Účinek extraktů z banánové slupky Sucrier na inhibici melanogeneze prostřednictvím signální dráhy ERK
Apr 25, 2023
Abstraktní
Hyperpigmentace je typ pigmentové poruchy vyvolané nadměrnou expresí obsahu melaninu, který aktivuje závažné estetické problémy, jako je melasma, piha, ephelides, lentigo a další formy na lidské kůži. Několik bělicích činidel má omezené použití kvůli jejich vedlejším účinkům nebo stabilitě, jako je kyselina kojová, kyselina askorbová a hydrochinon, mohou působit jako cytotoxické látky spojené s dermatitidou a rakovinou kůže. K nalezení bezpečné látky se tato studie zaměřila na nalezení schopnosti několika složek v extraktech z banánové slupky Sucrier (SBP) inhibovat proces melanogeneze prostřednictvím signální dráhy p38 v buňkách myšího melanomu B16F10. Aktivita tyrosinázy a obsah buněčného melaninu byly způsoby závislé na dávce, které se po léčbě SBP snižovaly. Kromě toho SBP snižoval expresi proteinů souvisejících s melanogenezí, jako je transkripční faktor spojený s mikroftalmií (MITF) a protein tyrosinázy po 24 hodinách inkubace se stimulací hormonů stimulujících melanocyty (MSH). Zjištění prokázala, že SBP obsahoval účinnou látku pro inhibitory hyperpigmentace prostřednictvím signálních drah p38 bez jakéhokoli účinku na dráhu ERK a následně down-reguloval expresi MITF a produkci rodiny enzymů tyrosinázy.
Podle relevantních studiícistancheje obyčejná bylina, která je známá jako "zázračná bylina, která prodlužuje život". Jeho hlavní složkou jecistanosid, která má různé účinky jako napřantioxidant, protizánětlivé, apodpora imunitních funkcí. Mechanismus mezi cistanche a bělením kůže spočívá v antioxidačním účinku cistanchových glykosidů.melaninv lidské kůži vzniká oxidací tyrosinu katalyzovanou tyrosinázou a oxidační reakce vyžaduje účast kyslíku, takže se volné radikály v těle stávají důležitým faktorem ovlivňujícím produkci melaninu.Cistancheobsahuje cistanosid, což je antioxidant a může tak snížit tvorbu volných radikálů v těleinhibující produkci melaninu.
Klikněte na Kde mohu koupit Cistanche
Další informace:
david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
klíčová slova:banánová slupka sukrier; fenolické sloučeniny; tyrosináza; transkripční faktor spojený s mikroftalmií; melanogeneze
Úvod
Melanin je produkován v melanosomu, který je důležitou organelou uvnitř buněk melanocytů. Melanocyt se nachází v bazální vrstvě kožní epidermis. Po výrobním procesu je melanin pigmentem zodpovědným za zbarvení kůže, vlasů a očí, který funguje jako naturalizovaný antioxidant, detoxikační činidlo a silný chelátor kationtů a může také fungovat jako univerzální ochrana proti poškození UV zářením [1]. Abnormální produkce melaninu může způsobit poruchy pigmentace, jako je hypopigmentace a hyperpigmentace. Hypopigmentace způsobuje vitiligo, albinismus a abnormální problémy s vlasy, zatímco hyperpigmentace způsobuje pihy, melasma, stařecké skvrny a pozánětlivou hyperpigmentaci. Genetická predispozice, hormonální změny, zejména estrogen a další, jako jsou onemocnění jater, nádor, rakovina, podvýživa nebo nepravidelná funkce hypofýzy, jsou vnitřními faktory včetně vnějších faktorů, jako je expozice UV záření, a toxické látky jsou hlavní příčinou hyperpigmentace [2]. .
