Aktivita xantin oxidoreduktázy v plazmě chudé a bohaté na krevní destičky jako indikátor oxidačního stresu u pacientů, kteří potřebují substituční léčbu ledvin

Abstraktní pozadí: Xanthin oxidoreduktáza(XOR) je enzym hydroxyláza zapojený do metabolismu purinů. Aktivita XOR se může lišit: homodimerní protein může být přeměněn na dvě různé izoformy XD (antioxidant) a XO (prooxidant). Oxidační stres a záněty, které doprovázejíchronické onemocnění ledvin(CKD), dialýza a transplantace ledvin vedly k aktivaci krevních destiček. Cílem této studie bylo zjistit vliv aplikované renální substituční terapie na xantinoxidoreduktázu a její izoformní aktivitu.

Materiály a metody: Studijní soubor tvořilo 117 pacientů rozdělených do 4 skupin: hemodialyzovaní - 30 pacienti, peritoneální dialyzovaní - 30 pacienti, pacienti po transplantaci ledviny - 27 a konzervativní léčba {{5} } pacientů. Kontrolní skupinu tvořilo 30 zdravých dobrovolníků. Výsledky: V rámci sledovaných skupin byly zjištěny signifikantní rozdíly v aktivitě XOR v plazmě chudé na destičky (PPP) (p=0.001). Existuje vztah mezi typem renální substituční terapie všech izoforem oxidoreduktázy u PPP (str<0.001 all isoforms) and XD (p=0.008), XO (p<0.001) in platelet-rich plasma (PRP). A relationship was observed between the activity of all oxidoreductase isoforms in PPP and PRP, the type of renal replacement therapy the duration of dialysis, and the age of patients. Thepříčinou chronického onemocnění ledvinse projevilo i v rozdílech v aktivitě XD a XO v PPP.

Závěr: Typ renální substituční terapie u pacientů s CKD, věk pacientů, délka dialýzy, příčiny CKD a stadium progrese významně ovlivňují aktivitu XOR a jeho izoforem.

Klíčová slova: Xanthin oxidoreduktáza, Krevní destičky, Renální substituční terapie,Chronické onemocnění ledvin, Antioxidační enzymy

JAK DLOUHO TRVÁ, NEŽ CISTANCHE PŮSOBÍ?

Pozadí

Xanthinoxidoreduktáza (XOR) je hydroxylázový enzym zapojený do metabolismu purinů. Katalyzuje oxidaci hypoxantinu na xantin a xanthinu na kyselinu močovou (UA). Aktivita XOR se může měnit: homodimerní protein může být převeden na dvě různé izoformy. Xanthindehydrogenáza (XD) je exprimována převážně ve zdravé tkáni a xantinoxidáza (XO) je generována posttranslační modifikací XD, oxidací cysteinových zbytků a také omezenou proteolýzou, která hraje dominantní roli v buňkách a tkáních při poranění [1–3 ]. Činnosti zmíněných izoforem stojí proti sobě [4]. XOR působí v přítomnosti NAD+ jako dehydrogenáza a s molekulárním kyslíkem jako oxidáza. Schopnost XOR rychle přecházet z antioxidantu na oxidant při různých typech poškození tkání je nezbytným prvkem pro rychlou vrozenou imunitní odpověď, prospěšnou například při bakteriální nebo plísňové infekci [5].

Reakční meziprodukty xanthindehydrogenázy (XDO) a kyslíku mohou reagovat s NAD+ i O2, ale vykazují vyšší afinitu k NAD+ [6]. Tato meziproduktová izoforma nebyla izolována, ale stanovení její aktivity usnadňuje sledování transformace XD na XO [7].

