3-adrenergní receptor na lymfocytech infiltrujících nádor udržuje expresi PD-L1 závislou na IFN- - a narušuje protinádorovou imunitu u neuroblastomu

Neuroblastom (NB) je heterogenní extrakraniální nádor vyskytující se v dětství. Charakteristickým rysem nádorů NB je jejich neuroendokrinní schopnost vylučovat katecholaminy, které zase prostřednictvím ligace -adrenergních receptorů mohou ovlivňovat různé signální dráhy v nádorovém mikroprostředí (TME). Již dříve bylo prokázáno, že specifický antagonismus 3-adrenergního receptoru (3- AR) na nádorových buňkách NB ovlivnil růst a progresi nádoru. Zde jsme se na myším syngenním modelu NB zaměřili na zkoumání, zda modulace 3-AR ovlivnila odpověď imunitního systému hostitele proti nádoru. Výsledky ukázaly, že 3-antagonismus AR vede k reaktivaci imunitní odpovědi, částečně závislé na zapojení signální osy PD-1/PD-L1. Blokáda 3- AR na lymfocytech infiltrujících nádor (TIL) skutečně tlumila jejich schopnost sekretovat IFN-, což následně snižovalo expresi PD-L1 způsobenou infiltrací TIL na nádorových buňkách NB. Další výzkumy prostřednictvím genomické analýzy u pacientů s NB ukázaly, že vysoká exprese genu ADRB3 koreluje s horšími klinickými výsledky ve srovnání se skupinou s nízkou expresí a že exprese genu ADRB3 ovlivňuje různé imunitní dráhy. Celkově výsledky naznačují, že 3-AR v NB TME je schopen modulovat interakci mezi nádorem a imunitním systémem hostitele a že jeho antagonismus zasahuje do více protumorálních signálních drah.

Grafický Abstrakt

ÚVOD

Neuroblastom (NB) je komplexní a heterogenní onemocnění a nejčastější typ rakoviny diagnostikovaný v prvním roce života. NB je neuroendokrinní nádor, který vzniká z angažovaných prekurzorových buněk neurální lišty během vývoje sympatického nervového systému (SNS). Tento výrazný původ určuje lokalizaci nádoru, který se obvykle vyskytuje v nadledvinách a/nebo sympatických gangliích [1]. Klinické chování NB je velmi variabilní, od nádorů, které spontánně regredují, po jiné, které se staly refrakterními na všechny dostupné terapie včetně intenzivní chemoterapie, chirurgie, radioterapie, autologní transplantace kmenových buněk a podávání retinoidů (13-cis-retinoických kyselina) [2]. Proto jsou potřebné alternativní terapeutické cíle pro tyto nereagující nádory. Imunoterapie založená na inhibitorech imunitního kontrolního bodu (ICI) představuje nejslibnější strategii pro několik solidních nádorů [3]. Signální osa ligandu programované smrti-1/programované smrti-1 (PD-L1/PD-1) mimo jiné narušuje imunitu efektorových T buněk a zvyšuje imunitní toleranci nádorových buněk, což hraje klíčovou roli roli při zmírňování protinádorových reakcí u myších i lidských rakovin [4, 5]. Zatímco však četné studie již zkoumaly mechanismy, které jsou základem signalizace PD-1/PD-L1 u rakoviny dospělých, o dětských nádorech je známo jen málo. Komplexní cross-talk mezi SNS a imunitním systémem prostřednictvím uvolňování katecholaminů a aktivace signalizace -adrenergních receptorů je schopen určit osud progrese nádoru u mnoha nádorů [6]. To by mohlo platit zejména u pacientů s NB, u kterých zvýšené hladiny katecholaminů skutečně odrážejí závažnost malignity [7]. Subtyp 3-adrenergního receptoru (3-AR) byl nedávno identifikován jako kritický regulátor rakoviny [8–10]. Zejména jeho exprese a aktivace, jak na nádorových, tak stromálních buňkách nádorového mikroprostředí (TME), vyvolala v různých preklinických modelech protumorální signální dráhy zodpovědné za progresi nádoru [11–14]. Zde jsme na syngenním myším modelu NB prokázali, že 3-AR na tumor-infiltrujících lymfocytech (TIL) udržuje IFN- - závislou upregulaci PD-L1 na nádorových buňkách, což následně vede k imunosupresivní TME zodpovědný za únik nádoru. Kromě toho 3-antagonismus AR dokázal zvýšit počet imunitně reaktivních CD8+, přirozených zabíječů (NK) a dendritických buněk (DC) a snížit počet imunosupresivních regulačních T buňky (Treg) a supresorové buňky odvozené od myeloidů (MDSC) v TME. Kaplan-Meierova analýza dále ukázala, že vysoká exprese genu ADRB3 byla spojena se špatným přežitím pacientů s NB, a analýzy různých dostupných veřejných datových souborů exprese NB odhalily významnou korelaci mezi úrovní exprese genu ADRB3 a geny zapojenými do signálních drah souvisejících s interakce imunitního systému/nádoru.

Výhody cistanche tubulosa-Antitumor

METODY

Buněčná kultura

Myší rakovinné buňky NB Neuro-2A byly získány z ATCC (CCL-131) a byly pěstovány v DMEM doplněném 10 % FBS, 2 mM L-glutaminu, 100 U·ml-1 penicilinu a 100 ug·ml−1 streptomycinu při 37 stupních v atmosféře nasycené vodou, 5% CO2. Neuro{13}}a buňky byly rutinně testovány na kontaminaci mykoplazmaty.

Syngenní myší model nádoru

Samice myší NCI A/JCr staré 4 týdny byly zakoupeny od Charles River Laboratories (Frederick). Buňky Neuro{1}}a (N2A) byly subkutánně implantovány myším příjemcům A/J injekcí 1 × 106 buněk ve 100 ul PBS do pravého boku. Když N2A buňky vytvořily hmatatelný nádor (asi 8 dní), začala léčba. Léčba byla podávána dvakrát denně pro SR59230A (Tocris Bioscience) a vehikulum (fyziologický roztok) a v den 8 a den 12 pro protilátku PD-L1 (InVivoMAb anti-myší PD-L1 (B7-xhH1) #BE0101 , Bio X Cell) a izotypová kontrola (InVivoMAb krysí IgG2b izotypová kontrola # BE0090, Bio X Cell). Podávání izotypové kontroly IgG2b produkovalo stejné výsledky jako vehikula, proto je na obrázcích znázorněn pouze stav vehikula. SR59230A byl podáván v dávce 10 mg/kg ve fyziologickém roztoku intraperitoneálně (ip); 250 ug PD-L1 bylo podáno ip ve 100 ul ředicího pufru InVivoPure™ pH 6,5 (č. IP0065); 250 ug myší izotypové kontroly IgG2b bylo podáno ip ve 100 ul ředicího pufru InVivoPure™ pH 7,0 (č. IP0070). Léčba pomocí FTY720 (#6176, Tocris Biotechne) byla podávána v dávce 2 mg/kg per os (po) ode dne 6. Rychlost růstu nádoru byla hodnocena měřením nádorové hmoty pomocí kalibru a objem nádorové hmoty byl vypočten jako objem {{ 41}} [(délka × šířka)2 /2]. Myši byly usmrceny po 8 dnech léčby.

Western blot analýza

Buňky byly shromážděny a lyžovány v RIPA pufru obsahujícím koktejl inhibitorů proteázy. Po kvantifikaci bylo 20 ug celkových proteinů použito k provedení SDS-PAGE a WB analýzy. PVDF membrány byly přes noc inkubovány s primárními protilátkami anti-PD-L1 (ab238697, Abcam), fosfo-CREB (ab32096, Abcam), CREB (ab32515, Abcam), p-PKA / / (sc- 32968, Santa Cruz Biotechnology), -aktin (sc-1615, Santa Cruz Biotechnology), 3-AR (ab94506, Abcam) při 4 stupních a poté se specifickými sekundárními protilátkami po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Vazba protilátek se specifickými proteiny byla detekována pomocí substrátu Clarity Western ECL (Bio-Rad) a snímky byly pořízeny pomocí systému Chemidoc Imaging System (Biorad®). K provedení kvantitativních analýz byl použit software ImageJ a intenzita signálu pásů byla vyjádřena jako násobek zvýšení vzhledem ke kontrolním hodnotám.

