro každý genový transkript (S1Table), Taqman Universal master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) a Loading Reagent (Fluidigm), napuštěním a zavedením čipu přes HX IFC Controller a provedením qPCR v systému BioMark (Fluidgm). Relativní množství RNA exprese bylo vypočteno pomocí srovnávacího cy metoda prahu cle (CT). Hodnoty exprese byly normalizovány na 18S použitím endogenní referenční ribozomální RNA a univerzální RNA (Agilent Inc., Santa Clara, CA).

Statistický

Všechny qPCR testy byly provedeny v duplikátech. Všechna data jsou prezentována jako průměr ± SEM. Pro srovnání genů CRM na fenotyp byl použit model smíšených efektů s Geisser-Greenhouse korekcí, s vícenásobnými srovnávacími korekcemi provedenými pomocí dvoustupňového lineárního postupu Beniaminiho, Kriegera a Yekutieliho. Pearsonova korelace a hierarchické oprašování byly provedeny v Morpheus (Broad Institute). U modelů predikce strojového učení byla data rozdělena do trénovací sady (80 procent) a testovací sady (20 procent). K určení nejpřesnějšího limitu skóre uCRM byl použit model klasifikace rozhodovacího stromu, validovaný na testovací sadě. Variabilní selekce pomocí náhodných lesů (VSURF) byla použita pro klasifikaci AR ys STA a také pro hodnocení a klasifikaci důležitosti jednotlivých genů. Výstup důležitosti proměnné Random Forest je definován jako průměrné procento snížení nepřesnosti modelu proměnné (genu), které byly z modelu vyloučeny (náhodně permutovány). Oprašování bez dozoru pro vizualizaci fenotypové separace bylo provedeno pomocí distribuovaného stochastického sousedského embed-ding algoritmu (t-SNE) v Mathematica 11.3 (Wolfram Research, Champaign. IL). Síťová analýza genů CRM byla provedena pomocí GeneMANIA [37]. Statistiky demografických proměnných byly provedeny pomocí Chi-kvadrát analýzy pro diskrétní a Kruskal-Wallisova testu pro spojité proměnné v IMP 14.2 (SASInstitute, Cary, NC). Pokud není uvedeno jinak. všechny ostatní analýzy byly provedeny a vizualizovány pomocí Prism 8.0.1 (GraphPad, Carlsbad, CA).

Schválení studie

Studii schválily etické komise jak lékařské fakulty Stanfordské univerzity, tak lékařského centra UCSF. Všichni dospělí pacienti a rodiče/zákonní zástupci jiných než dospělých pacientů poskytli písemný informovaný souhlas s účastí na výzkumu v plném souladu s Helsinskou deklarací. Uvedené klinické a výzkumné aktivity jsou v souladu se zásadami Istanbulské deklarace, jak je uvedeno v Istanbulské deklaraci o obchodování s orgány a transplantační turistice.

ÚČINKY CSITANCHE: ZLEPŠENÍ IMUNITY

Výsledek

Výchozí klinické a demografické proměnné pro všech 150 příjemců KTx s fenotypy AR, bAR, BKVN a STA jsou uvedeny v tabulce 1.

Relativní hojnost a korelace exprese genu CRM v sedimentu myších buněk

Relativní hojnost. Pro stanovení relativního množství transkriptů genu CRM v močových sedimentech byly jako metrika hojnosti použity prahové hodnoty cyklu (Ct). Čím nižší je hodnota Ct, tím vyšší je její zastoupení mezi CRM geny. Mezi 11 CRM geny byl BASP1 nejhojnějším transkriptem v sedimentu močových buněk. Po BASP1 následovaly TAP1, PSMB9 a ISG20 jako 4 nejhojnější transkripty. LCK a CD6 patřily mezi nejméně zastoupené transkripty v močových sedimentech v genu CRM. Protože se hodnoty Ct pohybovaly od nejnižší hodnoty Ct 14 do nejvyšší hodnoty Ct 20, existoval 64-násobný rozdíl mezi transkripty genů BASP1 a CD6, přičemž CD6 byl nejméně zastoupený transkript.

