Abstraktní: Polyfenoly jsou známé dietetické antioxidanty. Nedávno vzbudily značný zájem o použití k prevenci stárnutí kůže a hyperpigmentaci v důsledku slunečního UV záření. Listy Prunus persica (L.) jsou považovány za vedlejší produkty a uvádí se, že mají pozoruhodnou antioxidační aktivitu díky vysokému obsahu polyfenolů. Tato studie se zaměřila na vývoj kosmetického krému proti stárnutí a bělení pleti s použitím etanolového extraktu z listů Prunus persica (L.) (PPEE) s obsahem pevných lipidových nanočástic (SLN) pro zlepšení dodávání pleti. Chemické zkoumání PPEE ukázalo významně vysoký celkový obsah fenolů a flavonoidů s významnými antioxidačními aktivitami (stanovení DPPH, ABTS a -karoten). Jedinečný acylovaný kaempferolový glykosid se vzácnou strukturou, kaempferol 3-O- -4C1-(600 -O-3,4-dihydroxyfenylacetylglukopyranosid) ( KDPAG) byl izolován poprvé a jeho struktura byla plně objasněna. Představuje první příklad acylace 3,{{10}}dihydroxy fenyloctovou kyselinou v chemii flavonoidů. Studie cytotoxicity in vitro proti buněčné linii lidských keratinocytů odhalily netoxicitu PPEE a PPEE-SLN. Navíc PPEE, PPEE-SLNs a KDPAG vykazovaly dobrou antielastázovou aktivitu, srovnatelnou s aktivitou N(methoxysukcinyl)-Ala-Ala-Pro-Val-chlormethylketonu. Kromě toho PPEE-SLN a KDPAG vykazovaly významně (p < 0,001) vyšší anti-kolagenázové a antityrosinázové aktivity ve srovnání s EDTA a kyselinou kojovou, v daném pořadí. Různé krémy PPEE-SLNs (2 procenta a 5 procent) byly hodnoceny na možnou aktivitu proti vráskám proti stárnutí způsobenému UV zářením na myším modelu pomocí metody hodnocení vrásek a bylo prokázáno, že nabízí vysoce významný ochranný účinek proti UV záření, jak bylo prokázáno. tkáňovými biomarkery (SOD) a histopatologickými studiemi. Současná studie tedy ukazuje, že vedlejší produkty z listů Prunus persica představují zajímavý a cenný zdroj přírodních kosmetických přísad. To poskytuje související data pro další studium potenciálního bezpečného použití PPEE-SLN v topických kosmetických přípravcích proti stárnutí se zlepšenými vlastnostmi prostupu kůží.

Podle relevantních studiícistancheje obyčejná bylina, která je známá jako "zázračná bylina, která prodlužuje život". Jeho hlavní složkou jecistanosid, která má různé účinky jako napřantioxidant, protizánětlivé, apodpora imunitních funkcí. Mechanismus mezi cistanche abělení kůžespočívá v antioxidačním účinkucistanche glykosidy. Melanin v lidské kůži je produkován oxidací tyrosinu katalyzovanoutyrosinázaa oxidační reakce vyžaduje účast kyslíku, takže se volné radikály v těle stávají důležitým faktorem ovlivňujícím produkci melaninu. Cistanche obsahuje cistanosid, což je antioxidant a může tak snížit tvorbu volných radikálů v těleinhibující produkci melaninu.

Klikněte na Cistanche Supplement For Whitening

Další informace:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

1. Úvod

Stárnutí kůže je komplexní multifaktoriální progresivní proces, který katalyzuje fyzické změny v kůži a pojivové tkáni [1]. Dělí se na vnitřní a vnější stárnutí.

Vnější stárnutí kůže je důsledkem především faktorů životního prostředí, jako jsou znečišťující látky, kouření a životní stres, nebo především opakované vystavení UV záření (fotostárnutí) [2].