Tyrosináza je krok omezující enzym, který se zaměřuje na proces stimulace i inhibice procesu produkce melaninu. Stimulace melaninu se používá jako opalovací prostředek nebo k depigmentaci vlasů. Exprese tyrosinázy je řízena transkripčním faktorem spojeným s mikroftalmií (MITF), což je transkripční faktor specifický pro melanocyty, který řídí diferenciaci, proliferaci a přežití melanocytů [3, 4]. Zodpovědnost MITF za melanogenezi je zvýšit expresi tyrosinázy vazbou na DNA ve struktuře homodimeru nebo heterodimeru s proteinem MiT, tato vazebná místa zahrnují E-Box a M-Box obklopující thymidinový nukleotid, který stimuluje kontinuální kroky k produkci melanogenního enzymu. jako je protein 1 příbuzný tyrosináze (TRP-1), protein příbuzný tyrosináze-2 (TRP-2) a dopachrom tautomeráza. Regulace MITF začíná signální transdukcí poté, co se -MSH naváže na receptor MC1R, který stimuluje mitogenem aktivovanou proteinkinázu (MARKs), což je serin/threoninkináza a také zahrnuje extracelulární signalizací regulovanou kinázu (ERK) a také p38. Několik studií zjistilo, že syntéza melaninu je řízena několika signálními cestami, jako je fosfotidylineasital-3-kináza (PI3K/AKT), může být potlačena přírodními látkami, které obsahují polyfenolovou skupinu prostřednictvím ERK signální dráhy myších melanomových buněk B16F10 [5,6 ].
Cílem této studie bylo zjistit účinek inhibice melanogeneze z extraktů banánové slupky Sucrier (SBP). SBP může obsahovat několik typů polyfenolických sloučenin, které působí jako inhibitory tyrosinázy, jako je katechin, prokyanidin, kyselina ferulová a kyselina gallová, které jsou detekovány expresí signálních drah ERK, které ovlivňují produkci melanogenních enzymů, jako je TRP-1 a TRP-2 [7-10].
Materiály a metody
Chemikálie a materiály
Natrhané (7 dní po sklizni) slupky banánů Sucrier (Musa spp.) z provincie Kampangpetch, Thajsko. Omyté banánové slupky vodou, poté vypálené na slunci do úplného vysušení, rozemleté v mixéru a extrahované namáčením v 60% methanolu po dobu 24 hodin (MW24), odstřeďované s 95% ethanolem po dobu 10 minut při 4 stupních (E4), vroucí v DI voda o teplotě 60 stupňů po dobu 20 minut (W60) a vaření v 95% methanolu při teplotě 60 stupňů po dobu 20 minut (M60). Dalším krokem bylo snížení objemu pomocí rotační odparky na 40 stupňů a sušení v lyofilizační sušičce Christ Alpha- 4 LD plus.
Buněčná kultura
Buňky myšího melanomu B16F10 byly kultivovány v Dulbeccově modifikovaném Eaglově médiu (DMEM) doplněném 10 procenty fetálního bovinního séra při 37 stupních v inkubaci s 5 procenty CO2. Po 24 hodinách inkubace se médium vyměnilo za médium bez séra s různými koncentracemi extraktů z banánové slupky Sucrier (SBP) se stimulací -MSH. Poté byly buňky sklizeny trypsinizací pro další experimenty.
Test životaschopnosti buněk
Cytotoxicita extraktů SBP byla měřena testem MTT. Buňky (5 × 10 3) byly nasazeny na 96jamkové destičky a kultivovány v DMEM po dobu 24 hodin při 37 stupních v inkubaci s 5 % CO2, poté bylo médium změněno na médium bez séra s různými koncentracemi extraktů SBP pro 48 hodin. Po ošetření bylo médium odstraněno a dvakrát promyto studeným PBS, do každé jamky bylo přidáno 100 ul roztoku MTT (5 mg/ml), inkubováno při 37 stupních po dobu 4 hodin a poté měřeno ELISA čtečkou při 420 nm.
Test obsahu melaninu
Sklizené buňky byly lyžovány ve studeném lyzačním pufru (20 mM fosforečnan sodný pH 6,8, 1 procento tritonX-100, 1 mM PMSF a 1 mM EDTA) a poté centrifugovány při 1200 otáčkách za minutu při 4 stupních po dobu 10 minut, aby se oddělil supernatant, zatímco pelety melaninu byly rozpuštěny ve 200 ul 1N NaOH po dobu 60 minut při 80 stupních. Pro měření absorbance při 415 nm byla použita čtečka ELISA. a vypočteno ve srovnání s obsahem proteinu z testu obsahu proteinu kyseliny bicinchoninové (BCA) (Pierce Biotechnology, Packford, IL, USA).