Obr. 2. Relativní množství a korelace množství CRM genů v moči a exprese CRM genů napříč různými klinickými fenotypy transplantace ledvin. A. Pearsonova korelační matice prokazující korelaci mezi 11 geny CRM v jejich expresi v sedimentech močových buněk. Velikost čtverce slouží jako vizuální indikátor síly korelace. B. Teplotní mapa s kontrolovaným shlukováním podle fenotypu demonstrující relativní expresi CRM genů v AR, bAR, BKVN a STA. C. Houslové grafy zobrazující distribuci CRM genů v AR, bAR, BKVN a STA buněčné peletě moči. � naznačuje, že AR vs STA byla významná po vícenásobném srovnání. # ukazuje, že bAR vs STA byl významný po vícenásobném srovnání. Další statistiky jsou k dispozici v tabulce 2.

Korelace genové exprese mezi geny CRM.

Dále jsme hodnotili korelaci genové exprese mezi 11 CRM geny. Korelace se pohybovala od velmi slabé (r=-0,17 pro CXCL9 a NKG7 a r=-0,10 CXCL10 a RUNX3) po velmi silnou (r=0,77 pro INPP5D a TAP1 a stejná hodnota pro CD6 a LCK). Ačkoli CXCL9 a CXCL10 jsou ve stejné třídě chemokinů, korelace genové exprese mezi nimi byla pouze střední (r=0.46). Grafické znázornění korelační matice je znázorněno na obr. 2A. Tepelná mapa vytvořená pomocí kontrolovaného shlukování ukazuje značné zvýšení hodnot genové exprese genů CRM v AR, bAR a BKVN ve srovnání s fenotypem STA (obr. 2B).

Exprese genu uCRM v močových sedimentech s biopsií potvrzenou AR a BKVN

Genová exprese CRMgenů v AR a bAR. Dále jsme hodnotili genovou expresi každého z 11 CRM genů pro jejich relativní expresi v AR, bAR, BKVN a STA. Shrnutí výsledků analýzy je uvedeno v tabulce 2 a na obr. 2C.1 0 z 11 genů byly významně zvýšeny v močových sedimentech AR ve srovnání s močovými sedimenty z STA. Avšak pouze pět genů CRM (Cd6, Cxcll0, Cxd9, Nkg7 a Psmb9) bylo významně upregulováno ve vzorcích bAR ve srovnání s STA a jejich exprese ve skupině bAR byla relativně nižší než ve skupině AR odstupňované podle Banffa, což zdůrazňuje, že geny uCRM mohou odrážejí zánětlivou zátěž v aloštěpu Eig 2C.

Tabulka 2. Hladiny genové exprese genů CRM napříč různými fenotypy

Genová exprese CRMgenů v BKVN. Exprese CD6, CXCL10, CXCL9, LCK, NKG7 a PSMB9 byla rozdílně regulována ve vzorcích moči u pacientů s BKVN ve srovnání se vzorky od pacientů s STA. Ze šesti genů se statisticky odlišnými hodnotami genové exprese mezi vzorky BKVN a STA byla exprese pouze NKG7 v moči BKVN podstatně nižší.

Stanovení skóre exprese genu CRM(uCRM) v moči k identifikaci odmítnutí transplantátu ledviny

