Zerumbone, tropický zázvorový seskviterpen ze Zingiber Officinale Roscoe, zeslabuje melanogenezi indukovanou MSH v buňkách B16F10, část 1

Abstraktní:Zerumbone (ZER), aktivní složka čeledi Zingiberaceae, vykazuje několik biologických aktivit, jako jsou protizánětlivé, antialergické, antimikrobiální a protirakovinné; nebyl však studován na antimelanogenní vlastnosti. V této studii prokazujeme, že ZER a Zingiber jsou oficiální (ZO) extrakty, které významně zmírňují akumulaci melaninu v myších melanogenních B16F10 buňkách stimulovaných melanocyty stimulujícím hormonem (-MSH). Dále, abychom objasnili molekulární mechanismus, kterým ZER potlačuje akumulaci melaninu, analyzovali jsme expresi transkripčního faktoru spojeného s melanogenezí, transkripčního faktoru spojeného s mikroftalmií (MITF) a jeho cílových genů, jako je tyrosináza, protein 1 související s tyrosinázou ( TYRP1) a protein 2 související s tyrosinázou (TYRP2) v buňkách B16F10, které jsou stimulovány -MSH. Zde jsme zjistili, že ZER inhibuje MITF-zprostředkovanou expresi melanogenních genů po stimulaci -MSH. Kromě toho buňky ošetřené různými koncentracemi zerumbone a ZO vykazovaly zvýšenou extracelulární signálem regulovanou fosforylaci kináz 1 a 2 (ERK1/2), které se podílejí na degradačním mechanismu MITF. Farmakologická inhibice ERK1/2 pomocí U0126 dostatečně zvrátila antimelanogenní účinek ZER, což naznačuje, že pro jeho antimelanogenní aktivitu je nutná zvýšená fosforylace ERK1/2. Dohromady tyto výsledky naznačují, že extrakty ZER a ZO mohou být použity jako aktivní složky v kosmetice pro bělení pokožky kvůli jejich antimelanogennímu účinku.

Podle relevantních studií je cistanche běžnou bylinou, která je známá jako „zázračná bylina, která prodlužuje život“. Jeho hlavní složkou jecistanosid, která má různé účinky jako napřantioxidant,protizánětlivéa podporu imunitních funkcí. Mechanismus mezicistancheabělení kůžespočívá v antioxidačním účinku cistancheglykosidy. Melanin v lidské kůži je produkován oxidací tyrosinu katalyzovanoutyrosinázaa oxidační reakce vyžaduje účast kyslíku, takže se volné radikály v těle stávají důležitým faktorem ovlivňujícím produkci melaninu. Cistanche obsahuje cistanosid, což je antioxidant a může tak snížit tvorbu volných radikálů v těleinhibující produkci melaninu.