Nadměrná expozice UV záření stimuluje nadprodukci reaktivních forem kyslíku (ROS), což má za následek endogenní oxidační stres v kožních tkáních vedoucí k degradaci složek extracelulární matrix (ECM). Degradace ECM je přímo spojena se stárnutím kůže a je zodpovědná za zvýšení aktivity určitých enzymů, jako je kolagenáza, elastáza a tyrosináza, které se podílejí na stárnutí kůže. Tyto aktivace dermálních enzymů způsobují snížení hladiny elastinu a kolagenu, což vede ke ztrátě elasticity a pevnosti kůže a vzniku vrásek [3]. Také indukce nadměrné produkce melaninu a opálení kůže má za následek hyperpigmentaci pokožky.

Stárnutí kůže lze tedy předcházet antioxidanty s aktivitou vychytávání volných radikálů, což může mít velký význam v obraně a terapii onemocnění souvisejících s věkem zahrnujících ROS [4]. Dalším způsobem, jak zpomalit stárnutí, je použití inhibitorů elastázy, kolagenázy a tyrosinázy, které jsou velmi silnými kandidáty pro aktivity proti vráskám a bělení kůže, podporují zachování elasticity kůže a mohou být běžným přístupem k řešení poruch pigmentace [5].

Bylo publikováno, že přírodní antioxidanty izolované z rostlin zmírňují riziko fotostárnutí způsobeného UV zářením in-vitro i in-vivo [6] a jsou výhodnější jako kosmetické přísady než syntetické antioxidanty s ohledem na cenu a vedlejší účinky. Kromě toho mnoho studií in vitro a in vivo ukázalo, že fenolové sloučeniny, jako jsou fenolové kyseliny, flavonoidy a taniny, mohou vychytávat volné radikály a inhibovat enzymy elastázu, kolagenázu a tyrosinázu [7].

Bylo popsáno použití přírodních antioxidantů v topických přípravcích k ochraně kůže před oxidačním stresem způsobeným vnějšími faktory [8]. Většina antioxidačních molekul je však vrozeně nestabilní a může snadno oxidovat za vzniku neaktivních sloučenin, než dosáhnou místa působení, což ztěžuje jejich formulaci do vhodného a stabilního kosmetického produktu. Tato zjištění dokazují nezbytnost unikátních aplikačních systémů pro posílení těchto antioxidačních formulací [9].

Propustnost lokálně aplikovaných polyfenolů ovlivňuje několik faktorů; fenolická podtřída, její struktura, její molekulová velikost a glykosidová nebo aglykonová forma, stejně jako další složky formulace. Nicméně interakce s kožními složkami prostřednictvím směsi fyzikálních a chemických metod by mohla zlepšit propustnost prostřednictvím reverzibilního narušení bariérové ​​struktury vrstvy stratum corneum. Enkapsulační přístupy jsou jednou z nejběžněji používaných metod zvyšujících propustnost ke snadné stabilizaci polyfenolických látek během skladování, zvýšení jejich antioxidačních účinků, dermální absorpce a penetrace v kosmetických a topických terapiích. Mezi nově vyvinuté technologie zapouzdření patří nanoemulze, transferázy, pevné lipidové nanočástice, nanokrystaly a ribozomy [10].

Pevné lipidové nanočástice (SLN) jsou stabilním systémem dodávání pleťových produktů. SLN jsou považovány za slibné nosiče léčiv pro topické formulace díky své fotostabilitě, vlastnostem řízeného uvolňování, okluzivitě, účinkům maskování zápachu a zlepšení pronikání aktivních složek kůží zvýšením její hydratace bez známek podráždění pokožky, kromě jednoduchosti. produkce, nízká toxicita a fyzikální stabilita [9,11].

Na celém světě existuje asi 2000 kultivarů broskvoní [12]. Prunus (Rosaceae) je slavný rostlinný rod, který zahrnuje druhy bohaté na fenoly [13–15]. Některé druhy tohoto rodu se pěstují v Egyptě pro své jedlé plody nebo jako okrasné rostliny [16].