Protože exprese sady genů CRM nebyla napříč transplantovanými fenotypy homogenní a mezi různými geny docházelo k podstatným fyziologickým vzájemným rozhovorům (obr. S1), použili jsme nelineární kontrolované metody k další diferenciaci a klasifikaci fenotypů. K určení vztahů mezi geny uCRM a fenotypy bylo provedeno shlukování bez dozoru prostřednictvím t-SNE. Obr. 3A ukazuje graf t-SNE, což ukazuje, že 11 genů CRM mohlo téměř úplně oddělit AR od vzorků STA. Model VSURF, závislý na skóre důležitosti Random Forests, určil, že PSMB9 a CXCL10 byly dva nejdůležitější geny při uspokojování AR z STA. Obr. 3B dále znázorňuje význam těchto 2 genů. Graf důležitosti vah genů označuje, že pokud je kterýkoli ze 2 genů vyloučen z modelu, odpovídá přibližně 20procentnímu snížení nepřesnosti modelu. Tyto dva geny mohly klasifikovat AR versus STA s téměř stejně vysokou přesností jako genový model 1l, s citlivostí 93,6 procenta a specificitou 97,6 procenta. Prahové hodnoty genové exprese pro tyto dva geny byly stanoveny klasifikátorem rozhodovacího stromu a hodnoty logaritmického měřítka těchto dvou genů jsou znázorněny na obr. 3C. Prahová hodnota 28 pro CXCL10 a 3 pro PSMB9 správně klasifikovala 86/88 případů AR & STA s celkovou přesností 97,7 procenta. Zejména vzorky bAR spadaly mezi fenotypy AR a STA, což naznačuje gradaci těchto dvou genů ve stupni zánětu aloštěpu.

Pro prozkoumání klasifikačního výkonu skóre uCRM v případech AR, hraniční AR a STA byl vytvořen klasifikátor rozhodovacího stromu (obr. 4A). Rozhodovací strom určil optimální prahové hodnoty uCRM skóre pro každý fenotyp. Skóre vyšší než 4 správně klasifikovalo 44/49 případů AR; skóre nižší než 1,8 správně klasifikovalo 33/35 případů STA. 14/23 hraničních případů bylo mezi těmito dvěma prahy. Distribuce skóre uCRM podle fenotypu je znázorněna na obr. 4B. Průměrné skóre uCRM (SEM) pro AR, bAR a STA bylo 8,195 (0,631), 3,265 (0,412{{21 }}), respektive 1,404(0,162) a všechna srovnání byla významná po korekci vícenásobných srovnání. Skóre uCRM dokázalo s vysokou přesností rozlišit mezi AR a STA – na prahu 3,63 byla senzitivita a specificita 95,35 procenta a 97,78 procenta v tomto pořadí (Eig 4C. Při rozlišení mezi AR a kombinací bAR a STA skóre uCRM zůstalo zachováno vysoká přesnost na stejném prahu, senzitivita a specificita 87,10 procent a 97,78 procent v daném pořadí (obr. S2A).

Když byly zahrnuty vzorky BKVN, všechny fenotypy se od sebe významně lišily po korekci vícenásobných srovnání kromě bAR a BKVN (S2BFig). Při rozlišení mezi AR a kombinací bAR, STA a BKVN si skóre uCRM stále zachovalo vysokou, ale nižší přesnost. Při použití stejných prahových hodnot 3,63 byla senzitivita 76,92 procenta a specificita 97,78 procenta (S2CFig).

ComScore koreluje s histologickými lézemi biopsie specifickými pro AR Trend zvyšování skóre uCRM z STA na bAR na AR naznačuje, že skóre uCRM by mohlo detekovat klinicky relevantní gradace zánětu. Jako takové jsme hodnotili, zda skóre uCRM bylo spojeno s rozsahem histologických AR lézí pozorovaných v odpovídajících biopsiích od stejného pacienta, odebraných současně. Jak je vidět na obr. 5A a 5B, skóre uCRM korelovalo s rozsahem tubulitidy(t) a skóre biopsie intersticiálního zánětu(i) v AR(R=0.5479, P<0.0001 and="" r="0.4420,"><0.0001 for="" the="" ucrm="" score="" regarding="" t="" and="" ii,="" respectively).="" there="" was="" no="" correlation="" between="" the="" ucrm="" score="" and="" measures="" of="" tubular="" atrophy="" (ta),glomerulosclerosis="" (gs),mesangial="" matrix="" (mm),="" intimal="" proliferation="" (cv),="" medial="" arteriolar="" hyaline="" (ah),="" tubular="" vacuolization(tv),="" arteritis="" (v),="" or="" acute="" glomerulitis="">