Western blot analýza
Supernatant, který byl separován během progrese buněčné lýzy, byl odebrán k frakcionaci na SDS-PAGE a poté přenesen na Hybond zesílenou chemiluminiscenční nitrocelulózovou membránu (Amersham, Little Chalfont, UK) a sondu s primární protilátkou proti tyrosináze (Santa Cruz, Biotechnology, Santa Cruz , CA, USA), MITF (Merck Millipore Darmstadt, Německo), ERK (Merck Millipore Darmstadt, Německo), P38 (Merck Darmstadt Millipore, Německo) a monoklonální protilátky proti B-aktinu (AC-15, Sigma Aldrich ). Od té doby inkubujte membránu s vizualizací komplexu sekundární protilátky konjugované s křenovou peroxidázou a kvantifikujte signály pomocí softwaru ImageJ.
Statistická analýza Všechny informace byly analyzovány jako průměr ± standardní odchylka (SD). Jednosměrný test ANOVA se používá k měření rozdílů mezi jednotlivými sadami informací. P-hodnota menší než 0,05 byla považována za statisticky významnou.
Výsledek
Fenolová sloučenina
Cílem tohoto experimentu bylo změřit účinnost rozpouštědel použitých pro extrakci a také metodu, která dokáže extrahovat fenolické sloučeniny v maximální možné míře. Většina fenolických sloučenin se velmi dobře rozpouští při extrakci vysoce polárními roztoky, jako je voda, methanol (MeOH), ethanol (EtOH), aceton, ethylacetát, propanol, kyselina octová nebo jejich směsi v různých částech [11]. Obrázek 1A ukazuje, že W60 může extrahovat fenolické sloučeniny až 16,24 ug/ml následované M60, E4 a MW24 s celkovým fenolem 13,89, 9,21 a 8,38 ug/ml, v daném pořadí. Cytotoxicita SBP byla experimentována pomocí MTT redukčního testu, který měřil redukční prostředí z mitochondriální funkce živých buněk měřením tvorby formazanu pro získání cytotoxických účinků. Výsledek zjistil, že SBP v uvedených koncentracích (až 500 µg/ml) při 48hodinové inkubaci. Cytotoxicita nevykazuje žádný významný účinek po léčbě SBP (obr. 1B).
Účinky SBP na aktivitu enzymu a obsah melaninu v buňkách B16F10
Pro testování potlačení melanogeneze SBP bylo prvním krokem testování schopnosti inhibice enzymu houbové tyrosinázy ve srovnání s kyselinou kojovou, která je komerčním bělícím činidlem. SBP (MW24) má vyšší účinnost než kyselina kojová a jiné extrakce ve stejné koncentraci (100-500 µg/ml). MW24 má nejvyšší procento inhibice tyrosinázy (66.39-77,05 procenta), zatímco kyselina kojová má procento inhibice tyrosinázy pouze 44.68-59,93 procent, jak je znázorněno na obr. 1C. Od té doby byla MW24 s nejvyšším procentem inhibice tyrosinázy vybrána pro měření antimelanogeneze produkcí melaninu z buněk B16F10. Obsah melaninu v buňkách B16F10 byl snížen po ošetření SBP (MW24) (obr. 2A). Množství obsahu melaninu v B16F10 buňkách významně klesá po stimulaci -MSH a ošetření SBP (MW24) po dobu 24 hodin způsobem závislým na dávce, jak je ukázáno na Obr. 2B.
Účinky SBP (M24) na hladiny proteinové exprese tyrosinázy a MITF
Western blot analýza byla použita pro tyrosinázovou a MITF aktivitu měřením hladin proteinové exprese po ošetření SBP (MW24) po dobu 24 hodin. Regulace melanogenních enzymů, jako je TRP-1 a TRP-2, vyplynula z transkripčního účinku MITF a hladiny proteinu tyrosinázy. Výsledky ukazují, že SBP (MW24) byl schopen v závislosti na dávce snížit expresi tyrosinázy i proteinu MITF, jak je znázorněno na Obr.