Aktivita XOR v séru u různých onemocnění byla široce zkoumána. Důvodem zájmu o tento enzym je dualismus jeho působení: schopnost produkovat antioxidanty a na druhé straně tvorba reaktivních forem kyslíku. Ke zvýšení aktivity XOR dochází u patologických stavů, jako je virová hepatitida, infekční mononukleóza, autoimunitní onemocnění, pneumonie, schizofrenie a diabetes typu II. Zvýšení aktivity XOR je pozorováno také v séru pacientů po transplantaci ledvin nebo jater [8]. Bylo prokázáno, že gen kódující XOR může být zodpovědný za renální zrání a adipogenezi v ledvinách a může bránit transformaci epiteliálních buněk na mezenchymální tkáň [9]. Vzhledem k našim nejlepším znalostem však neexistují žádné publikované zprávy, které by zkoumaly aktivitu XOR v plazmě chudé na destičky (PPP) a plazmě bohaté na destičky (PRP) u pacientů podstupujících renální substituční terapii. Význam aktivity XOR u této skupiny pacientů souvisí se zvýšenou aktivací krevních destiček, která je způsobena oxidačním stresem a zánětem, který doprovází chronické onemocnění ledvin (CKD), dialýzu a transplantaci ledvin. Kromě toho během dialýzy a transplantace orgánů dochází k poškození tkání a krevních cév a krevní destičky jsou prvními buňkami, které se dostanou do místa poškození tkáně, aktivně se účastní počátečních fází zánětlivého procesu a hojení [10].

PRP a PPP jsou frakce krevní plazmy s různými koncentracemi krevních destiček. Obsah krevních destiček v PRP a PPP je počet krevních destiček/ml a krevních destiček/ml. PPP a PRP se získávají opakovaným odstřeďováním a promýváním celé lidské krve při různých rychlostech odstřeďování [11, 12].

PPP jako vedlejší produkt centrifugace antikoagulované krve má nižší koncentraci krevních destiček než normální krev. Hlavními složkami PPP jsou fibrinogen, fibronektin a trombin. Biologické účinky PPP se účastní hemostázy a koagulace, působí jako vektor přichycení buněk a podporují mitózu fibroblastů a epiteliálních buněk [13]. Ačkoli PPP není tak koncentrovaný v krevních destičkách jako PRP, bylo prokázáno, že PPP může také podporovat buněčný růst a přežití. PPP podporuje buněčné funkce spojené s hojením ran a urychluje migraci buněk a proliferaci fibroblastů [14, 15]. Plazma bohatá na krevní destičky má koncentrovanější krevní destičky než normální plazma (přibližně 150–400 × 103 buněk/dl). Je to jedna z nejběžnějších definic PRP v literatuře [16]. Dosud omezené studie charakterizovaly XOR a jeho izoformní aktivitu v plazmě bohaté nebo chudé na krevní destičky u pacientů trpících chronickým onemocněním ledvin. Tan a kol. prokázali, že buňky poškozené reaktivními formami kyslíku (ROS) (v případě chronické renální substituční terapie) „unikají“ izoformy XOR, což vede ke zvýšení hladiny enzymu v plazmě [17]. Tento mechanismus vysvětluje nižší aktivitu XOR a jeho izoforem v krevních destičkách ve srovnání s PPP. Aktivita oxidoreduktáz v PPP a PRP je proto velmi zajímavá, protože by mohly pomoci odhalit buněčné procesy, které se vyskytují denně, sis. Taková vyšetření by také mohla nepřímo upozornit na závažnost oxidačního stresu u této skupiny pacientů.

Berry a kol. popisují také, že xanthin oxidoreduktáza je distribuována v játrech, tenkém střevě, mléčné žláze a endoteliálních buňkách. Metody subcelulární lokalizace prokázaly přítomnost xanthinoxidoreduktázy jak v cytoplazmě, tak na buněčných membránách. Naznačují také, že plazmatická xantinoxidoreduktáza může být způsobena zastíněním xanthinoxidoreduktázy z buněčných membrán nebo únikem z cytoplazmy. To je jeden z důvodů, proč testujeme aktivitu XOR v PPP a PRP, abychom rozlišili aktivitu enzymu v krevních destičkách a dalších krvinkách obsažených v plazmě [18]. Na základě aktivity antioxidačních enzymů můžeme také určit, který typ renální substituční terapie méně pravděpodobně vystaví pacienta oxidačnímu stresu. Vzhledem k duální povaze XOR může být pochopení vztahu mezi typem terapie náhrady ledvin a aktivitou izoforem XOR velmi zajímavé a nápomocné při výběru typu terapie náhrady ledvin.