ÚČINKY CSITANCHE: PROTI ÚNAVĚ

Diskuse

V transplantační medicíně existuje naléhavá potřeba vyvinout spolehlivé a neinvazivní monitorovací nástroje, které mohou pomoci transplantačním lékařům předvídat riziko poranění aloštěpu, přednostně před tím, než již bylo zjištěno poškození aloštěpu. Zatímco s AR byla spojena řada transkripčních biomarkerů, většina studií se v zásadě soustředila na jedinečný nebo jediný transkripční faktor a neodrážejí celou molekulární složitost biologického procesu rejekce aloštěpu [11,38]. Navíc, zatímco současným zlatým standardem pro diagnostiku přítomnosti imunitně zprostředkovaného poškození aloštěpu je biopsie aloštěpu, je dobře známo, že tento postup má klíčová omezení, pokud jde o časté nepravidelné zastoupení vzorků, jeho vysokou cenu a nepraktičnost pro opakované screeningu kvůli invazivní povaze techniky.

Několik zpráv prokázalo hodnotu studia různých biomarkerů předpovídajících AR ve vzorcích moči příjemců transplantované ledviny [20-22]. Zvýšené hladiny imunitních efektorových molekul a transkriptů v moči, jako je granzym B. CXCL10.CXCL9.IFN-y a CXCR3. se ukázalo, že jsou vysoce spojeny s AR a v některých případech dokonce předpovídají nástup AR předem [19,24,39-43]. S využitím nedávno publikovaných údajů naší skupinou [2Z, 29,44], které ukazují společný modul rejekce genové exprese v biopsiích aloštěpu během AR, bez ohledu na typ tkáňového orgánu, bylo hlavním cílem této studie prozkoumat, zda hodnocení CRM v moči pacientů po transplantaci ledviny by mohl být užitečný jako ideální neinvazivní biomarker předpovídající nástup AR.

Zatímco mnoho jednotlivých CRM genů a genových produktů bylo hodnoceno individuálně, toto je první zpráva o kolektivním, neinvazivním použití CRM genů při predikci AR u KTx. Například močová CXCL9 mRNA a protein a CXCL10 mRNA byly dříve hodnoceny v multicentrických studiích pro diagnostiku AR[13,45,46. Transkripty PSMB9 v renálních biopsiích byly také dříve spojeny s kvalitou štěpu a predikcí akutní rejekce [ 47].

Analyzovali jsme údaje o genové expresi v močových sedimentech od pacientů s KTx na relativní hojnost transkriptů CRM a jejich korelaci exprese mezi CRMgeny (obr. 2A). V souladu s naší dříve publikovanou studií analyzující skóre CRM ve vzorcích tkáňových aloštěpů ledvin a plic, CRMgeny měly zvýšenou expresi v AR a jiných transplantačních poraněních, jako je AR a BKVN (obr. 2B a 2C). V této zprávě jsme také pozorovali silnou korelaci mezi nově vyvinutým uCRM skóre a histologickým zánětlivým skóre (t a ii skóre biopsií ledvin). Protože většina těchto CRM genů je exprimována téměř výhradně v infiltrujících imunitních buňkách, zvýšená exprese CRM genů v močových sedimentech naznačuje, že dochází ke zvýšenému uvolňování infiltrujících imunitních buněk v moči příjemců transplantovaných ledvin, kteří podstoupili poškození štěpu.