Kokultivace pro cytofluorimetrický test PD-L1

Nádorové buňky byly nasazeny na MW24 (45, 000 buněk/jamka) a po 24 hodinách byly společně kultivovány s lymfocyty získanými z TDLN myší předem ošetřených po dobu 2 dnů vehikulem nebo SR59230A (T2) v poměr výsevu 1:10 (nádor/lymfocyty). Na konci celkové inkubační doby (48 h) byly lymfocyty odebrány spolu s médiem kokultury jemným pipetováním a poté byly nádorové buňky odděleny trypsinizací a označeny anti-PD-L1 protilátkou (CD274 Antibody { {17}}, eBioscience™) pro cytofluorimetrickou kvantifikaci. Obarvené buňky byly získány na MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer (Miltenyi Biotec, Gladbach, Německo) a data byla zpracována pomocí softwaru Flowlogic (Miltenyi Biotec, Gladbach, Německo).

Kokultivace pro imunofluorescenci PD-L1 a kvantifikaci IFN-

Nádorové buňky byly nasazeny na mikroskopická sklíčka (20, 000 buněk/jamka) v Nunc Lab-Tek komůrkovém sklíčku 4 a po 24 hodinách byly společně kultivovány s lymfocyty získanými z TDLN myší léčených po dobu 2 dnů vehikulem. nebo SR59230A (T2), v poměru 1:10 (nádor/lymfocyty). Po 48 hodinách byly lymfocyty v kultivačním médiu shromážděny jemným pipetováním a poté odstraněny centrifugací; supernatant byl použit ke kvantifikaci IFN- prostřednictvím technologie Luminex xMAP podle pokynů výrobce. Stručně, kvantifikace IFN- v kokultivačním médiu byla provedena pomocí Bio-Plex Pro Mouse Cytokine IFN-Set (#171G5017M, Bio-Rad) a data byla získána na systému MAGPIX (Luminex, Texas, USA). Analýza byla provedena pomocí softwaru Bio-Plex Manager™ (BIO-RAD, Kalifornie, USA). Nádorové buňky na mikroskopických sklíčkách byly místo toho použity k provedení imunofluorescenčního testu PDL1 následujícím způsobem. Pro imunofluorescenční analýzu byly buňky fixovány ve 3% paraformaldehydu v PBS po dobu 20 minut. Permeabilizace byla dosažena přidáním roztoku obsahujícího Tween-20 0,5% v PBS po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Buňky byly poté blokovány ve 3% BSA po dobu 1 hodiny a inkubovány s primární protilátkou anti-PD-L1 (ab238697, Abcam) po dobu 2 hodin. Následně, po promytí v PBS, byla sklíčka inkubována se sekundární protilátkou Alexa-fluor 488 po dobu 1 hodiny. Snímky byly získány pomocí fluorescenčního mikroskopu (DMi8 - Leica microsystems).

Čínská bylina cistanche rostlina-Protinádorová

siRNA elektroporace lymfocytů pro 1- 2- a 3-umlčení AR

Lymfocyty získané z TDLN byly transfekovány siRNA pro selektivní 1- (SASI_Mm01_00090154, sekvence: GUGAUCGUGGCCAUCGCCA, Merck), 2- (SASI_Mm{ {5}}, sekvence: CCAAGUUCGAGCGACUACA, Merck) a 3-AR (SASI_Mm01_00145466, sekvence: CAGUGGACGUGCUCUGUGU, Merck) umlčování. Stručně, lymfocyty byly elektroporovány siRNA (100 nM) za použití 4D-Nucleofector X Unit (Lonza) a P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTM X Kit (V4XP-3024, Lonza). Byl proveden program DN-100, specifický pro elektroporaci myších T buněk. Po elektroporaci byly lymfocyty kultivovány v TexMACS Medium (130-097-196, Miltenyi Biotec) po dobu 24 hodin a poté společně kultivovány s nádorovými buňkami N2A po dobu 48 hodin, jak bylo popsáno dříve, pro kvantifikaci PD-L1. Účinnost umlčování ARs v lymfocytech byla hodnocena pomocí digitální kapkové PCR následovně.

Digitální kapičková PCR pro kvantifikaci -ARs mRNA

RNA byla reverzně transkribována pomocí iScript Advanced cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad). ddPCR byla provedena pomocí ddPCR Supermix for Probes (bez dUTP) (Bio-Rad), podle pokynů výrobce, na systému QX200 (Bio-Rad) a C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad). Použité testy byly: Adrb3-FAM (dMmuCPE5088688), Adrb{8}}FAM (dMmuCPE5089938), Adrb1-FAM (dMmuCPE5100184), Rps18-HEX (dMmuCPE5196). Data ddPCR byla analyzována pomocí softwaru QuantaSoft™ (verze 1.7.4, Bio-Rad).

RNA-sekvenování

Vyříznuté nádory byly umístěny do pufru RLT (Qiagen) a mechanicky homogenizovány pomocí gentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec, Glad bach, Německo) za použití gentleMACS M Tubes (Miltenyi Biotec, Gladbach, Německo). Extrakce celkové RNA byla provedena pomocí RNeasy Plus Mini kit (Qiagen), podle pokynů výrobce. Kvantifikace RNA byla provedena za použití obou spektrofotometrů NanoDrop 2000/2000c (ThermoFisher) a Qubit RNA High Sensitivity (HS) (ThermoFisher). Integrita RNA byla hodnocena pomocí Agilent RNA 6000 Pico Kit na Agilent Bioanalyzer a všechny vzorky s číslem integrity RNA (RIN) nižším než 6,00 byly vyloučeny. Příprava knihovny byla provedena pomocí sady TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Gold Kit (Illumina) podle pokynů výrobce, s počátečním vstupem 500 ng celkové RNA. Kvalita knihovny byla hodnocena pomocí soupravy Agilent DNA 7500 kitu na Agilent Bioanalyzer, následovala kvantifikace knihovny pomocí IX dsDNA High Sensitivity (HS) (ThermoFisher). Knihovny byly sekvenovány na sekvenačním systému NextSeq 550 (Illumina) za použití souprav NextSeq 500/550 v2.5 (150 cyklů) High Output Reagent Kit (Illumina). Běhy byly provedeny s konfigurací 2 x 76 bp.

kvantifikace mRNA a transkriptomické analýzy

Losos (v. 1.5.1) v režimu založeném na mapování byl použit ke kvantifikaci transkriptů a referenčního transkriptomu musculus GRCm38.98. Výsledné soubory qf byly analyzovány statistickým jazykem R. K importu dat v R byl použit balíček tximport a přepisy byly sbaleny do genů pomocí balíčku AnnotationDbi a databáze org.Mm.eg.db. Nakonec jsme provedli statistické analýzy pomocí DESeq2. Provedli jsme analýzu nadměrného obohacení (ORA) pomocí balíčku ClusterProfiler k dotazu na databázi GO: BP s výslednými statistickými analýzami, abychom detekovali změněné buněčné dráhy. Abychom vybrali geny pro analýzu obohacení, nastavili jsme práh log2FC na 0.5 (| log2FC|⋝ 0.5) a upravenou hodnotu p na 0.{101} {17}}5. Po filtrování výsledků podle p-hodnoty 0,05 jsme získali 45 statisticky deregulovaných procesů mezi 15 158 testovanými proti databázi GO: BP.

Kvantifikace cytokinů Luminex

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche Enhance Immunity

【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Myši byly utraceny po 2 dnech léčby (T2) vehikulem, SR59230A, PD-L1 a SR59230A + PD-L1 a nádorová hmota byla vyříznuta nůžkami a homogenizována pomocí Bio-Plex Cell lysis kit (BIO-RAD, Kalifornie , USA) a gentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec, Německo). Nádorové lyzáty byly poté testovány na jejich koncentrace cytokinů testy Bio-Plex Pro™ (BIO-RAD, Kalifornie, USA) na základě technologie Luminex xMAP. Hladiny IFN-, TNF-, IL-2, IL-6, IL-10, GM-CSF, IL-1 a IL-1 (pg/ml ) byly měřeny podle pokynů výrobce. Data byla získána na systému MAGPIX (Luminex, Texas, USA) a analýza byla provedena pomocí softwaru Bio-Plex Manager™ (BIO-RAD, Kalifornie, USA).