Materiály a metody

Etický souhlas a souhlas

Provedený výzkum schválila Bioetická komise Pomořské lékařské univerzity ve Štětíně (č. KB−0012/36/11). Všichni účastníci, včetně zdravých dobrovolníků v kontrolní skupině, byli informováni o účelu a rozsahu studie a dali souhlas s darováním vzorků a zveřejněním výsledných dat.

Studijní skupina

Zúčastnilo se 147 účastníků: kontrolní skupina 30 zdravých dobrovolníků (NK) a 117 pacientů s chronickým onemocněním ledvin (CKD), kteří navštěvovali kliniku nefrologie, transplanetologie a interních nemocí Pomořské lékařské univerzity ve Štětíně. Ti pacienti byli rozděleni do 4 skupin na základě léčby, kterou dostávali: 30 pacientů před a po hemodialýze (HD A a HD B): 30 pacientů podstoupilo peritoneální dialýzu (PD); 27 pacientů před a po transplantacích ledvin (5–7 dní po operaci) (TE, TE A); 30 pacientů dostalo konzervativní léčbu (CT) (CKD stadium 2–5). Pohlaví, věk, délka dialýzy, příčina a stadium chronického onemocnění ledvin a koncentrace kreatininu v testované a kontrolní skupině jsou uvedeny v tabulkách 1 a 2.

Vzorky

Všem účastníkům studie byly odebrány vzorky krve (K2EDTA (8 ml), 3,8% citrát trisodný (9:1; v/v) a sérum (8 ml)). Hemodialyzovanému pacientovi byla odebrána krev z arteriovenózní píštěle; u všech ostatních účastníků byla použita periferní venepunkce. Vzorky byly odebrány hemodialyzovaným pacientům před (HD A) a asi 10 minut po zastavení pumpy (HD B). Krev pacientů po transplantaci byla odebrána před transplantací (TE) a 5–7 dní po operaci (TE A). Pacienti zařazení do skupiny TE nepatřili v této studii do skupiny pacientů na hemodialýze nebo peritoneální dialýze. Byli to pacienti kvalifikovaní k transplantaci z celého Polska. Naprostá většina pacientů s transplantací ledvin měla předchozí modální analýzu. Vzorky K2EDTA a sražené krve byly centrifugovány při 2600 ot./min po dobu 10 minut při 20 stupních, aby se získala plazma a sérum, v daném pořadí. Pro získání plazmy bohaté na destičky (PRP) a plazmy chudé na destičky (PPP) byla krev odebraná s citrátem centrifugována za podmínek při 1100 ot./min. po dobu 10 minut při 20 stupních. Výsledný PRP byl přenesen do nové zkumavky a centrifugován při 6000 ot./min po dobu 10 minut při 20 stupních: plazma chudá na destičky (PPP) byla přenesena do samostatné zkumavky; peleta krevních destiček byla dvakrát promyta a suspendována v pufru Tyroda (pH 7,4). Plazma, sérum, PPP a PRP byly zmraženy na -80 stupňů, dokud nebyly provedeny testy. U hemodialyzovaných pacientů byla krev odebírána před podáním heparinu a po dialýze trvající v průměru 4–5 h (poločas heparinu - 4 h), aby se eliminoval možný vliv heparinu na aktivitu XOR.