Klikněte na Jak používat Cistanche

Další informace:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

klíčová slova:zerumbone; Zingiber official Roscoe; melanogeneze; MITF; ERK1/2

1. Úvod

Melanogeneze, produkce melaninu epidermálními melanocyty, je stimulována hormonem stimulujícím melanocyty (-MSH), který je vylučován z keratinocytů při vystavení ultrafialovému (UV) záření [1,2]. Faktor kmenových buněk (SCF) je dalším melanogenním faktorem, který přísně kontroluje migraci, proliferaci a diferenciaci melanocytů pro udržení postnatální kožní melanogeneze [3]. Transkripční faktor spojený s mikroftalmií (MITF), který je melanogenním transkripčním faktorem, je aktivován prostřednictvím signální dráhy cAMP-PKA-CREB (cyklická adenosinmonofosfát-proteinkináza A-cAMP response element binding protein) po stimulaci -MSH prostřednictvím receptoru melanokortinu 1 (MC1R) v cytoplazmatických membránách epidermálních melanocytů [4]. O několika chemikáliích, jako je forskolin a IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthin), je známo, že aktivují signální dráhu cAMP-PKA-CREB, což vede k indukci melanogeneze [5]. Několik studií odhalilo, že trvalá aktivace extracelulárně regulovaných kináz 1 a 2 (ERK1/2), která se účastní molekulárního mechanismu onkogeneze, podporuje fosforylaci MITF na Ser73 a jeho následnou degradaci prostřednictvím proteolýzy závislé na ubikvitinu [6,7 ]. U0126, selektivní inhibitor dráhy ERK1/2, skutečně bylo hlášeno, že zvyšuje expresi MITF a aktivitu tyrosinázy, což vede k produkci melaninu [6]. Stabilizovaný a aktivovaný MITF zvyšuje expresi melanogenních genů, jako je tyrosináza, tyrosináza-příbuzný protein 1 (TYRP1) a tyrosináza-příbuzný protein 2 (TYRP2). Transformace tyrosinu na 3,4-dihydroxyfenylalanin (L-DOPA), která je počátečním krokem melanogeneze, je katalyzována tyrosinázou. Tyrosinase-related proteiny (TRP) katalyzují další oxidační a tautomerizační reakce [8]. Po syntéze melaninu je zralý melanin transportován z epidermálních melanocytů do cytoplazmy bazálních keratinocytů k ochraně buněk před UV zářením [2].

Abnormálně zvýšená melanogeneze způsobuje různé typy kožních poruch, jako je rakovina kůže, chloasma a pihy [4]; tak byly identifikovány malé molekuly nebo přírodní produkty, které se zaměřují buď na katalytickou aktivitu tyrosinázy, nebo na regulátory signálních drah v melanogenezi, včetně ERK1/2, nebo transkripci melanogenních genů zprostředkovanou MITF, jako aktivní složky pro využití v kosmetice. průmysl. Několik malých molekul, jako je kyselina kojová, arbutin a niacinamid, se široce používá jako kosmetické přísady kvůli jejich antimelanogenním aktivitám. Zprávy však ukázaly, že kyselina kojová způsobuje četné vedlejší účinky, včetně cytotoxicity, dermatitidy, rakoviny kůže a hepatocelulárního karcinomu, kvůli své genotoxické aktivitě [9]. Ačkoli se arbutin, který byl izolován z rostliny medvědice lékařské, používal k léčbě hyperpigmentační poruchy, v poslední době je jeho použití jako kosmetické přísady omezeno kvůli několika vedlejším účinkům [9]. Bylo popsáno, že niacinamid má antimelanogenní aktivitu a tato aktivita se provádí inhibicí přenosu melanosomu z melanocytů do okolních keratinocytů [10]. Proto se obecně používá jako sloučenina pro bělení kůže v kosmetickém průmyslu. K překonání omezení zavedených činidel pro bělení kůže, která mají několik vedlejších účinků, je důležité vyvinout bezpečné přísady pro bělení kůže získané z přírodních zdrojů. Například -thujaplicin, linderanolid B, 4-butylresorcinol a plumbagin byly identifikovány jako antimelanogenní sloučeniny kvůli jejich inhibičním účinkům na tyrosinázu [4,11]. Nobiletin, withaferin A, sesamol a chaetocin vykazují antimelanogenní vlastnosti modulací signálních meziproduktů v dráze melanogeneze [11].

Zerumbone (ZER) je přírodní produkt, který je izolován z těkavých esenciálních olejů rostlin z čeledi Zingiberaceae, jako je Zingiber zerumbet Smith a Zingiber officinal Roscoe [12]. Několik studií ukázalo, že ZER má širokou škálu biologických aktivit, včetně antimikrobiálních, antioxidačních, antidiabetických, protirakovinných, protizánětlivých, antialergenních a antiangiogenních aktivit [12]. Zajímavé je, že ZER vykazuje ochranný účinek proti oxidativnímu poškození kožních keratinocytů indukovaným ultrafialovým zářením A (UVA) díky své schopnosti vychytávat reaktivní formy kyslíku (ROS) prostřednictvím aktivace jaderného faktoru E{{8} }související faktor-2 (Nrf2) [1,13]. To naznačuje, že ZER lze použít jako funkční přísadu v kosmetice pro péči o pleť. Podrobný mechanismus antimelanogenních vlastností působení ZER je však třeba teprve studovat.