Analýza průtokovou cytometrií

Analýza průtokovou cytometrií byla provedena na nádorových buňkách a subpopulacích imunitních buněk mikroprostředí nádoru následovně. Stručně řečeno, nádory byly homogenizovány pomocí soupravy Tumor disociation kit mouse (#130-096-730, Miltenyi Biotec) a lymfocyty infiltrující nádor byly izolovány z celkové buněčné suspenze pomocí myši CD45 (TIL) MicroBeads (#130-110- 618, Myš Miltenyi Biotec) nebo CD8 (TIL) MicroBeads (#130-116-478, Miltenyi Biotec) pomocí automatického separátoru Pro (Miltenyi Biotec) podle pokynů výrobce. Buňky byly poté inkubovány a obarveny různými vhodně zředěnými kombinacemi různých protilátek konjugovaných s fluorochromem (doplňková tabulka 1). Obarvené buňky byly analyzovány pomocí MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer (Miltenyi Biotec®) a data byla zpracována pomocí softwaru Flowlogic (Miltenyi Biotec®).

Imunofluorescence buněk a tkání

Imunofluorescenční analýza hmoty myšího nádoru byla provedena následovně. Vzorky byly rychle vyříznuty, fixovány v pufrovaném 4% formaldehydu po dobu 24 hodin a zality v parafinu. Ze vzorků byly vyříznuty histologické řezy o tloušťce 5 μm, byly zbaveny parafinu a vařeny 10 min v pufru citrátu sodného (10 mM, pH 6,0; Bio-Optica) pro získání antigenu a imunobarveny přes noc při 4 stupních s primárním protilátky (anti-PD-L1, ab238697, Abcam; anti- 3-AR, ab94506, Abcam; anti-CD4, 14-9766-82, eBioscience; anti-CD8, 14-0808-82, eBioscience; DBH, ab209487, Abcam). Imunitní reakce byla odhalena při inkubaci řezů se sekundárními protilátkami Alexa Fluor 488- konjugovaný IgG nebo Alexa Fluor 594-konjugovaný IgG (1:350; Jackson Laboratory). Po kontrastním barvení 4,6-diamidino-2-fenylindolem (DAPI) byly získány reprezentativní snímky mikroskopem Olympus BX63 spojeným s CellSens Dimension Imaging Software verze 1.6 (Olympus). Imunofluorescenční barvení bylo hodnoceno pomocí softwaru ImageJ (NIH, USA), protože intenzita fluorescence sledovaného proteinu byla normalizována na hodnoty DAPI.

Výhody cistanche tubulosa-Antitumor

Kaplan–Meierova a genová korelační analýza u pacientů s NB

Korelace genu ADRB3 s geny imunitního kontrolního bodu CD80, CTLA4, CD276, CD226, CD40LG, 4-1BBL a korelace mezi celkovým (OS) a pravděpodobností přežití bez události (EFS) u pacientů s NB a hladinami ARDB3 Exprese mRNA byla provedena s použitím profilu genové exprese 649 vzorků NB vytvořených pomocí 44K oligonukleotidových mikročipů. Profily a klinická data byly získány z platformy R2: genomická analýza a vizualizace (http://r2.amc.nl), (Kocak, vlastní ag44kcwolf, n=649 případů). Poslední kvartil distribuce byl použit jako mezní hodnota exprese pro vysokou versus nízkou expresi genu ADRB3 v Kaplan-Meierově analýze.

Statistika

Statistická analýza byla provedena pomocí GraphPad Prism (GraphPad, San Diego, CA, USA) jednocestnou nebo dvoucestnou analýzou rozptylu (ANOVA), následovanou Bonferroniho post-hoc testem nebo nepárovým studentským t-testem. Pro experimenty in vivo bylo podle předchozích studií na stejném zvířecím modelu [12] zapotřebí alespoň 6 myší na skupinu, aby byla zaručena síla 80 %. Hodnoty jsou uvedeny jako průměr ± SEM. Význam byl zvažován, když byl P<0.05 and described in each figure legend. Allocation concealment was performed using a randomization procedure (http:// www.randomizer.org/).

VÝSLEDEK

3-Antagonismus AR snižuje expresi PD-L1 v nádorových buňkách A/J myší nesoucích NB

Nedávné studie ukázaly, že signalizace PD-1/PD-L1 u NB představuje klíčový mechanismus pro omezení imunitního dozoru a že exprese PD-L1 koreluje s vysokými hladinami nádorových markerů [15, 16]. Vezmeme-li v úvahu tyto a naše předchozí údaje ukazující schopnost 3-blokády AR vyvolat imunitní kompetentní TME u myší s melanomem [13], zajímalo nás, zda u nádoru NB 3-AR antagonismus by mohl vést k aktivaci imunitní odpovědi závislé na zapojení signalizace PD-L1. Podávání 3-AR antagonisty, SR59230A, v myším syngenním modelu NB, snížilo růst nádoru ve větší míře než léčba anti-PD-L1 protilátkou mAb (PD-L1), ale nebyl pozorován žádný synergický účinek když byly myši léčeny oběma léky (obr. 1A, B). Abychom prozkoumali, zda protinádorový účinek způsobený podáváním SR59230A částečně spoléhá na modulaci exprese PD-L1, testovali jsme hladinu exprese PD-L1 v TME myší s NB. Je zajímavé, že imunofluorescence (obr. 1C) a analýza western blot (obr. 1D) na mase myšího nádoru ukázaly, že exprese PD-L1 byla snížena v TME u myší léčených 3-AR antagonistou ve srovnání s vehikulem. Vzhledem k tomu, že rozsáhlé literární údaje ukázaly, že u TME jsou kromě rakovinných buněk hlavními zdroji PD-L1 také stromální buňky, jako jsou antigen prezentující buňky (APC), MDSC, DC a makrofágy [17–20]. zkoumali, kde v TME byla úroveň exprese PD-L1 ovlivněna po blokádě 3-AR. Cytofluorometrický test odhalil, že 3-AR antagonismus snižoval expresi PD-L1 v nádorových buňkách (obr. 1E), zatímco zvyšoval hladinu jeho exprese v DC a makrofázích (obr. 1F, G). V populaci MDSC nebyly pozorovány žádné změny (obr. 1H). Tyto první výsledky ukazují, že blokáda 3-AR vykazovala významnou protinádorovou aktivitu v syngenním modelu myší nesoucích NB a že současné podávání protilátky PDL1 nevyvolalo protinádorový synergický účinek. Je zajímavé, že 3-farmakologický antagonismus AR moduloval hladinu exprese PDL1 v TME, což naznačuje zapojení signalizace PD-L1 do protinádorového účinku způsobeného blokádou 3-AR.

Obr. 1 Účinek léčby SR59230A a PD-L1 na růst nádoru a expresi PD-L1 u myší s nádorem NB

3-Antagonismus AR a podávání PD-L1 stimulují imunitně reaktivní TME v NB

Abychom prozkoumali, zda snížená exprese PD-L1, pozorovaná v nádorových buňkách NB po 3-AR antagonismu, vedla k imunitní reaktivaci u TME, nejprve jsme vyhodnotili počet perforinu pomocí PD-1+CD{ {4}} buněk v nádorové hmotě myší ošetřených SR59230A-, PD-L1- nebo SR59203A + PD-L1- ve srovnání s vehikulem (obr. 4A, B). Navíc test barvení Ki67 ukázal trend naznačující zvýšenou proliferaci CD8+ T buněk v NB nádorech myší léčených 3-AR antagonistou nebo PD-L1 protilátkou, i když se nepodařilo dosáhnout významné rozdíly (obr. 4C). Nakonec měření cytokinů ukázalo v nádorové hmotě myší léčených PDL{20}} zvýšenou hladinu cytokinů, o kterých je známo, že mají protinádorové účinky, jako je TNF-, IFN- a IL-6, a průvodní snížení imunosupresivního cytokinu IL-10. Překvapivě jsme u myší s NB léčených 3-AR antagonistou pozorovali zvýšení TNF- a IL-6 a snížení hladin IL-10 podle imunitního reaktivní stav naznačený vlastnostmi T buněk, ale snížená hladina IFN- (obr. 4D). U ostatních testovaných cytokinů (GMCSF, IL-2, IL-1 a IL-1) nebyly nalezeny žádné významné rozdíly. Společně tato data prokazují, že 3-antagonismus AR spouští hostitelskou imunitní odpověď v TME myší nesoucích NB, čímž se sledují stejné účinky pozorované po podání protilátky PD-L1. Zejména CD8+ cytotoxické funkce byly posíleny jak SR59230A, tak PD-L1. Nebyly pozorovány žádné synergické účinky, když byl antagonista 3-AR podáván společně s protilátkou PD-L1, což potvrzuje, že imunitní reaktivace způsobená blokádou 3-AR spoléhá, ​​alespoň částečně, na signalizaci PD-L1 zapojení dráhy.