Dále jsme použili kombinované skóre vypočítané z jednotlivých hodnot genové exprese jednotlivých genů CRM, ComScore, jako metriku pro klasifikaci pacientů po transplantaci ledviny buď na pacienty s akutní rejekcí nebo bez poškození, a stanovili jsme práh pro AR. Výsledky této studie prokazují, že síla testu uCRM nespočívá pouze v identifikaci pacientů s AR, ale také v kvantifikaci stupně poranění, ke kterému dochází v aloštěpu, protože skóre se zvyšuje z nízkých hodnot u pacientů s STA na střední hodnoty u pacientů s bAR, a na vysoké hodnoty u pacientů s AR, jak se odráží v histologickém skóre tubulitidy a intersticiálního zánětu. Domníváme se, že skóre uCRM má potenciální využití při monitorování transplantací a může sloužit jako doplněk nebo odkazující test na biopsie. Pacient s nízkým skóre uCRM může být schopen vyhnout se zbytečným biopsiím podle protokolu, zatímco pacient s vysokým skóre uCRM může vyžadovat sériové monitorování nebo biopsii příčiny k posouzení stavu štěpu.

Uznáváme několik omezení této studie, která zahrnují (i) omezenou velikost vzorku studie, (ii) nepřítomnost jiných fenotypů poškození transplantátu, jako je chronické poškození aloštěpu nebo toxicita léků, a (i) nedostatek hodnocení skóre uCRM v longitudinálním vzorek ve větší velikosti kohorty. Tato slibná zjištění naznačují, že jsou zapotřebí další prospektivní studie k ověření a plnému posouzení potenciální užitečnosti skóre uCRM v klinickém prostředí. Stručně řečeno, představujeme neinvazivní biomarker založený na moči vyvinutý ze společného modulu odmítnutí složeného z 11 genů, které mohou identifikovat poškození a odmítnutí transplantátu u pacientů po transplantaci ledviny.

ÚČINKY CSITANCHE: ZLEPŠENÍ PAMĚTI

Reference

1 Wolfe RA, Ashby VB, Milford EL, Ojo AO, Ettenger RE, Agodoa LY a kol. Porovnání mortality u všech dialyzovaných pacientů, dialyzovaných pacientů čekajících na transplantaci a příjemců první kadaverózní transplantace. New England Journal of Medicine. 1999; 341(23):1725–30.

2. Laupacis A, Keown P, Pus N, Krueger H, Ferguson B, Wong C a kol. Studie kvality života a rentability transplantace ledvin. Mezinárodní ledviny. 1996; 50(1):235–42. PMID: 8807593.

3. Lodhi SA, Lamb KE, Meier-Kriesche HU. Zlepšení dlouhodobých výsledků u pacientů po transplantaci: zdůvodnění dlouhodobého a multidisciplinárního výzkumu specifického pro dané onemocnění. Americký žurnál transplantací: oficiální žurnál Americké transplantační společnosti a Americké společnosti transplantačních chirurgů. 2011; 11(10):2264–5.

4. Naesens M, Khatri P, Li L, Sigdel TK, Vitalone MJ, Chen R, et al. Progresivní histologické poškození renálních aloštěpů je spojeno s expresí genů vrozené a adaptivní imunity. Mezinárodní ledviny. 2011; 80(12):1364–76.

5. Sigdel TK, Li L, Tran TQ, Khatri P, Naesens M, Sansanwal P a kol. Non-HLA protilátky proti imunogenním epitopům předpovídají vývoj chronického poškození renálního aloštěpu. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 2012; 23(4):750–63.

6. Pape L, Offner G, Ehrich JH, de Boer J, Persijn GG. Funkce renálního aloštěpu u párů pediatrických a dospělých příjemců stejného dárce. Transplantace. 2004; 77(8):1191-4. PMID: 15114083.

7. Provoost AP, Wolff ED, de Keijzer MH, Molenaar JC. Vliv velikosti příjemce na funkci ledvin po transplantaci ledviny. Experimentální a klinické vyšetření. Časopis dětské chirurgie. 1984; 19(1):63–7.

8. Moreso F, Lopez M, Vallejos A, Giordani C, Riera L, Fulladosa X, et al. Sériové protokolové biopsie ke kvantifikaci progrese chronické transplantační nefropatie u stabilních renálních aloštěpů. Americký žurnál transplantací: oficiální žurnál Americké transplantační společnosti a Americké společnosti transplantačních chirurgů. 2001; 1(1):82–8. PMID: 12095044.