V této studii byly studovány inhibiční účinky extraktu ZER a Zingiber officinal (ZO) na melanogenezi stimulovanou -MSH a jejich základní mechanismy. Zde ukazujeme, že ZER významně potlačuje melanogenezi indukovanou -MSH upregulací fosforylace ERK1/2 a inhibicí exprese melanogenních genů zprostředkované MITF.

2. Výsledky

2.1. Zerumbone (ZER) potlačuje melanogenezi indukovanou MSH v buňkách myšího melanomu B16F10

Abychom mohli studovat antimelanogenní účinek zerumbonu (ZER), nejprve jsme hodnotili jeho cytotoxicitu v buňkách B16F10 i HaCaT. Chemická struktura ZER je znázorněna na obrázku 1A. Bylo pozorováno, že ZER při koncentracích nad 20 uM vykazoval silný cytotoxický účinek, zatímco při koncentracích pod 20 uM ZER nevykazoval cytotoxicitu v obou buněčných liniích (obrázek 1B). Dále jsme zkoumali inhibiční účinky ZER na akumulaci a sekreci melaninu v buňkách B16F10 indukovanou -melanocyty stimulujícím hormonem (-MSH). Ukázalo se, že ZER silně potlačuje intracelulární akumulaci melaninu indukovanou MSH a jeho sekreci do kultivačního média (obrázek 1C, D). Navíc jsme zjistili, že ZER zeslabuje melanogenezi účinněji než 1 mM arbutin nebo 0,2 mM kyselina kojová, dobře známé aktivní složky kosmetiky pro bělení pokožky (obrázek 1D). Abychom objasnili, zda je ZER dostatečný k potlačení melanogeneze v lidských buňkách, použili jsme buňky lidského melanomu G361 produkující melanin. Jak je znázorněno na obrázku 1E, ZER významně snižuje extra- a intracelulární obsah melaninu indukovaný faktorem kmenových buněk (SCF). Tyto výsledky potvrzují antimelanogenní aktivitu ZER v melanogenních myších B16F10 a lidských G361 buňkách.

2.2. Zerumbone potlačuje genovou expresi melanogenetického transkripčního faktoru, MITF a jeho cílových genů v buňkách lidského melanomu G361 

Uvádí se, že endotelin{0}} a signalizace SCF hrají zásadní roli v melanogenezi v lidských melanocytech a několika podtypech melanomu [3,14–16]. V této studii jsme zjistili, že ZER potlačuje melanogenezi po melanogenních stimulech, -MSH a SCF, v myších B16F10 a lidských melanomových buňkách G361 (obrázek 1).

Měřili jsme tedy změny v hladinách exprese genů a proteinů souvisejících s melanogenezí po stimulaci SCF v buňkách lidského melanomu G361. Zjistili jsme, že ZER zeslabuje SCF-indukovanou expresi MITF a tyrosinázového proteinu 2–4 hodiny a 24–48 hodin po stimulaci SCF (obrázek 2A). Kromě toho byla v buňkách G361 ošetřených ZER potlačena genová exprese genů souvisejících s melanogenezí, jako je MITF, tyrosináza a protein 1 související s tyrosinázou (TYRP1) (obrázek 2B, C). Tyto výsledky odhalily maximální dobu pro expresi genů souvisejících s melanogenezí po stimulaci SCF; maximální indukce mRNA MITF byla pozorována během 1–2 hodin a hladiny mRNA tyrosinázy a TYRP1 dosáhly svého maxima 24–48 hodin po stimulaci SCF.