Obr. 2 SR59230A a PD-L1 stimulují imunitně reaktivní TME v NB

Obr. 3 Exprese imunitních kontrolních bodů na lymfocytech v TME a TDLN po 3-AR antagonismu a podání PD-L1

Obr. 4 3-blokáda AR spouští funkce CD8 a reguluje sekreci imunitních cytokinů v TME.

3-AR na lymfocytech infiltrujících nádor moduluje sekreci IFN- a ovlivňuje expresi PD-L1 na nádorových buňkách NB

Exprese PD-L1 na nádorových buňkách může být vyvolána několika faktory, ale mimo jiné TNF- a IFN- představují hlavní cytokiny schopné zvýšit hladiny PD-L1 v různých nádorech [23]. Abychom dále objasnili signalizaci, která je základem křížové řeči 3-AR/PD-L1 v našem modelu nádoru NB, nejprve jsme in vitro testovali expresi PD-L1 na nádorových buňkách N2A po léčbě TNF- a IFN-. Výsledky ukázaly, že exprese PD-L1 byla upregulována v buňkách NB ošetřených po dobu 48 hodin IFN-, ale ne TNF-. Navíc předběžné ošetření nádorových buněk N2A 3-AR antagonistou SR59230A nebylo schopno zrušit zvýšenou expresi PDL1 způsobenou léčbou IFN- (obr. 5A). Vzhledem k tomu, že literární údaje uznávaly TIL jako hlavní buněčný zdroj IFN- během adaptivní imunitní odpovědi [24] a že naše výsledky odhalily, že 3-modulace AR na nádorových buňkách N2A neovlivnila PD závislou na IFN- - -L1 expresi, zajímalo nás, zda 3-AR modulace na TIL byla zodpovědná za změněnou sekreci IFN-, která zase ovlivnila expresi PD-L1 na nádorových buňkách. K prokázání naší hypotézy byly izolovány lymfocyty získané z TDLN myší nesoucích NB ošetřených vehikulem nebo SR59230A a kokultivovány in vitro s nádorovými buňkami. Imunofluorescenční a průtoková cytometrická analýza potvrdily, že lymfocyty odebrané z NB-nesoucích myší ošetřených 3- AR antagonistou snižovaly jejich schopnost spouštět expresi PD-L1 na N2A buňkách ve srovnání s neošetřenými lymfocyty (obr. 5B, D). Kromě toho měření hladiny IFN- v kokultivačním médiu potvrdilo, že lymfocyty odebrané z myší ošetřených SR50230A částečně ztratily svou schopnost vylučovat IFN-, když byly kokultivovány s nádorovými buňkami NB (obr. 5C). Již bylo prokázáno, že 3-AR může být navázán na Gs protein v několika tkáních a jeho aktivace vede k aktivaci signální dráhy cAMP/PKA [25]. Studie zároveň prokázaly kritickou roli vazby cyklického AMP responzivního elementu (CREB) jako pozitivního regulátoru transkripce IFN- v T buňkách [25–27]. Na základě těchto pozorování jsme testovali, zda se signální dráha cAMP/PKA/CREB podílí na 3-AR závislé sekreci IFN- v TIL. Výsledky ukázaly, že 3-AR antagonismus CD8+ TIL snížil fosforylaci PKA/PKA podjednotek a CREB, což vedlo ke snížení exprese IFN- v CD8+ TIL (doplňkový obr. 1A , B). Tyto výsledky potvrdily, že 3-AR je schopen udržet transkripci IFN- v TIL NB spuštěním signální dráhy cAMP/PKA/CREB. Na druhou stranu, imunosupresivní cytokin IL-10 byl snížen u Treg myší léčených SR59230A ve srovnání s vehikulem (doplňkový obr. 1C), což potvrzuje imunitní reaktivitu NB TME po léčbě antagonistou 3-AR myší s NB. Abychom potvrdili selektivní účinek antagonismu SR59230A na 3-podtyp AR, provedli jsme test společné kultury s lymfocyty umlčenými siRNA pro 1-, 2- a 3-AR podtypy. Výsledky ukázaly, že lymfocyty umlčené pro 3-AR, mezi podtypy -AR, částečně ztratily svou schopnost indukovat expresi PD-L1 na nádorových buňkách N2A ve srovnání s kontrolním stavem (obr. 5E a doplňkový obr. 1D). Navíc proteinová exprese 3-AR na myších lymfocytech myší nesoucích NB byla potvrzena analýzou western blot lymfocytů získaných z TDLN (doplňkový obr. 2A) a imunofluorescencí CD4+ a CD{{ 90}} T buňky barvené na 3-AR na řezech nádorové hmoty (doplňkový obrázek 2B). Již dříve jsme prokázali, že specifický antagonismus 3- AR na nádorových buňkách N2A pomocí SR59230A inhiboval růst NB a progresi nádoru přechodem od kmenových k diferenciačním rysům nádorových buněk [12]. Zde naše výsledky naznačovaly, že protinádorový účinek podávání 3-AR antagonisty se také opíral o 3-modulaci signalizace AR na TIL, což zase vedlo k opětovnému oživení imunitních odpovědí proti nádorům. Proto, abychom potvrdili naši tezi in vivo, jsme podali FTY720 k omezení T buněk v TDLN a ke snížení jejich infiltrace do nádorové hmoty. FTY720 je analog sfingosin 1-fosfátu (S1P) a jeho podávání indukuje internalizaci a degradaci receptoru S1P, čímž brání lymfocytům vystupovat z lymfatických uzlin [28]. Jak se předpokládalo, předléčba FTY720 snížila protinádorový účinek vyvolaný podáváním 3-AR antagonisty (obr. 5F–H). Abychom potvrdili účinnost FTY720 na omezení T buněk v TDLN, měřili jsme počet T buněk v TDLN po osmi dnech (T8) léčby. Výsledky ukázaly, že CD4+ i CD8+ buňky byly zvýšeny v TDLN myší předem ošetřených FTY720 ve srovnání s neléčenými myšmi (vehikulum) (doplňkový obrázek 2C). Podle našich a dalších předchozích výsledků demonstrujících, že signalizace S1P je klíčová pro přežití nádorových buněk NB [12, 29], byla léčba samotným FTY720 také schopna významně snížit růst nádoru (obr. 5F–H). Analýza sekvenování RNA na nádorových hmotách NB izolovaných z myší ošetřených vehikulem a SR59230A identifikovala 5607 genů, z nichž 267 byly odlišně exprimované geny (DEG), 127 bylo upregulováno a 140 bylo downregulováno v nádorech ošetřených SR59230A (obr. 6A). Konkrétně několik genů, které byly statisticky rozdílně exprimovány, patřilo k imunitním drahám podle databáze GO:BP (obr. 6B). Kromě toho, downregulace PD-L1 mRNA (CD274 gen) v SR59230A-léčeného nádoru ve srovnání se stavem vehikula a upregulace různých jiných genů zapojených do imunitních procesů (obr. 6C) potvrdily korelaci mezi 3-AR a imunitní kontrolní bod PD-L1 pozorovaný na úrovni proteinu. Konečně, diferenciální analýza genové exprese na veřejném datovém souboru (GSE14880 z archivu GEO) skládajícím se z 34 pacientů postižených NBs potvrdila, že nádorové hmoty NB s nízkou expresí ADRB3 vykazovaly pozitivní regulaci imunitních odpovědí, aktivaci T buněk a imunitní efektor dráhy ve srovnání s nádorovou hmotou s vysokými hladinami ADRB3 (obr. 6D). Je třeba poznamenat, že zatímco u různých druhů rakoviny jsou katecholaminy uvolňovány prostřednictvím neuronů souvisejících s rakovinou nebo se jednoduše dostávají do nádoru krevním oběhem, v NB vznikají nadměrné hladiny katecholaminů a jejich metabolitů (HVA, VMA, dopamin), což je jedinečný rys této malignity. z jiného zdroje. Vzhledem ke zvláštnímu původu NB buněk (z defektních sympatických neuronálních diferenciačních buněk neuronální lišty) jsou tyto nádory obvykle schopny samy vylučovat katecholaminy. V našem myším modelu NB imunofluorescence na nádorových hmotách skutečně ukázala, že nádorové buňky NB byly pozitivní na dopamin-hydroxylázu (DBH) (doplňkový obr. 3A), enzym zodpovědný za syntézu norepinefrinu, bez ohledu na 3- Exprese AR na nádoru nebo jeho antagonismu. Celkově vzato, tato data zdůrazňují klíčovou roli, kterou hraje -adrenergní signalizace při regulaci různých biologických procesů zapojených do interakce mezi imunitním systémem hostitele a nádorovým mikroprostředím u nádorů NB. Protinádorové účinky pozorované po podání 3-AR antagonisty v našem myším syngenním modelu spoléhají, alespoň částečně, na modulaci {3-AR exprimovaného na lymfocytech infiltrujících nádorovou hmotu. Konkrétně jsme prokázali, že selektivní blokáda 3-AR na TILs snížila sekreci IFN-, což zase snížilo expresi PD-L1 na nádorových buňkách NB podporujících imunitně reaktivní TME.