Účinek SBP (M24) na inhibici melanogeneze prostřednictvím signální dráhy mitogenem aktivované proteinkinázy (MAPKs)
V melanogenezi s tímto postupem přímo souvisí rodina kináz MAPK, zejména ERK a p38 [12]. Signalizace ERK bude down-regulovat, zatímco signalizace p38 bude up-regulovat během výskytu produkce melaninu. Fosforylace ERK a p38 však bude mít opačný postup produkce melaninu. Výsledky ukázaly jasný účinek po ošetření SBP (MW24) pomocí -MSH aktivovaného imunoblotem na signální dráhu MAPK. SBP (MW24) mírně snížil expresi proteinu p38 a zvýšil fosforylaci p38. Tento výsledek ukázal způsob, jak inhibovat proces melanogeneze prostřednictvím dráhy p38 bez jakéhokoli účinku na ERK, ale fosforylace hladiny proteinu ERK se mírně snížila po ošetření -MSH a SBP (MW24), jak je znázorněno na Obr.
Diskuse
Banánové slupky Sucrier jsou zemědělským odpadem, který má nadbytek mnoha účinných látek, zejména ve skupině fenolických sloučenin a karotenoidů, které jsou sekundárním metabolitem, který rostliny vytvářejí pro sebeobranné mechanismy [7]. Tyto látky lze nalézt v listech, kůře, plodech, slupkách a semenech téměř všech rostlin. Fenolické sloučeniny a karotenoidy jsou fytochemické látky, které mají dobré vlastnosti pro lidské zdraví. Mezi látky patří protizánětlivé, antivirové, analgetické, antioxidační, antikarcinogenní atd. [13]. Obecně lze fenolické sloučeniny dobře rozpustit ve vysoce polárních rozpouštědlech. Pro experiment by extrakce MW24 měla být schopna extrahovat fenolické sloučeniny nejvíce kvůli postupu extrakce z Folin-Cicualteuova testu. Nejprve byly extrahovány nízko polární sloučeniny, poté následovaly vysoce polární látky v závislosti na konečném směšovacím poměru rozpouštědla v postupu. Výsledky ukazují, že W60 dokáže extrahovat fenolické sloučeniny nejvíce, možná díky teplotě 60 stupňů Celsia, což by mohla být vhodná teplota pro extrakci fenolických sloučenin [11]. Lze také předpokládat, že SBP může obsahovat vysoce polární látky, které se dobře rozpouštějí ve vodě. Při porovnání množství celkových fenolických sloučenin, jak je znázorněno na obr. 1A, W60, M60, E4 a MW24 významně prokázaly možnost rozpustnosti látky.
Poté, co bylo známo celkové množství fenolické sloučeniny, můžeme přistoupit k přesnému určení typu a množství flavonoidních a karotenoidních látek. Zjistili jsme, že extrakty SBP (MW24) obsahují kyselinu ferulovou až 906,62 mg/100 g a také jsme našli malé množství luteinu a -karotenu, které byly zařazeny do skupiny karotenoidů na 1,23 a 2,37 mg/100 g. SBD (MW24) má stále vysoké procento inhibice tyrosinázy. Proto byl pro další studium vybrán SBP (MW 24).
Z testování cytotoxicity nebyla zjištěna žádná významná cytotoxicita u SBP, ačkoli množství použité koncentrace bylo až 500 µg/ml. možná proto, že malé množství karotenoidů v extrakci má schopnost chránit buňky. Látky v této skupině mají antioxidační vlastnosti, které mohou přerušit jed prostřednictvím cytochromu P-450, zejména -karotenu, který má stimulační roli v imunitních funkcích interakcí s reakčními druhy kyslíku (ROS). To podpoří účinnost fenolické sloučeniny, která má schopnost vychytávání ROS snížit zánětlivý cytokin [14]. Takže SBD (MW24) nejenže nemá toxický účinek, ale má také roli ochrany buněk.