Prunus persica (L.) Batch (PP) je malý strom s lysými větvičkami a krátkým kmenem, rozložitou, zaoblenou korunou [12] a běžně se pěstuje v západní Asii, Evropě, Indii a severní Africe [17]. Tradičně se jeho listy používaly jako diuretika, laxativa, vermifugy, insekticidy, sedativa, při černém kašli, při léčbě leukodermie a jako febrifugy [17]. Dále farmakologické studie na listech charakterizovaly jejich in vivo antidiabetický, spasmogenní účinek, protizánětlivý, antikoagulační, hepatoprotektivní, antimalarický, antiastmatický a in vitro cytotoxický, antimikrobiální a inhibiční oxid dusnatý s významnými antioxidačními aktivitami. [18–22].

Bylo provedeno mnoho studií, které zkoumaly fenolický profil následovníků PP, ovoce a semen, jejich antioxidační aktivity a farmakologické a nutriční hodnoty [13,14,23,24]. O listech však byly k dispozici velmi vzácné údaje. K dnešnímu dni je k dispozici jediná zpráva popisující izolaci pěti flavonolových glykosidů z ethanolového listového extraktu [25]. Dále byly charakterizovány fenolické sloučeniny, včetně fenolových kyselin a flflavonoidů pomocí HPLC-MS analýzy s flflavonoly jako dominantními látkami mezi všemi stanovenými sloučeninami [20,26].

Kromě toho, ačkoli se uvádí, že PP semena, plody, následovníci a další druhy mají in vivo ochrannou aktivitu proti stárnutí vyvolanému UV zářením a in vitro aktivity proti vráskám a bělení kůže [15,23,27–32], u extraktu z listů PP nebylo nikdy hlášeno.

Velké množství listů PP jsou vedlejší produkty pocházející z pěstování broskvoní a konzervárenského průmyslu [33]. Vedlejší produkty PP semen, plodů a dalších listových odrůd byly hodnoceny v kosmetice a jako dietní potraviny pro potenciální zhodnocení [32,34,35]. Nicméně, pokud je nám známo, listy vedlejší produkty PP var. Florida Prince nebyl nikdy zkoumán a mohl by být zajímavým zdrojem fytochemikálií. Ve srovnání s jinými průmyslovými odvětvími je kosmetický trh dostupnější a expandující a může být zdrojem pro zhodnocení vedlejších produktů [15]. Produkty péče o pleť a stárnutí pleti jsou některé z nejdůležitějších kosmetických potenciálů.

V pokračování našeho výzkumu polyfenolických látek egyptských jedlých rostlin [36] a protože listy PP jsou považovány za vedlejší produkty a bylo hlášeno, že mají významnou antioxidační aktivitu zejména kvůli vysokému obsahu flavonolů, je cílem této studie vystavit PPEE rozsáhlé fytochemické analýzu jeho fenolického profilu a začlenění PPEE do nabitých SLN jako jedinečného systému dodávání pokožky. Dále byl hodnocen kosmetický potenciál proti stárnutí a bělení pokožky zkoumáním antioxidační aktivity PPEE, PPEE-SLN a izolovaných složek in vitro spolu s hodnocením jejich inhibičních účinků proti enzymům souvisejícím s pokožkou. Kromě začlenění PPEE-SLNs do topického kosmetického krému proti stárnutí a testování bezpečnosti produktu, jakož i vyhodnocení možné in-vivo protivráskové aktivity krémových formulací PPEE-SLNs proti stárnutí způsobenému UV zářením v model myši. To by mohlo poskytnout data pro další studium potenciálního použití listů PPEE-SLN v topických formulacích se zvýšenou permeací kůží.

2. Materiál a metody

2.1. Všeobecné

2.2. Rostlinné materiály

2.3. Příprava rostlinného extraktu 

2.4. Stanovení celkového obsahu polyfenolů (TPC) 

K odhadu množství celkového obsahu fenolů v PPEE, prezentovaného jako mg ekvivalentu kyseliny gallové/g suchého extraktu, bylo použito Folin-Ciocalteuovo činidlo popsané v Li et al., [37].