Obr. 5 3-AR na TIL udržuje IFN- -závislou expresi PD-L1 v nádorových buňkách NB. A

Exprese genu ADRB3 koreluje se špatnou prognózou u pacientů s NB

Některé studie naznačovaly, že {{0}}AR mRNA a/nebo protein jsou nadměrně exprimovány a v některých případech korelují s neoplastickou proliferací a transformací u různých lidských rakovin [10, 30–32]. V souladu s tím naše preklinické výsledky získané na syngenním myším modelu NB ukázaly, že 3-AR signalizace může udržovat různé protumorální procesy podporující růst nádoru. Proto, abychom otestovali, zda exprese genu ADRB3 koreluje s přežitím pacientů s NB, provedli jsme Kaplan-Meierovu analýzu prostřednictvím platformy R2: Genomics Analysis and Visualization Platform (http://r2.amc.nl) s použitím databáze Kocak, která zahrnuje kompletní informace o klinických datech 649 pacientů NB. Výsledky ukázaly, že exprese genu ADRB3 byla spojena se špatnými výsledky u pacientů s NB. Vysoká exprese genu ADRB3 byla skutečně významně spojena se sníženým přežitím bez příhod (p=3,2e−05) (obr. 7A) a celkovým přežitím (p=8,4e−0,5) ( Obr. 7B) pacientů s NB. Kromě toho analýza genové korelace v některých kohortách ukázala pozitivní korelaci mezi ADRB3 a geny pro inhibiční imunitní kontrolní body, jako je CD80, CTLA4 a CD276, a negativní korelaci s geny pro imunitní kontrolní body aktivující imunitní systém, jako je CD266, Ligand CD40 (CD40LG) a ligand 4-1BB (4-1BBL) (obr. 7C). Celkově získaná data zdůrazňují negativní korelaci exprese genu ADRB3 s výsledkem pacientů s NB a potvrzují a posilují roli 3-AR jako molekulárního hráče schopného tlumit protinádorové imunitní reakce ovlivněním vícenásobných kontrolních bodů imunitního systému signální dráhy.

DISKUSE

Vzhledem k jeho zvláštnímu neurogennímu původu charakterizují nádorový stav NB vysoké hladiny katecholaminových metabolitů [7, 33]. V předchozí práci jsme spekulovali, že uvolňování katecholaminů v TME by mohlo cílit na rakovinné buňky prostřednictvím aktivace -AR, což spouští dopřednou smyčku růstu a malignity u rakoviny NB. Experimentální data skutečně prokázala, že 3-AR je exprimován na různých nádorových buněčných liniích NB a biopsiích od pacientů a že jeho modulace významně ovlivnila růst nádoru v syngenním myším modelu NB [12]. Kromě exprese -ARs na nádorových buňkách je všeobecně známo, že -ARs se nacházejí na povrchu většiny buněk v TME, včetně imunitních buněk, a že ligace katecholaminů na -ARs v imunitních buňkách reguluje vrozenou i adaptivní imunitu. [34]. Je třeba poznamenat, že zatímco za fyziologických podmínek modulace imunitního systému pomocí -adrenergní signalizace podporuje normální imunitní odpověď, ve změněných procesech může mít SNS/katecholaminy/-ARs prodloužená stimulace škodlivé účinky na různé imunitní buňky včetně lymfocytů [35, 36 ]. V těchto změněných stavech podporuje trvalá stimulace adrenergní signalizace patologické procesy a mimo jiné progresi rakoviny [37]. Na základě výše uvedených pozorování má naše studie za cíl prozkoumat, zda by protinádorové účinky způsobené 3-AR antagonismem u nádorů NB mohly částečně spoléhat na opětovné oživení protinádorové imunity a zda by to mohlo zahrnovat modulace signálních drah imunitních kontrolních bodů. Preklinické studie naznačují, že exprese PD-L1 v metastatické NB představuje klíčový mechanismus pro omezení imunitního dozoru [15] a že kombinovaná imunoterapie s anti-PD-L1/PD-1 a anti-CD4 protilátkami léčí syngenní diseminovanou NB [15] 38]. Nedávno byla exprese PD-L1 hodnocena u několika dětských nádorů a především bylo barvení PD-L1 spojeno s horším přežitím u pacientů s NB [16, 39]. Navíc se ukázalo, že PD-L1-pozitivní nádory byly lokalizovány v nadledvinách častěji než PD-L1-negativní nádory a že metabolity katecholaminů (NSE, VMA a HVA) měly tendenci být vyšší v PD-L1-pozitivní skupině než v PD-L1-negativní skupině [16].