Naše studie také zjistila, že SBP (MW24) má schopnost inhibovat melanogenezi buněk B16F10. Exprese tyrosinázy a MITF byla snížena po léčbě SBP (MW24) v obou případech hodnocených pomocí houbové tyrosinázy a analýzy Western blot způsobem závislým na dávce. Tento test ukázal, že SBP (MW24) může potlačit tvorbu melaninu down-regulací signální dráhy p38 a up-regulací fosforylace p38, které aktivují degradaci proteinu MITF a následně snižují expresi rodiny melanogenních enzymů, jako je tyrosináza. Potlačení p38 snižuje funkce vazebného proteinu cAMP Response Binding Protein (CREB), což je důležitý transkripční faktor, který spolupracuje s PAX3 a SOX10, který se váže na M-BOX genu MITF, aby aktivoval expresi proteinu MITF, který ovlivňuje proces produkce melaninu a aktivitu přežití buněk [15 ]. Obecně, aktivace ERK vede k fosforylaci MITF na serinu 73, což způsobuje ubikvitinaci a případně degradaci. Většina přírodních sloučenin může inhibovat melanogenezi prostřednictvím stimulačního procesu signální dráhy ERK, ale SBP (MW24) signální dráhu ERK významně neovlivnil [16].
Mnoho výzkumů zjistilo, že fenolové sloučeniny a karotenoidy mohou inhibovat produkci melaninových pigmentů, protože beta-karoten má schopnost absorbovat fotony UVB a zároveň má vlastnost antioxidantu rozpustného v tucích a fenolová sloučenina může aktivovat Nrf2, blokovat ROS receptory, snižovat zánětlivé procesy. produkci cytokinů a indukují expresi y-GSC, což podporuje naši studii, ale odlišným způsobem inhibice melanogeneze [17]. Kromě kyseliny ferulové nalezené v SBP (MW24) byla hlavní látkou ve skupině fenolických sloučenin potvrzených několika studiemi, že má vlastnost antimelanogeneze, protože může modulovat expresi vaskulárního endoteliálního růstového faktoru (VEGF), indukuje oxid dusnatý syntáza, působí jako tumor supresorový gen a také souvisí s postupem produkce melaninových pigmentů. V roztoku SBP (MW24) může kyselina ferulová zvýšit účinnost při smíchání s karotenoidem nebo jinými fosfolipidy, protože se zvýší rozpustnost ve vodě, rozpustnost v lipidech a biologická dostupnost, což vede ke zlepšení inhibice melanogeneze buněk B16F10 [18]. Důsledek všech výsledků uzavírá, že SBP (MW24) by mohl účinně snížit melanogenezi.
Zkratky
MITF: transkripční faktor spojený s mikroftalmií; -MSH: -hormon stimulující melanocyty; MC1R: melanokortin-1 receptor; TRP1: protein 1 související s tyrosinázou; TRP2: protein 2 související s tyrosinázou; MAPK: mitogenem aktivovaná proteinkináza.
Poděkování
Tato práce byla podpořena granty Royal Golden Jubilee Ph.D.: RGJPHD. Thajsko. (PH.D./0017/2558).
Autorské příspěvky
RH, KT, KS a UP vymysleli a navrhli experimenty; RHCHL a MC provedly experimenty; RH a MC a CHL analyzovaly data; RH přispěl reagenciemi/materiály/nástroji pro analýzu; RH a CHL napsali článek.
Konkurenční zájmy
Autoři prohlásili, že neexistuje žádný konkurenční zájem.
Reference
1.Regnault MR, Gadaud N, Boulinguez S, Tournier E, Lamant L, Gladieff L, et al. Retikulární hyperpigmentace související s chemoterapií: série případů a přehled literatury. Dermatologie 2015; 231: 312-8.
2. Ali A. Dermatology Obrazová recenze. McGraw Hill Education 2010. ISBN978-0-07-179323-0.
3. Garraway LA, Widlund R, Rubin MA, Getz G, Berger AJ, Ramaswamy S, Beroukhim R, et al. Integrativní genomové analýzy identifikují MITF jako onkogen pro přežití linie amplifikovaný u maligního melanomu. Příroda 2005; 436: 117–22.