2.3. Zerumbone potlačuje expresi melanogenních genů a enzymů v myších buňkách B16F10

Abychom prozkoumali molekulární mechanismus, kterým ZER potlačuje melanogenezi, měřili jsme genovou expresi melanogenetického transkripčního faktoru, MITF, a jeho cílových genů, jako je protein 1 související s tyrosinázou (TYRP1), tyrosináza a protein 2 související s tyrosinázou (TYRP2). v nepřítomnosti nebo přítomnosti ZER. Vzhledem k tomu, že maximální doba exprese genů souvisejících s melanogenezí po stimulaci SCF a -MSH je známa pro lidské melanomové buňky G361 (obrázek 2) a myší B16F10 [4], dále jsme měřili expresi MITF, tyrosinázy, TYRP1 a TYRP2. v myších melanomových buňkách B16F10 ošetřených ZER po 2 hodinách nebo 48 hodinách inkubace s -MSH. Obrázek 3A ukazuje, že ZER je dostatečný pro zeslabení exprese MITF, TYRP1, TYRP2 a tyrosinázy v buňkách B16F10 indukované -MSH. Podobně byly hladiny exprese MITF, tyrosinázy a proteinu TYRP2 po léčbě ZER sníženy. Fosforylace CREB zprostředkovaná proteinkinázou A (PKA) je hlavní signální dráhou zvyšující MITF na transkripční úrovni po stimulaci -MSH [4]. Zde jsme tedy analyzovali, zda snížená fosforylace CREB pomocí ZER může zprostředkovat potlačení MITF. Zjistili jsme, že fosforylace CREB indukovaná -MSH nebyla ovlivněna ošetřením ZER, což naznačuje, že ZER potlačuje expresi MITF indukovanou -MSH nezávisle na ose signální dráhy PKA-CREB (obrázek 3B). Protože tyrosináza je enzym omezující rychlost, který reguluje syntézu melaninu [2,4,11], dále jsme analyzovali hladiny intracelulárního proteinu tyrosinázy a její enzymatickou aktivitu po léčbě arbutinem, kyselinou kojovou a ZER. Obrázek 3C ukazuje, že ZER dostatečně snižuje hladiny tyrosinázového proteinu indukovaného MSH v buňkách B16F10. Obrázek 3D navíc ukazuje, že 10 uM ZER účinněji potlačuje oxidaci L-DOPA než inhibitory tyrosinázy, arbutin a kyselina kojová, což naznačuje, že oxidace L-DOPA na dopachinon prostřednictvím enzymatické aktivity tyrosinázy je v buňkách ošetřených ZER potlačena. . Tyto výsledky ukazují, že ZER zeslabuje melanogenezi zprostředkovanou MSH potlačením genové exprese MITF, transkripčního faktoru spojeného s melanogenezí, a jeho cílových genů.