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

Tyto důkazy naznačovaly schopnost signální osy PD-1/PD-L1 kontrolovat imunitní únik nádoru u primárních a metastatických NB, nicméně nezkoumaly přesné mechanismy, které jsou základem PD-1/PD- Regulace signalizace L1. Abychom zjistili, zda 3-modulace AR může ovlivnit expresi PD-L1 v NB a následnou imunitní reaktivitu v TME, ošetřili jsme A/J myši naočkované syngenními buňkami N2A NB 3- Antagonista AR SR59230A, monoklonální protilátka PD-L1 (PD-L1) nebo jejich kombinace. Nejprve jsme pozorovali, že 3-antagonismus AR byl schopen snížit růst nádoru NB a současně snížit expresi PD-L1 v TME myší s NB. Průtoková cytometrie odhalila, že snížené množství PD-L1 pozorované v nádorové hmotě myší léčených SR59230A většinou odráželo sníženou expresi nádorových buněk. V ostrém kontrastu byla exprese PD-L1 na DC a makrofázích upregulována. Několik vědeckých důkazů přisoudilo PD-L1 lokalizovanému jak na nádorových buňkách, tak na APC schopnost tlumit aktivaci T buněk, což částečně brání účinné imunitní reakci proti nádoru [40]. Nedávné studie však ukázaly, že během vychytávání antigenu a křížové prezentace nádorových antigenů T buňkám, což je zásadní krok v adaptivní imunitě, DC a makrofágy upregulují PD-L1, čímž omezují nadměrnou aktivaci T buněk a chrání je před cytotoxickými aktivitami T buňky [41, 42]. Proto jsme předpokládali, že snížená exprese PD-L1 na nádorových buňkách a její současné zvýšení na APC v nádorové hmotě ošetřené SR59230A pravděpodobně odráží opětovné oživení imunitního systému v TME. Výsledky potvrdily zvýšený počet imunosupresivních buněk infiltrujících nádor (NK, DC a CD8+) a snížení počtu imunosupresivních buněk infiltrujících nádor (Treg a MDSC). Analýza exprese imunitního kontrolního bodu PD-1 na TIL ukázala významně zvýšený počet PD-1+CD4+ a PD- 1+CD8+ T buněk v TDLN při rané stadium vývoje nádoru (T2) a PD-1+CD8+ v nádoru po 8 dnech (T8) SR59230A, PD-L1 nebo jejich kombinovanou léčbou ve srovnání s kontrolou. Rostoucí trend byl zaznamenán také v počtu CD4+ T buněk barvených na TIM3 nebo LAG3 v nádorech SR59230A, PD-L1 a jejich kombinaci, ale nedosáhly statistické významnosti. U CD8+ T buněk barvených na TIM3 nebo LAG3 jsme místo toho pozorovali velkou variabilitu. Zatímco některé literární údaje naznačovaly, že PD-1, LAG-3 a TIM-3 exprimující T buňky jsou vyčerpané a dysfunkční [43–45], jiné prokázaly, že tyto imunitní kontrolní body, zejména PD -1, jsou také upregulovány po aktivaci a diferenciaci efektorových T buněk [46–48], a proto exprese sama o sobě neodráží vyčerpaný stav, spíše tyto markery identifikují autologní tumor-reaktivní repertoár infiltrující různé tumory [46– 49]. Ve shodě, hlubší výzkumy v našem nádorovém modelu potvrdily, že 3-antagonismus AR, jako léčba anti-PD-L1 mAb, spustil cytotoxické funkce CD8+, jak ukazuje zvýšený počet PD 1+CD8+ buňky obarvené na perforin nebo granzym B, což potvrzuje, že PD1+ TIL nalezené v nádorové hmotě jsou funkčně aktivní. Ukázalo se, že vysoká infiltrace CD8+ cytotoxických T-buněk v nádoru koreluje s pozitivní prognózou u pacientů s několika malignitami včetně melanomu, rakoviny hlavy a krku, prsu, kolorektálního karcinomu, rakoviny vaječníků, prostaty a dalších [50]. V NB nedávná studie prokázala, že nádory obohacené o T buňky infiltrující nádory měly lepší klinický výsledek, nezávisle na jiných současných ukazatelích přijatých pro stanovení stadia nádoru [51]. Nedávná zjištění navíc prokázala, že přítomnost DC a NK buněk v nádorové hmotě pozitivně koreluje jak s infiltrací T lymfocytů, tak s pozitivním klinickým výsledkem u pacientů s NB [52]. Všechny tyto klinické důkazy souhlasí s našimi předklinickými výsledky, ve kterých TME obohacený o NK, DC a CD8+ T buňky, pozorovaný po 3- AR antagonismu nebo podání PD-L1, byl funkčně schopen kontrolovat růst nádoru NB. Základním aspektem výzvy hostitelského imunitního systému proti nádorům je uvolňování různých cytokinů v TME, které mohou udržovat nebo slábnout protinádorové aktivity. Měření cytokinů v nádoru potvrdilo u myší léčených SR59230A a PD-L1- stav posunutý směrem k imunitně reaktivnímu TME. Zatímco mezi protinádorovými cytokiny se hladiny TNF a IL{101}} zvýšily, hladina IFN- v nádorové hmotě u myší léčených 3-AR antagonistou klesla. Na základě tohoto pozorování jsme předpokládali, že modulace 3-AR signalizace na T buňkách infiltrujících nádor, zejména na CD{107}} a CD{108}}, by mohla být zodpovědná za změněný IFN- sekrece, což zase ovlivnilo expresi PD-L1 na nádorových buňkách. Výsledky potvrdily naši hypotézu. Selektivní 3-AR antagonismus na TIL skutečně způsobil, že tyto buňky byly neúčinné při indukci exprese PD-L1 na nádorových buňkách NB v důsledku změněné sekrece IFN- a de facto bránily vytvoření adaptivní imunitní rezistence. U TME IFN- řídí protumorogenní i protinádorové imunitní reakce, působí jako cytotoxický cytokin spolu s granzymem B a perforinem k zasažení nádorových buněk, ale také spouští syntézu inhibičních imunitních kontrolních bodů, čímž stimuluje imunosupresivní mechanismy [53]. Tato bimodální role IFN- při vyvolávání opačných účinků závisí na komplexních mechanismech, které ještě nejsou plně pochopeny, nicméně množství secernovaného IFN- se zdá být rozhodující pro definování účinků tohoto cytokinu [54]. V souladu s tím předpokládáme, že v našem modelu snížené množství IFN- způsobené 3- AR antagonismem na TIL podporovalo imunitní reakce ve srovnání s kontrolním stavem, ve kterém chronická expozice IFN- vynucuje více imunosupresivních mechanismů. Mezi podtypy -AR se 2-AR zdá být nejvíce exprimován na povrchu různých imunitních buněk. Je však třeba poznamenat, že 3-AR, poslední identifikovaný člen -AR, byl dosud nejméně prozkoumán. Abychom potvrdili, že podávání SR59230A přineslo své účinky blokující hlavně 3-podtyp AR, nejprve jsme zkoumali a potvrdili expresi 3-AR proteinu na lymfocytech TDLN a na T buňkách infiltrujících nádor. Prokázali jsme expresi 3-proteinu AR v tumor-infiltrujících CD4+ a CD8+ a poté prostřednictvím selektivních 1-, 2- a {{ Po umlčení AR jsme potvrdili významnou roli 3-podtypu AR lokalizovaného na lymfocytech při kontrole exprese PD-L1 závislé na IFN{142}} na nádorových buňkách NB. Je třeba poznamenat, že rozsáhlé údaje o různých tkáních a buněčných modelech ukázaly, že zatímco 1- a 2-AR jsou obě náchylnější k fenoménu homologní desenzibilizace po dlouhodobé expozici endogenním katecholaminům, {{147} }Ukázalo se, že podtyp AR není, a když se přesto v některých buňkách objevila 3-desenzibilizace ARs, byla méně výrazná než u 1- a 2-ARs [ 55]. Potom spekulujeme, že u nádoru NB, což je stav charakterizovaný chronickou expozicí katecholaminům, 2-podtyp AR na TIL, který je nejvíce fyziologicky exprimován, může po desenzibilizaci podléhat downregulaci, a naopak 3-AR získává klíčovou roli při zprostředkování katecholaminů indukovaných protumorových účinků. Abychom prozkoumali u lidí protumorální sklon exprese 3- AR, provedli jsme nakonec genetickou analýzu na 649 pacientech s NB pomocí otevřeného přístupu R2: Genomics Analysis and Visualization Platform. Vysoká exprese genu ADRB3 korelovala s nejhorším klinickým výsledkem (celkové přežití a přežití bez příhody) u pacientů s NB ve srovnání s nižší expresí; dále pozitivní korelace genu ADRB3 s různými imunosupresivními kontrolními body, jako jsou CD80, CTLA4 a B7-H3 (CD276), a negativní korelace s kontrolními body aktivujícími imunitu, jako jsou CD266, CD40LG a 4-1 BBL potvrdil negativní roli, kterou hraje 3-AR v komplexní regulaci imunitní reaktivity u NB. Zejména pozitivní korelace exprese genu ADRB3 s imunosupresivními kontrolními body, jako je CD276, molekula asociovaná s NB nacházející se v neresponzivních variantách NB, která má ochrannou roli při lýze zprostředkované NK buňkami [56, 57], nebo s CTLA4, jehož inhibice se ukázala jako neredundantní při posilování protinádorového zabíjení T buněk v NB [58], zdůraznila schopnost 3-AR signalizace udržovat různé mechanismy podporující imunitní únik nádoru. Můžeme spekulovat, že korelace mezi vysokou expresí genu ADRB3 a zvýšenou expresí různých imunitních kontrolních bodů by se mohla spoléhat na 3-schopnost AR udržet ty mechanismy, jejichž nadměrná aktivace podporuje nástup nádorové rezistence, jako je chronická expozice některým profíkům - zánětlivé cytokiny. Časné studie inhibice kontrolních bodů u NB nebyly vždy úspěšné. Zejména jak v modelech preklinických studií, tak u lidí, lepší odpovědi získané v terapeutických strategiích využívajících více ICI naznačovaly, že cílení na různé imunitní kontrolní body představuje neredundantní účinný protinádorový přístup u NB [58, 59]. Zacílení na různé imunosupresivní dráhy by pak mohlo představovat nejlepší terapeutickou možnost, jak se vyhnout nádorové rezistenci jednocílové terapie. Podávání více léků je však vždy problematické kvůli těžkým vedlejším účinkům a toxicitě a ne vždy vedlo k požadovaným výsledkům. Pro vývoj nových imuno-onkologických přístupů je proto zapotřebí hlubší znalost molekulárních mechanismů zapojených do regulace komplexní sítě imunitního protějšku TME. V této souvislosti prezentované výsledky naznačují, že zacílení 3-AR v NB TME by mohlo představovat možný přístup k zasažení více neredundantních protumorálních signálních drah. Zejména ovlivněním imunitního systému hostitele prostřednictvím odstranění bariéry vyvolané kooperací imunitních kontrolních bodů a cest pro přežití nádorových buněk může 3-antagonismus AR představovat slibnou strategii s, doufejme, terapeutickou potenciál pro pacienty postižené malignitami NB. Stále je zapotřebí více studií k prohloubení dalších mechanismů, které jsou základem komplexní interakce mezi imunitním systémem hostitele a protějškem nádoru v NB. Nicméně, ve světle toho, co jsme pozorovali, studie -adrenergní signalizace v TME nádorů NB si zaslouží být vzata v úvahu.