Aktivita xanthinoxidoreduktázy v plazmě a krevních destičkách chudých na krevní destičky

Stanovení byla provedena pomocí spektrofotometru Perkin Elmer UV/VIS Lambda 40P. Extinkční změny byly zaznamenány při 340 nm (XD) a 302 nm (XDO, XO) po dobu 5 minut při 30 stupních. Enzymatická aktivita byla měřena jako tvorba kyseliny močové a NADH (zvýšení A340 a A302) a vyjádřena v mUx ml-1 (milijednotky na mililitr). Enzymatická aktivita byla vypočtena s ohledem na počáteční rychlosti reakce. Tvorba kyseliny močové byla měřena při 302 nm (izoformy XDO a XO), protože její absorbance je tam stále vysoká, zatímco změny koncentrace NAD+ nepřispívají. Pro výpočet aktivity izoforem xanthinoxidoreduktázy NADH+ H+ byl použit extinkční koeficient pro NADH+ H+ ε340=6,22× 103 [L∙mol−1 cm−1 ]: ε302=2,30×103 [ L∙mol−1 cm−1] [7, 19–22].

Tabulka 1 Obecné charakteristiky hemodialyzovaných pacientů (HD), peritoneální dialýzy (PD) léčených konzervativně (CKD), transplantace ledviny (TE) a kontrolní skupiny (C) účastnících se studie (průměr ± SD)

P * - statistická významnost pro rozdíly mezi skupinami HD, PD a CKD, TE a C exaktní Fisherův test pro kvalitativní proměnné; pro kvantitativní proměnné - jednosměrná ANOVA a; P ** - statistická významnost pro rozdíly mezi skupinami HD, PD a CKD a TE exaktní Fisherův test pro kvalitativní proměnné pro kvantitativní proměnné jednosměrná ANOVA nebo; DM - diabetická nefropatie; HA - hypertenze; GIK - glomerulární zánět ledvin; ADPKD - polycystické onemocnění ledvin dědičné autozomálně dominantní; NS - žádné statisticky významné rozdíly.

Tabulka 2 Obecná charakteristika hemodialyzovaných pacientů (B - před HD, A - po), peritoneální dialýzy (PD) léčených konzervativně (CKD) před a po transplantaci ledviny (TE B a TE A) a kontrolní skupiny (NK) účastnících se studie (průměr±SD)

P * - statistická významnost pro rozdíly mezi HD A, HD B, PD a CKD skupinami, TE a C pro kvantitativní proměnné - Kruskal Wallis ANOVA, jednosměrná ANOVA nebo Studentův t-test P ** - statistická významnost pro rozdíly mezi HD A , HD B, PD a CKD a TE skupiny pro Kruskal Wallisovy kvantitativní proměnné ANOVA nebo ANOVA jednosměrná analýza Kt / V - dialyzační index (objemová frakce V čištěná clearance K v čase t) NS nebyly nalezeny žádné statisticky významné vztahy

Statistická analýza K posouzení distribucí byl použit KS test (Kolmogorov-Smirnov), který v případě některých proměnných (aktivita izoforem XD a XDO v PRP) ukázal nenormální rozložení parametrů. K analýze kvantitativních dat byly použity přesné Fisherovy a Chí-kvadrát testy. Pomocí Studentova t-testu a analýzy ANOVA pro jednorozměrné systémy byly vyhodnoceny rozdíly mezi asociovanými (párovými) a nesouvisejícími (nepárovými) proměnnými v případě proměnných s normálním rozdělením. V případě proměnných s nenormálním rozdělením byla provedena analýza Kruskal-Wallis ANOVA pro vyhodnocení rozdílů mezi parametry, dále Mann-Whitney U neparametrický test pro nepárová data nebo Wilcoxon pro párová data. Pro stanovení vícefaktorového hodnocení vztahů mezi studovanými parametry byl použit lineární vícenásobný regresní model. Statistická analýza výsledků byla provedena pomocí Statistica 12 (StatSoft).