9. Davis ID, Oehlenschlager W, O'Riordan MA, Avner ED. Dětská renální biopsie: měl by být tento postup prováděn ambulantně? Dětská nefrologie. 1998; 12(2):96–100. PMID: 9543363.

10. Roedder S, Sigdel T, Salomonis N, Hsieh S, Dai H, Bastard O a kol. Test kSORT k detekci pacientů po transplantaci ledvin s vysokým rizikem akutní rejekce: výsledky multicentrické studie AART. PLoS medicína. 2014; 11(11):e1001759.

11. Sarwal M, Chua MS, Kambham N, Hsieh SC, Satterwhite T, Masek M, et al. Molekulární heterogenita při akutní rejekci renálního aloštěpu identifikovaná profilováním DNA microarray. New England Journal of Medicine. 2003; 349(2):125–38.

12. Sigdel TK, Sarwal MM. Nedávné pokroky v objevování biomarkerů při transplantaci pevných orgánů pomocí proteomic. Odborný posudek proteomiky. 2011; 8(6):705–15. https://doi.org/10.1586/epr.11.66 PMID: 22087656.

13. Suthanthiran M, Schwartz JE, Ding R, Abecassis M, Dadhania D, Samstein B a kol. Profil mRNA z močových buněk a akutní buněčná rejekce v aloštěpech ledvin. New England Journal of Medicine. 2013; 369 (1):20–31.

14. Sigdel TK, Gao Y, He J, Wang A, Nicora CD, Fillmore TL a kol. Těžba proteomu lidské moči pro monitorování poškození ledvinového transplantátu. Mezinárodní ledviny. 2016; 89(6):1244–52. https://doi.org/10.1016/j. knit.2015.12.049 PMID: 27165815.

15. Sigdel TK, Ng YW, Lee S, Nicora CD, Qian WJ, Smith RD, et al. Perturbace v močovém exozomu při odmítnutí transplantátu. Hranice v medicíně. 2014; 1:57.

16. Yang JY, Sarwal MM. Genetika a genomika transplantací. Nature Reviews Genetics. 2017; 18(5):309–26.

17. Loupy A, Lefaucheur C, Vernerey D, Chang J, Hidalgo LG, Beuscart T a kol. Strategie molekulárního mikroskopu pro zlepšení stratifikace rizika při časném odmítnutí aloštěpu ledviny zprostředkované protilátkou. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 2014; 25(10):2267–77. Epub 2014/04/05.

18. Sigdel TK, Vitalone MJ, Tran TQ, Dai H, Hsieh SC, Salvatierra O a kol. Rychlý neinvazivní test pro detekci poškození ledvinového transplantátu. Transplantace. 2013; 96(1):97-101. PMID: 23756769.

19. Hauser IA, Spiegler S, Kiss E, Gauer S, Sichler O, Scheuermann EH, et al. Predikce akutní rejekce renálního aloštěpu močovým monokinem vyvolaným IFN-gama (MIG). Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 2005; 16(6):1849–58.

20. Hu H, Kwun J, Aizenstein BD, Knechtle SJ. Neinvazivní detekce akutních a chronických poranění při transplantaci ledvin u člověka zvýšením množství cytokinů/chemokinů v moči. Transplantace. 2009; 87(12):1814–20. PMID: 19543058.

21. Jackson JA, Kim EJ, Begley B, Cheeseman J, Harden T, Perez SD, et al. Močové chemokiny CXCL9 a CXCL10 jsou neinvazivními markery rejekce renálního aloštěpu a virové infekce BK. Americký žurnál transplantací: oficiální žurnál Americké transplantační společnosti a Americké společnosti transplantačních chirurgů. 2011; 11(10):2228–34.