2.5. Stanovení celkového obsahu flavonoidů (TFC)

K odhadu celkového obsahu flavonoidů byla použita kolorimetrická metoda chloridu hlinitého popsaná Bahromun et al., [38]. Výsledky jsou uvedeny jako mg ekvivalent kvercetinu/g suchého extraktu.

2.6. Frakcionace PPEE a izolace sloučeniny 1

2.7. Identifikace kempferolu 3-O- -4C1-(6"-O-3,4-dihydroxyfenylacetylglukopyranosidu) (1)

2.8. Studie in vitro

Buněčná linie lidských keratinocytů byla získána od VACSERA CO. (Egyptská společnost na výrobu vakcín, séra a léčiv, Gíza, Egypt). MTT test byl proveden pro PPEE a PPEE-SLN podle metody Mostafa et al. [36].

Test DPPH byl proveden za použití metody Yardpiroon et al. [39] a vitamin C byl použit jako pozitivní kontrola. Test ABTS se řídil metodou Re et al., [40], jako standard byl použit vitamin C. Test bělení -karotenem používal metodu popsanou Soulefem et al., [14] v přítomnosti pozitivní kontroly BHT. Hodnota pro každý testovaný vzorek byla prezentována jako inhibiční křivka při 50 procentech nebo IC50.

Aktivita proti stárnutí a bělení kůže byla hodnocena podle metod publikovaných Mostafou et al. [41]. Pro antielastázový test byl 1 ug/ml lidské leukocytární elastázy inkubován s HEPES pufrem pH 7,5 a každým z testovaných extraktů nebo 1,4 mg/ml N-methoxysukcinyl-Ala-Ala-Pro-chlormethylketonu (standardní inhibitor) v 96-jamkovou destičku po dobu 20 minut při teplotě místnosti před přidáním 100 ul 1 mM N-methoxysukcinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilidu jako substrátu. Po 40 minutách inkubace byla měřena absorbance při 405 nm s jamkou bez extraktu/inhibitoru sloužící jako slepý pokus. Testované vzorky byly použity v koncentračním rozmezí 25–300 µg/ml.

2.9. Formulace a charakterizace PPEE-SLN

Formulace byla provedena podle metody Choubey et al. [11]. Nejprve byl glycerylmonostearát rozpuštěn ve směsi chloroform-methanol (1:1) a poté byl v tomto roztoku dispergován ethanolový extrakt. Později byla organická rozpouštědla odstraněna pomocí rotační odparky a roztok byl zahříván. Poté byl přidán Tween 80 a směs byla míchána při 3000 otáčkách za minutu po dobu 30 minut a poté homogenizována po dobu 4 hodin před filtrací a sušením. Charakterizace PPEE-SLN byla zkoumána pomocí odhadu tvaru a morfologie povrchu, velikosti částic, indexu polydisperzity (PDI), analýzy zeta potenciálu, procentuální účinnosti zachycení (PEE) a infračervené spektroskopie s Fourierovou transformací (FT-IR).

2.10. Příprava topických krémů PPEE

Dvě formulace krému (2 procenta a 5 procent PPEE-SLN) byly připraveny, jak je uvedeno v tabulce 1 podle metody Mahawar et al. [42].

Organoleptické vlastnosti, pH krému, studie roztíratelnosti, test viskozity, test homogenity, náplastový test (Burchardův test), in vitro vyšetření kožní permeace a studie stability (směrnice ICH) byly hodnoceny podle Matangi et al. [43]. Mikrobiální limitní test byl proveden podle Sekar et al. [44].