2.4. Antimelanogenní účinek zerumbonu je prostřednictvím fosforylace ERK1/2

Je známo, že aktivace proteinkinázy B (AKT) a kináz regulovaných extracelulárním signálem (ERK1/2) růstovými faktory nebo melanogenními stimuly potlačuje melanogenezi prostřednictvím snížené exprese MITF a jeho cílových genů [11]. Fosforylace MITF na Ser73 a Ser409 v reakci na signální dráhu ERK1/2 podporuje jeho degradaci závislou na proteazomu [17,18]. Proto jsme zkoumali, zda ZER reguluje fosforylaci ERK1/2 v myších B16F10 a G361 lidských melanomových buňkách. Zvýšená fosforylace ERK1/2 (p-ERK1/2), ale ne celková ERK1/2 (T-ERK1/2), byla pozorována po léčbě ZER způsobem závislým na čase a dávce (obrázek 4A, B). Je zajímavé, že bylo pozorováno, že fosforylace ERK1/2 se rychle zvýšila během 10–30 minut a 1–2 hodin po léčbě ZER v myších B16F10 a lidských melanomových buňkách G361 (obrázek 4A). Fosforylace AKT a MEK však nebyla po ošetření ZER pozorována, což naznačuje, že fosforylace ERK1/2 indukovaná ZER může potlačit MITF (obrázek 4B). Protože fosforylace ERK1/2 podporuje fosforylaci a proteasomální degradaci MITF [17,18], zkoumali jsme, zda inhibitor proteazomu zabraňuje redukci MITF pomocí ZER. Potlačení MITF pomocí ZER nebylo pozorováno v přítomnosti MG132, což potvrzuje, že ZER snižuje expresi MITF prostřednictvím proteasomální degradace (obrázek 4C). Dále jsme zkoumali, zda ZER fosforyluje MITF na Ser73, což je cílový zbytek ERK1/2. Pro detekci fosforylovaného MITF byly buňky vystaveny působení -MSH a MG132. Zde jsme zjistili, že fosforylovaný MITF (Ser73) byl významně zvýšen pomocí ZER v přítomnosti -MSH a MG132 (obrázek 4D). U0126, selektivní inhibitor mitogenem aktivované proteinkinázy (MAPK) [19], zrušil ZER-indukovanou fosforylaci MITF (obrázek 4D). Navíc celkové hladiny proteinu MITF v lyzátech celých buněk (WCL) nebyly změněny pomocí ZER a U0126 v přítomnosti MG132 (obrázek 4D). Tyto výsledky naznačují, že fosforylace MITF (Ser73) zprostředkovaná ERK1/2- a proteasomální degradace jsou kritickým mechanismem v potlačení MITF zprostředkované ZER. Kromě toho obrázek 4E ukazuje, že U0126 významně obnovil snížené hladiny proteinu MITF v buňkách ošetřených ZER. Snížený obsah intracelulárního melaninu pomocí ZER byl obnoven pomocí U0126 na přibližně 40 procent (obrázek 4F), což naznačuje, že aktivace ERK1/2 je nutná pro antimelanogenní účinek ZER.

2.5. Antimelanogenní účinek extraktů Zingiber Offificinale (ZO).

ZER je fytochemikálie odvozená z několika rostlinných druhů z čeledi Zingiberaceae, jako je Zingiber zerumbet a Zingiber officinal [12]. Původně jsme tedy měřili životaschopnost buněk v nepřítomnosti nebo přítomnosti extraktu ZO v buňkách B16F10 a HaCaT. Obrázek 5A ukazuje, že životaschopnost buněk nebyla ovlivněna ošetřením extraktem ZO. Dále jsme analyzovali antimelanogenní účinky extraktu Zingiber officinal (ZO). Protože exprese MITF a jeho cílových melanogenních genů byla snížena pomocí ZER prostřednictvím aktivované signální dráhy ERK1/2 (obrázky 2 a 3), zkontrolovali jsme, zda extrakt ZO potlačuje MITF indukovaný MSH a expresi jeho cílových melanogenních proteinů v buňkách B16F10. Podobně jako anti-melanogenní účinek ZER, -MSH-indukovaný MITF, tyrosináza a TYRP2 byly významně sníženy extraktem ZO způsobem závislým na dávce (obrázek 5B). Je zajímavé, že fosforylace ERK1/2 byla také zvýšena v buňkách ošetřených extraktem ZO (obrázek 5B). Exprese MITF a jeho cílových genů, jako je tyrosináza, TYRP1 a TYRP2, byla významně snížena po ošetření 5 ug/ul ZO extraktem (obrázek 5C). Kromě toho byl jak extracelulární, tak intracelulární obsah melaninu významně snížen na přibližně 40 procent po ošetření 5 ug/ul ZO extraktem (obrázek 5D). Kromě toho byla pozorována snížená aktivita tyrosinázy v buňkách, které byly ošetřeny extraktem ZO (obrázek 5E). Tyto výsledky naznačují, že extrakt Zingiber officinal (ZO) potlačuje melanogenezi tím, že zeslabuje expresi melanogenního genu zprostředkovanou MITF.

Další informace: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501