22. Schaub S, Nickerson P, Rush D, Mayr M, Hess C, Golian M, et al. Hladiny CXCL9 a CXCL10 v moči korelují s rozsahem subklinické tubulitidy. Americký žurnál transplantací: oficiální žurnál Americké transplantační společnosti a Americké společnosti transplantačních chirurgů. 2009; 9 (6): 1347–53.

23. Segerer S, Cui Y, Eitner F, Goodpaster T, Hudkins KL, Mack M a kol. Exprese chemokinů a chemokinových receptorů během odmítnutí lidského ledvinového transplantátu. Americký žurnál onemocnění ledvin: oficiální žurnál National Kidney Foundation. 2001; 37(3):518–31. PMID: 11228176.

24. Tatapudi RR, Muthukumar T, Dadhania D, Ding R, Li B, Sharma VK a kol. Neinvazivní detekce zánětu renálního aloštěpu měřením mRNA pro IP-10 a CXCR3 v moči. Mezinárodní ledviny. 2004; 65(6):2390–7.

25. Menon MC, Murphy B, Heeger PS. Posun biomarkerů směrem ke klinické implementaci při transplantaci ledvin. JASN. 2017.

26. Naesens M, Anglicheau D. Precision Transplant Medicine: Biomarkers to the Rescue. JASN. 2017.

27. Khatri P, Roedder S, Kimura N, De Visser K, Morgan AA, Gong Y a kol. Společný rejekční modul (CRM) pro akutní rejekci napříč více orgány identifikuje nová terapeutika pro transplantaci orgánů. Časopis experimentální medicíny. 2013; 210(11):2205–21.

28. Sigdel TK, Bestard O, Tran TQ, Hsieh SC, Roedder S, Damm I a kol. Výpočetní skóre genové exprese pro predikci imunitního poškození u renálních aloštěpů. PloS jedna. 2015; 10(9):e0138133.

29. Secrets A, Yang JYC, Vanaudenaerde BM, Sigdel TK, Liberto JM, Damm I a kol. Společný modul rejekce při chronické rejekci po transplantaci plic. PloS jedna. 2018; 13(10):e0205107. Epub 2018/10/06.

30. Sis B, Mengel M, Haas M, Colvin RB, Halloran PF, Racusen LC a kol. Zpráva ze zasedání Banff '09: zhoršení štěpu zprostředkované protilátkami a implementace pracovních skupin Banff. Americký žurnál transplantací: oficiální žurnál Americké transplantační společnosti a Americké společnosti transplantačních chirurgů. 2010; 10(3):464-71.

31. Solez K, Colvin RB, Racusen LC, Haas M, Sis B, Mengel M a kol. Banff 07 klasifikace patologie renálního aloštěpu: aktualizace a budoucí směry. Americký žurnál transplantací: oficiální žurnál Americké transplantační společnosti a Americké společnosti transplantačních chirurgů. 2008; 8 (4): 753-60.

32. Sarwal MM, Ettenger RB, Dharnidharka V, Benfield M, Mathias R, Portale A, et al. Úplné vyhýbání se steroidům je účinné a bezpečné u dětí po transplantaci ledvin: multicentrická randomizovaná studie s tříletým sledováním. Americký žurnál transplantací: oficiální žurnál Americké transplantační společnosti a Americké společnosti transplantačních chirurgů. 2012; 12(10):2719–29.

33. Racusen LC. Banffovo schéma a diferenciální diagnostika dysfunkce aloštěpu. Transplantační řízení. 2004; 36(3):753–4.

34. Jianghua C, Wenqing X, Huiping W, Juan J, Jianyong W, Qiang H. C4d jako významný prediktor humorální rejekce u renálních aloštěpů. Klinická transplantace. 2005; 19(6):785-91.

35. Crespo M, Pascual M, Tolkoff-Rubin N, Mauiyyedi S, Collins AB, Fitzpatrick D, a kol. Akutní humorální rejekce u příjemců renálního aloštěpu: I. Incidence, sérologie a klinické charakteristiky. Transplantace. 2001; 71(5):652-8. PMID: 11292296.