2.11. In-vivo studie proti vráskám krému PPEE-SLN

Padesát samců bezsrstých myší (HR{{0}}) (ve věku 4-týden), 17–24 g, bylo získáno od společnosti VACSERA. Experiment byl proveden po schválení etickou komisí na Říjnové univerzitě pro moderní vědy a umění (MSA), velikost vzorku s číslem protokolu (PG1/EC1/2020PD) byla stanovena podle softwaru (G. Power). Jeden týden před in vivo studií proti vráskám měly myši volný přístup k potravě a vodě a aklimatizovaly se na klimatizovanou místnost (23 ± 2 ◦C). Myši (50) byly rozděleny do pěti skupin, náhodně (n=10), jak je uvedeno v tabulce 2. Léčba byla prováděna po dobu 40 dnů, třikrát týdně, s 0,5 g krému PPEE-SLNs nebo jakýmkoli jiným způsobem a aplikováno na dorzální kůži myši a následně vystavena UV (365 nm).

Před a po lokální léčbě byly dvakrát týdně pořízeny snímky dorzální kůže myší. Hodnocení vrásek na kůži bylo hodnoceno pomocí Bissettovy vizuální škály vrásek [45]. Základem pro hodnotící stupnici byla textura vrásek (jemné nebo hrubé) a keratózy, rozdělené do pěti stupňů: horší (−2), mírně horší (−1), žádná změna (0), mírně zlepšená ( plus 1) a vylepšené (plus 2).

Histologické hodnocení bylo provedeno podle metody Elder et al. [46].

2.11.4. Aktivita superoxiddismutázy (SOD).

Aktivita SOD byla odhadnuta podle metody Ukeda et al. [47].

2.12. Statistická analýza

3. Výsledky

3.1. Celkový obsah fenolů a flavonoidů

TPC byl stanoven spektrofotometricky v PPEE jako 387,5 ± 4,28 mg GAE/g extraktu. Také TFC byl odhadnut jako 241,7 ± 3,25 mg QE/g extraktu. PPEE vykazovaly vysoké koncentrace fenolických a flavonoidních sloučenin. Oba výsledky odpovídají hodnotám dříve uváděným pro extrakty z listů PP, které potvrzují, že flavonoidy jsou hlavními chemickými složkami listů PP [20].