Obr. 6 Transkriptomické analýzy nádorové hmoty NB potvrzují významnou roli 3-AR při ovlivňování imunitních procesů

Obr. 7 Kaplan–Meierova analýza přežití a korelace imunitních kontrolních bodů s expresí genu ADRB3 u pacientů s NB.

REFERENCE

1. Cheung NK, Dyer MA. Neuroblastom: vývojová biologie, genomika rakoviny a imunoterapie. Nat Rev Cancer. 2013;13:397–411.

2. Matthay KK, Maris JM, Gudrun S, Nakagawara A, Mackal CL, Diller L a kol. Neuroblastom. Nat Rev Dis Prim. 2016;2:16078.

3. Darvin P, Toor SM, Nair SN, Elkord E. Inhibitory imunitního kontrolního bodu: nedávný pokrok a potenciální biomarkery. Exp Mol Med. 2018;50:1–11.

4. Pardoll DM. Blokáda imunitních kontrolních bodů v imunoterapii rakoviny. Nat Rev Cancer. 2012;12:252–64.

5. Zou W, Wolchok JD, Chen L. Blokáda dráhy PD-L1 (B7-H1) a PD-1 pro léčbu rakoviny: mechanismy, biomarkery odpovědi a kombinace. Sci Transl Med. 2016;8:328rv4.

6. Cole SW, Sood AK. Molekulární dráhy: beta-adrenergní signalizace u rakoviny. Clin Cancer Res. 2012;18:1201–6.

7. Strenger V, Kerlb R, Dornbusch HJ, Ladenstein R, Ambros PF, Ambros IM a kol. Diagnostický a prognostický vliv katecholaminů v moči u pacientů s neuroblastomem. Dětská rakovina krve. 2007;48:504–9.

8. Huang XE, Hamajima N, Saito T, Matsuo K, Mizutani M, Iwata H a kol. Možná souvislost genových polymorfismů beta2- a beta3-adrenergních receptorů s náchylností k rakovině prsu. Breast Cancer Res. 2001;3:264–9.

9. Babol K, Przybylowska K, Lukaszek M, Pertynski T, Blasiak J. Asociace mezi polymorfismem Trp64Arg v genu pro beta3-adrenergní receptor a rakovinou endometria a obezitou. J Exp Clin Cancer Res. 2004;23:669–74.

10. Perrone MG, Notarnicola M, Caruso MG, Tutino V, Scilimati A. Upregulace mRNA beta3-adrenergního receptoru u lidské rakoviny tlustého střeva: předběžná studie. Onkologie. 2008;75:224–9.

11. Magnon C, Hall SJ, Lin J, Xue X, Gerber L, Freedland SJ a kol. Vývoj autonomních nervů přispívá k progresi rakoviny prostaty. Věda. 2013;341:1236361.

12. Bruno G, Cencetti F, Pini A, Tondo A, Cuzzubbo D, Fontana F, et al. Blokáda beta3- adrenoreceptorů snižuje růst nádoru a zvyšuje neuronální diferenciaci u neuroblastomu prostřednictvím modulace SK2/S1P2. Onkogen. 2020;39:368–84.

13. Calvani M, Bruno G, Dal Monte M, Nassini R, Fontana F, Casini A, et al. beta3 -adrenoceptor jako potenciální imunosupresor u melanomu. Br J Pharm. 2019;176:2509–24.

14. Dal Monte M, Casini G, Filippi L, Nicchia MG, Svelto M, Bagnoli P. Funkční zapojení beta3-adrenergních receptorů do růstu a vaskularizace melanomu. J Mol Med. 2013;91:1407–19.

15. Dondero A, Pastorino F, Della Chiesa M, Corrias MV, Morandi F, Pistoia V, et al. Exprese PDL1 v metastatickém neuroblastomu jako další mechanismus pro omezení imunitního dozoru. Onkoimunologie. 2016;5:e1064578.

16. Zuo S, Sho M, Sawai T, Kanehiro H, Maeda K, Yoshida M, et al. Potenciální role exprese PD-L1 a tumor-infiltrujících lymfocytů na neuroblastom. Pediatr Surg Int. 2020;36:137–43.

17. Keir ME, Butte MJ, Feeman GJ, Sharpe AH. PD-1 a jeho ligandy v toleranci a imunitě. Annu Rev Immunol. 2008;26:677–704.

18. Curiel TJ, Wei S, Dong H, Alvarez X, Cheng P, Mottram P a kol. Blokáda B7-H1 zlepšuje protinádorovou imunitu zprostředkovanou myeloidními dendritickými buňkami. Nat Med. 2003;9:562–7.

19. Wu K, Kryczek I, Cheng L, Zou W, Welling TH. Suprese CD8+ T-buněk z Kupfferových buněk u lidského hepatocelulárního karcinomu je zprostředkována interakcemi B7-H1/programovaná smrt-1. Cancer Res. 2009;69:8067–75.

20. Kuang DM, Zhao Q, Peng C, Xu J, Zhang JP, Wu C a kol. Aktivované monocyty v peritumorálním stromatu hepatocelulárního karcinomu podporují imunitní privilegia a progresi onemocnění prostřednictvím PD-L1. J Exp Med. 2009;206:1327–37.

21. Rotte A, Jin JY, Lemaire V. Mechanistický přehled imunitních kontrolních bodů na podporu racionálního návrhu jejich kombinací v imunoterapii rakoviny. Ann Oncol. 2018;29:71–83.

22. Dammeijer F, van Gulijk M, Mulder EE, Lukkes M, Klaase L, van den Bosch T, et al. Kontrolní bod PD-1/PD-L1 omezuje imunitu T-buněk v lymfatických uzlinách odvádějících nádor. Cancer Cell. 2020;38:685–700. e8.

23. Cha JH, Chan LC, Li CW, Hsu JL, Hung MC. Mechanismy kontrolující expresi PD-L1 u rakoviny. Mol Cell. 2019;76:359–70.

24. Burke JD, Young HA. IFN-: cytokin ve správný čas, je na správném místě. Semin Immunol. 2019;43:101280.

25. Schena G, Caplan MJ. Vše, co jste vždy chtěli vědět o 3-AR* (* ale báli jste se zeptat). Buňky. 2019;8:357.

26. Liu Y, Guo YL, Zhou SJ, Liu F, Du FJ, Zheng XJ a kol. CREB je pozitivním regulátorem transkripce gama interferonu u latentních, ale neaktivních tuberkulózních infekcí. Clin ad Vaccine Immunol. 2010;17:1377–80.