4. Busca R, Ballotti R. Cyklický AMP klíčový posel v regulaci pigmentace kůže. Pigment Cell and Melanoma Research 2000; 13: 60-9.
5. Zhou J, Ren T, Li Y, Cheng A, Xie W, Xu L a kol. Oleoylethanolamid inhibuje melanogenezi stimulovanou melanocyty stimulujícím hormonem prostřednictvím signálních drah ERK, Akt a CREB v buňkách melanomu B16. Oncotarget 2017; 8: 56868-79.
6. Onkoksoong T, Jeayeng S, Poungvarin N, Limsaengurai S, Thamsermsang O, Tripatara P, Akarasereenont P, Panich U. Thajský bylinný antipyretický přípravek 22 (APF22) inhibuje melanogenezi zprostředkovanou UVA prostřednictvím aktivace antioxidantu regulovaného Nrf2- obrana. Výzkum fytoterapie 2018; 32: 1546-54.
7. Singh B, Singh JP, Kaur A, Singh N. Bioaktivní sloučeniny v banánu a jejich související zdravotní přínosy – recenze. Chemie potravin 2015; 1: 1-11.
8. Leerach N, Yakaew S, Phimnuan P, Soimee W, Nakyai W, Luangbudnark W, Viyoch J. Účinek thajského banánu (skupina Musa AA) při snižování akumulace konečných produktů oxidace v kůži myší ozářených UVB zářením. Journal of Photochemistry & Photobiology, B: Biology 2017; 168: 50-58.
9. Hung BY, Kim SY, Jung JM, Won CH, Choi JH, Lee MW. Antimykotikum klotrimazol inhibuje melanogenezi urychlením degradace tyrosinázy zprostředkované ERK a PI3K-/Akt. Experimentální dermatologie 2015; 24: 381-400.
10. Shen T, Heo SI, Wang MH. Zapojení signální dráhy p38 MAPK a ERK do antimelanogenního účinku methyl 3,5- caffeoyl chinátu v buňce myšího melanomu B16F10. Chemicko-biologická interakce 2012; 199: 106-11.
11. Ruesgas-Ramón M, Figueroa-Espinoza MC, Durand E. Aplikace hlubinných eutektických rozpouštědel (DES) pro extrakci fenolických sloučenin: Přehled, výzvy a příležitosti. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2017; 10: 3591-3601.
12. Tsao YT, Kuo CY, Kuan YD, Lin HC, Wu LH, Lee CH. Extrakty Astragalus membranaceus inhibují melanogenezi prostřednictvím signální dráhy ERK. International Journal of Medical Sciences 2017; 3: 1049-53.
13. Chang TS. Aktualizovaný přehled inhibitorů tyrosinázy. International Journal of Molecular Sciences 2009; 26: 2440-75.
14. Juturu V, Bowman JP, Deshpande J. Celkový tón pleti a účinky zlepšující zesvětlení pleti při orálním doplňování izomerů luteinu a zeaxantinu: dvojitě zaslepená, placebem kontrolovaná klinická studie. Klinická, kosmetická a vyšetřovací dermatologie 2016; 7: 325-332.
15. Bell RE, Levy C. Tři m: melanom, transkripční faktor spojený s mikrooftalmií a mikroRNA. Výzkum melanomu pigmentových buněk 2011; 24: 1088–106.
16. Zhou J, Ren T, Li Y, Cheng A, Xie W, Xu L, Peng L. Oleoylethanolamid inhibuje melanogenezi stimulovanou hormony stimulující melanocyty prostřednictvím signálních drah ERK, Akt a CREB v buňkách melanomu B16. Oncotarget 2017; 23: 56868-79.
17. Toews DPL, Hofmeister NR, Taylor SA. Evoluce a genetika zpracování karotenoidů u zvířat. Trendy v genetice 2017; 33: 171-182.
18. Li L, Liu Y, Xue Y, Zhu J, Wang X, Dong Y. Příprava komplexu kyselina ferulová-fosfolipid pro zlepšení rozpustnosti, rozpouštění a inhibiční aktivity buněčné melanogeneze B16F10. Chemistry Central Journal 2017; 22: 11-26.
Další informace: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