3.2. Izolace a struktura Objasnění kaempferolu

3-O- - 4C1-(600 -O-3,4-dihydroxyfenylacetylglukopyranosid), sloučenina 1

Po vytřídění všech známých struktur v tomto extraktu se hledání jedinečných, potenciálně biologicky aktivních sloučenin stalo efektivnější. Podle obdržených 2-analytických dat DPC bylo zjištěno, že fenolické látky PPEE se nejlépe frakcionují na gelové koloně MCI eluované směsmi MeOH/H2O s klesající polaritou, což je proces, který poskytuje čtyři hlavní frakce kolony. Amorfní materiál byl oddělen od horkého koncentrátu frakce III (desorbovaný z kolony 70% vodným MeOH) stáním přes noc při teplotě místnosti. Krystalizace tohoto materiálu dvakrát z vroucího EtOH poskytla chromatograficky čistý hnědožlutý amorfní prášek 1. Vykazoval chromatografické vlastnosti (tmavě fialová skvrna na PC pod UV světlem, měnící se na citronově žlutou, když se dýmá parami amoniaku se střední migrací ve vodných a organických rozpouštědlech ) a barevné reakce (citronově žlutá barva s Naturstoffovým činidlem), které naznačovaly, že derivát kaempferolu nesoucí volnou hydroxylovou skupinu 40 a O-substituovanou 3--polohu O. UV spektra 1 v MeOH (268 nm, 316 nm, 360 nm) a po přidání diagnostických posunových činidel [48] byla typická pro 3-O-glykosylovaný kaempferol (pozitivní posun s NaOAc, stabilní posun s NaOMe). Normální kyselou hydrolýzou 1 (2N vodná HCl, 3 h, 100 ◦C) byla získána glukóza (srovnávací papírová chromatografie, Co-PC), kempferol a kyselina 3,4-dihydroxyfenyloctová (UV absorpční a1H-NMR spektra, pro jednotlivé vzorky, izolované preparativními papírovými chromatogramy ethylacetátového extraktu hydrolyzátu). V důsledku toho 1 je kaempferol 3-0-(3,4-dihydroxyfenylacetylglukosid). Sloučenina se získá nezměněná po inkubaci s enzymem -glukosidázou po dobu 24 hodin, čímž se prokáže, že glukosylová skupina je acylována. Molekulární vzorec 1 byl uzavřen jako C29H26O14 z jeho negativního hmotnostního spektra HRESI, které ukázalo [MH]- iont při m/z=597,5302 (vypočteno pro C29H25O14, 597,5015). Experiment ESI-MS (negativní iontový mód) poskytl kvazimolekulární iontový pík [MH]- při m/z: 597, což ukazuje na molekulovou hmotnost 598 pro 1. Další píky fragmentových iontů ve spektru ESI-MS-MS byly pozorované při m/z: [MH]-: 447, 167 a 285 odpovídající ztrátě dihydroxyfenylacetátu z mateřské sloučeniny 1, zatímco fragmentové ionty při m/z 285 a m/z 167 byly připsány kaempferolu a části kyseliny dihydroxyfenyloctové, v daném pořadí. K určení místa připojení všech skupin v molekule 1 a umožnění úplného přiřazení všech uhlíkových a protonových rezonancí NMR spektroskopická analýza 1, včetně 1D- 1H a 13C, a 2D-HSQC a HMBC , byla poté provedena. Z pěti signálů v oblasti cukru mezi 5 ppm 62,25 a 76,9 a z anomerního uhlíkového signálu umístěného na 99,13 ppm bylo prokázáno, že cukerná část musí být připojena k poloze 3 kempferolu, protože tento C-3 uhlíkový signál byl posunut směrem nahoru a odpovídající ortho a para-uhlíkové signály byly posunuty směrem dolů (viz experiment). Podobné posuny jsou známé z práce Nawwar et al. [48]. To bylo dále potvrzeno 3J korelacemi s dlouhým dosahem rozpoznávaným ve spektru HMBC, přičemž byl nalezen jeden křížový signál korelující signál anomerního glukózového protonu H-100 při 5 5,42 k uhlíku flavonolu C-3 signál na 5 133,5. -Konfigurace glukózové skupiny byla odvozena z chemického posunu C-100 při 99,13 ppm. Hodnoty chemického posunu uhlíků cukru potvrdily pyranózovou formu této skupiny [48]. 'H-NMR spektrum 1 také odpovídalo navržené struktuře. Chemický posun anomerního protonového signálu při 5 5,42 ppm (d, J=8 Hz) indikoval, že anomerní uhlík je připojen ke skupině kaempferolu na C-3 (δppm 133,5) a určená vazebná konstanta 8 Hz, dokažte -konfiguraci glukózové skupiny. Konformace cukerné skupiny je 4C1, jak následují -konfigurace diskutované výše.

Také připojení skupiny 3,4-dihydroxyfenyloctové kyseliny k C-600 methylenglukopyranózové skupině následovalo z posunu signálu tohoto uhlíku směrem dolů na 5 ppm 62,25 v 13C-NMR spektru. To bylo dále potvrzeno křížovým píkem ve spektru HMBC, korelujícím signály protonů methylenové glukózy při 5 4,04 (H-600 a) a 5 4,2 ppm (H-600b) s karbonylovým uhlíkem 3,4-dihydroxyfenyloctová část kyseliny při 5 176,26 ppm. Tyto a výše uvedené údaje nakonec potvrdily strukturu sloučeniny 1 jako nový kaempferol 3-O- - 4C1-(600 -O-3,{ {24}}dihydroxyfenylacetyl glukopyranosid) (KDPAG), který byl poprvé popsán v přírodě, protože představuje první acylaci kyselinou 3,4-hydroxyfenyloctovou ve spojení s chemií flavonoidů (obrázek 1).

Další informace: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501