27. Samten B, Townsend JC, Weis SE, Bhoumik A, Klucar P, Shams H, et al. Transkripční faktory CREB, ATF a AP-1 regulují sekreci IFN-gama lidskými T buňkami v reakci na mykobakteriální antigen. J Immunol. 2008;181:2056–64.

28. Matloubian M, Lo CG, Cinamon G, Lesneski MJ, Xu Y, Brinkmann V, et al. Výstup lymfocytů z brzlíku a periferních lymfoidních orgánů je závislý na receptoru S1P 1. Povaha. 2004;427:355–60.

29. Li MH, Hla T, Ferrer F. FTY720 inhibuje růst nádoru a zesiluje nádorový supresivní účinek topotekanu u neuroblastomu tím, že zasahuje do sfingolipidové signální dráhy. Dětská rakovina krve. 2013;60:1418–23.

30. Chisholm KM, Chang KW, Truong MT, Kwok S, West RB, Heerema-McKenney AE. exprese beta-adrenergních receptorů ve vaskulárních nádorech. Mod Pathol. 2012;25:1446–51.

31. Montoya A, Amaya CN, Belmont A, Diab N, Trevino R, Villanueva G, a kol. Použití neselektivních beta-blokátorů je spojeno se snížením indexů proliferace nádorů u časného stadia rakoviny prsu. Oncotarget. 2017;8:6446–60.

32. Rains SL, Amaya CN, Bryan BA. Beta-adrenergní receptory jsou exprimovány u různých druhů rakoviny. Onkověda. 2017;4:95–105.

33. Verly IR, van Kuilenburg ABP, Abeling NGGM, Goorden SMI, Fiocco M, Vaz FM a kol. Katecholaminové profily při diagnóze: Zvýšená diagnostická citlivost a korelace s biologickými a klinickými rysy u pacientů s neuroblastomem. Eur J Cancer. 2017;72:235–43.

34. Eng JWL, Kokolus KM, Reed CB, Hylander BL, MA WW, Repasky a kol. Mikroprostředí nervového nádoru: dopad adrenergního stresu na rakovinné buňky, imunosuprese a imunoterapeutická odpověď. Cancer Immunol Immunother. 2014;63:1115–28.

35. Dhabhar FS, McEwen BS. Akutní stres zesiluje, zatímco chronický stres potlačuje buněčně zprostředkovanou imunitu in vivo: potenciální role pro obchodování s leukocyty. Brain Behav Immun. 1997;11:286–306.

36. Dhabhar FS. Stresem indukovaná augmentace imunitní funkce – role stresových hormonů, transportu leukocytů a cytokinů. Brain Behav Immun. 2002;16:785–98.

37. Qiao G, Chen M, Bucsek MJ, Repasky EA, Hylander BL. Adrenergní signalizace: cílený kontrolní bod omezující rozvoj protinádorové imunitní odpovědi. Front Immunol. 2018; 9:164.

38. Rigo V, Emionite L, Daga A, Astigiano S, Corrias MV, Quintarelli C, et al. Kombinovaná imunoterapie s anti-PDL-1/PD-1 a anti-CD4 protilátkami léčí syngenní diseminovaný neuroblastom. Sci Rep. 2017;7:14049.

39. Majzner RG, Simon JS, Grosso JF, Martinez D, Pawel BR, Santi M a kol. Hodnocení exprese ligandu 1 programované smrti a imunitních buněk spojených s nádorem v dětských rakovinových tkáních. Rakovina. 2017;123:3807–15.

40. Gibbons Johnson RM, Dong H. Funkční exprese ligandu programované smrti 1 (B7-H1) imunitními buňkami a nádorovými buňkami. Front Immunol. 2017;8:961.

41. Peng Q, Qiu X, Zhang Z, Zhang S, Zhang Y, Liang Y a kol. PD-L1 na dendritických buňkách zeslabuje aktivaci T buněk a reguluje odpověď na blokádu imunitního kontrolního bodu. Nat Commun. 2020;11:4835.

42. Singhal S, Stadanlick J, Annunziata MJ, Rao AS, Bhojnagarwala PS, O'Brien S, et al. Monocyty/makrofágy spojené s lidským nádorem a jejich regulace odpovědí T buněk v raném stádiu rakoviny plic. Sci Transl Med. 2019;11:eaat1500.

43. Blackburn SD, Shin H, Haining WN, Zou T, Workman CJ, Polley A, et al. Koregulace vyčerpání CD8+ T buněk vícenásobnými inhibičními receptory během chronické virové infekce. Nat Immunol. 2009;10:29–37.

44. Jin HT, Anderson AC, Tan WG, West EE, Ha SJ, Araki K a kol. Spolupráce Tim-3 a PD-1 při vyčerpání CD8 T-buněk během chronické virové infekce. Proč Natl Acad Sci USA. 2010;107:14733–8.

45. Sakuishi K, Apetoh L, Sullivan JM, Blazar BR, Kuchroo VK, Anderson AC. Zaměření na dráhy Tim-3 a PD-1 s cílem zvrátit vyčerpání T buněk a obnovit protinádorovou imunitu. J Exp Med. 2010;207:2187–94.

46. ​​Agata Y, Kawasaki A, Nishimura H, Ishida Y, Tsubata T, Yagita H, et al. Exprese PD-1 antigenu na povrchu stimulovaných myších T a B lymfocytů. Int Immunol. 1996;8:765–72.

47. Vibhakar R, Juan G, Traganos F, Darzynkiewicz Z, Finger LR. Aktivací indukovaná exprese lidského genu programované smrti-1 v T-lymfocytech. Exp Cell Res. 1997;232:25–8.

48. Freeman GJ, Long AJ, Iwai Y, Bourque K, Chernova T, Nishimura H, et al. Zapojení PD-1 imunoinhibičního receptoru novým členem rodiny B7 vede k negativní regulaci aktivace lymfocytů. J Exp Med. 2000;192:1027–34.

49. Gros A, Robbins PF, Yao X, Li YF, Turcotte S, Tran E a kol. PD-1 identifikuje pro pacienta specifický CD8(+) tumor-reaktivní repertoár infiltrující lidské tumory. J Clin Invest. 2014;124:2246–59.

50. Galon J, Costes A, Sanchez-Cabo F, Kirilovsky A, Mlecnik B, Lagorce-Pagès C, et al. Typ, hustota a umístění imunitních buněk v lidských kolorektálních nádorech předpovídají klinické výsledky. Věda. 2006;313:1960–4.

51. Mina M, Boldrini R, Citti A, Rumunsko P, D'Alicandro V, De Ioris M a kol. T lymfocyty infiltrující tumor zlepšují klinické výsledky neuroblastomu rezistentního na terapii. Onkoimunologie. 2015;4:e1019981.

52. Melaiu O, Chierici M, Lucarini V, Jurman G, Conti LA, De Vito R a kol. Buněčné a genové podpisy dendritických buněk infiltrujících nádor a přirozených zabíječských buněk předpovídají prognózu neuroblastomu. Nat Commun. 2020;11:5992.

53. Jorgovanovic D, Song M, Wang L, Zhang Y. Roles of IFN-gamma in tumor progression and regression: a review. Biomark Res. 2020; 8:49.

54. Zhang J. Yin a Yang souhra IFN-gama při zánětu a autoimunitním onemocnění. J Clin Invest. 2007;117:871–3.

55. Okeke K, Angers S, Bouvier M, Michel MC. Agonistou indukovaná desenzibilizace beta3 -adrenoceptorů: kde, kdy a jak? Br J Pharm. 2019;176:2539–58.

56. Castriconi R, Dondero A, Augugliaro R, Cantoni C, Carnemolla B, Sementa AR a kol. Identifikace 4Ig-B7-H3 jako molekuly asociované s neuroblastomem, která má ochrannou roli před lýzou zprostředkovanou NK buňkami. Proč Natl Acad Sci USA. 2004;101:12640–5.