36. Keslar KS, Lin M, Zmijewska AA, Sigdel TK, Tran TQ, Ma L, et al. Multicentrické hodnocení standardizovaného protokolu pro neinvazivní profilování genové exprese. AJT. 2013.

37. Montojo J, Zuberi K, Rodriguez H, Bader GD, Morris Q. GeneMANIA: Konstrukce rychlé genové sítě a predikce funkcí pro Cytoscape. F1000 Research. 2014; 3:153.

38. Der SD, Zhou A, Williams BR, Silverman RH. Identifikace genů odlišně regulovaných interferonem alfa, beta nebo gama pomocí oligonukleotidových čipů. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1998; 95(26):15623–8.

39. Hartono C, Muthukumar T, Suthanthiran M. Neinvazivní diagnostika akutní rejekce renálních aloštěpů. Současný názor na transplantaci orgánů. 2010; 15(1):35–41. https://doi.org/10.1097/MOT. 0b013e3283342728 PMID: 19935064.

40. Lazzeri E, Rotondi M, Mazzinghi B, Lasagni L, Buonamano A, Rosati A a kol. Vysoká exprese CXCL10 v odmítnutých ledvinách a prediktivní úloha séra CXCL10 před transplantací při akutní rejekci a chronické nefropatii aloštěpu. Transplantace. 2005; 79(9):1215–20. PMID: 15880073.

41. Matz M, Beyer J, Wunsch D, Mashreghi MF, Seiler M, Pratschke J, et al. Časná potransplantační exprese IP-10 v moči po transplantaci ledviny předpovídá krátkodobou a dlouhodobou funkci štěpu. Mezinárodní ledviny. 2006; 69(9):1683–90.

42. Simon T, Opelz G, Wiesel M, Ott RC, Susal C. Sériová měření exprese genu perforinu a granzymu B v periferní krvi pro predikci akutní rejekce u příjemců ledvinového štěpu. Americký žurnál transplantací: oficiální žurnál Americké transplantační společnosti a Americké společnosti transplantačních chirurgů. 2003; 3(9):1121–7. PMID: 12919092.

43. Yannaraki M, Rebibou JM, Ducloux D, Saas P, Duperrier A, Felix S, et al. Močové cytotoxické molekulární markery pro neinvazivní diagnostiku akutní rejekce ledvinového transplantátu. Transplant international: oficiální časopis Evropské společnosti pro transplantaci orgánů. 2006; 19(9):759–68. https://doi.org/10. 1111/j.{8}}.2006.00351.x PMID: 16918537.

44. Yang JYC, Verleden SE, Zarinsefat A, Vanaudenaerde BM, Vos R, Verleden GM a kol. Bezbuněčná DNA a CXCL10 odvozené z bronchoalveolární laváž předpovídají přežití transplantace plic. J Clin Med. 2019; 8(2). Epub 20. 2. 2019.

45. Faddoul G, Nadkarni GN, Bridges ND, Goebel J, Hricik DE, Formica R, et al. Analýza biomarkerů během počátečních 2 let po transplantaci a 5-výsledků transplantace ledvin po roce: výsledky klinických studií při transplantaci orgánů-17. Transplantace. 2018; 102(4):673-80. Epub 12. 12. 2017.

46. ​​Hricik DE, Nickerson P, Formica RN, Poggio ED, Rush D, Newell KA, et al. Multicentrická validace močového CXCL9 jako biomarkeru pro stratifikaci rizika pro poškození transplantace ledvin. Americký žurnál transplantací: oficiální žurnál Americké transplantační společnosti a Americké společnosti transplantačních chirurgů. 2013; 13(10):2634–44. Epub 24. 8. 2013.

47. Kotsch K, Kunert K, Merk V, Reutzel-Selke A, Pascher A, Fritzsche F a kol. Nové markery v biopsiích ledvin v nulté hodině ukazují kvalitu štěpu a klinický výsledek. Transplantace. 2010; 90(9):958–65. Epub 23. září 2010. PMID: 20859252.