Bělící aktivita složek izolovaných z buničiny trichosanthes

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Rongchao Zhang ,1,2Xiuqin Hu ,1Bo Zhang,1ZhenWang,1Chunxiang Hao,1Jie Xin,1andQingmei Guo 2

Abstraktní: Běleníkosmetický trh má světlou budoucnost a čistě přírodní bělící produkty tradiční čínské medicíny byly vždy centrem výzkumu. V tomto výzkumu byla poprvé izolována a vyčištěna bělící aktivní složka dužiny čínské medicíny Trichosanthes a jejíbělenímechanismus byl objasněn. K jejich izolaci a čištění byly použity chromatografické metody, jako je silikagel, ODS a HPLC. Buňky B16 byly použity k měření antioxidační aktivity,tyrosinázaaktivita a aktivita odstraňování melaninu. Bylo izolováno celkem 20 sloučenin, včetně p-hydroxybenzaldehydu (1), kyseliny salicylové (2), kyseliny vanilové (3), kyseliny isovanilové (4), protokatechuátu (5), kyseliny trans-skořicové (6), {{9 }}kyselina kumarová (7), kyselina trans-ferulová (8), drechslerol-B (9), cyklohexanol 3-palmitát (10), 5-acetoxymethyl-2-furaldehyd (11), 5-hydroxymethylfurfural (12), diosmetin (13), apigenin (14), chrysoberyl (15), luteolin (16), 4′-hydroxyscutellarin (17), kvercetin (18), 3′,{{31} }dihydroxy-7-(-D-glukopyranosyloxy)-4′-methoxyflavon (19) a ciprofloxacin-7-O- -D-glukosid (20). Mezi nimi sloučeniny 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 a 20 mají dobré antioxidační opravné účinky; sloučeniny 3, 4, 5, 6 a 7 mají vysokou inhibici černé barvy; sloučeniny 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19 a 20 mají zjevnou inhibiční aktivitu vůči tyrosinoxidáze. Výsledky položily základ pro další rozvoj a využití zdrojů buničiny Trichosanthes a také poskytly základ pro rozvoj přírodníchběleníkosmetika.

Cistanche herbajepřírodní bělící složka.

1. Úvod

Trichosanthes kirilowii Maxim. je vytrvalá popínavá bylina z čeledi tykvovitých. Plody, semena, kůra a kořeny se běžně používají jako tradiční čínská medicína. Po dlouhou dobu se dužina Trichosanthes často vyhazuje při výrobě a zpracování Semen Trichosanthis a Pericarpium Trichosanthis, což vede ke značnému odpadu. V současnosti se zprávy o dužině Trichosanthes zaměřují především na srovnání obsahu cukru, aminokyselin, vitamínů a dalších živin [1–4]. Neexistuje žádná zpráva o chemickém složení buničiny Trichosanthes. Proto je nutné systematicky studovat chemické složky buničiny.

S rychlým rozvojem ekonomiky je přitom kosmetika nejen životním stylem s vysokou spotřebou, ale stává se také nejoblíbenější „nezbytností“ pro ženy. Mnoho knih klasické čínské medicíny nebo materiamedica zaznamenalo, že dužina Trichosanthes má funkcibělenía účinky na odstranění vrásek [5–7]. Předchozí výsledky naší výzkumné skupiny ukazují, že vodní extrakt dužiny Trichosanthes měl vyššítyrosinázainhibiční aktivita a míra inhibice tyrosinázy byla asi 70 procent. 1společnýběleníjako kontrolní látky byly použity vitamin C (VC) a arbutin [8]. Předběžně bylo prokázáno, že extrakt z dužiny Trichosanthes má určitý bělící účinek inhibicí aktivity tyrosinázy. Proto je velmi důležité studovat chemické složky a mechanismus bělení buničiny Trichosanthes.

Thebělenímechanismus lze shrnout jako inhibici syntézy melaninu a urychlení přenosu melaninu. Proces tvorby melaninu v melanocytech je následující:tyrosinázaoxiduje tyrosin na polymorf BA (DOPA); poté se oxiduje na dopachinon. Po sérii metabolických reakcí vzniká melanin. Tyrosináza je jediným enzymem omezujícím rychlost v reakčním procesu a její aktivita určuje množství syntetizovaného melaninu. Když je aktivita tyrosinázy zesílena, zvyšuje se melaninsyntéza; když je aktivita tyrosinázy inhibována, syntéza melaninu je snížena [9]. 1e aktivní centrum tyrosinázy má dvojité aktivní místo mědi a každý ion mědi se kombinuje se 3 histidinovými zbytky s 1 nebo 2 valencemi. Redukce s antioxidačními účinky tedy může interagovat s atomem mědi na aktivním místě tyrosinázy nebo redukovat meziprodukt v procesu syntézy melaninu za účelem inhibice tvorby melaninu[10, 11]. Kromě toho může inhibice přenosu zralých melanocytů na keratinocyty také hrát roli při bělení.

K určení účinku se používá technologie buněčné kulturyběleníaktivní složky natyrosinázaaktivita a produkce melaninu v melanocytech in vitro. Buněčná linie myšího melanomu (buňky B16) pochází z buněk myšího kožního melanomu a její základní struktura, zejména pokud jde o syntézu melaninu, je v zásadě stejná jako u buněk normálního lidského melanomu. Protože je velmi obtížné kultivovat buňky primárního kožního melanomu u člověka, lze myší model použít jako testovací buňku pro stanoveníběleníúčinné látky. Proto byly buňky B16 použity k měření antioxidační aktivity, aktivity tyrosinázy a aktivity odstraňování melaninu a byly předběžně stanoveny bělící aktivní složky a související mechanismus. Výsledky položily základ pro další rozvoj a využití zdrojů dužiny Trichosanthes a také poskytly základnu pro vývoj přírodní bělící kosmetiky.

2. Experimenty

2.1. Materiály.

Trichosanthes trichosanthis byl sbírán z pěstební základny bylinné medicíny Hebao v Pinyin, Jinan. 1e vzorky byly identifikovány profesorem QingmeiGuo z Shandongské univerzity tradiční čínské medicíny. Po odstranění slupky a semen byla získána dužnina z ovoce. Po lyofilizaci byla buničina rozdrcena, promíchána a nakonec umístěna do exsikátoru pro další použití.

čerstvé cistanchesechinakosidefekty

2.2. Životaschopnost buněk.

B-16 buňky (buňky myšího melanomu) byly zakoupeny od KeyGEN a udržovány v médiu DMEM doplněném 10 procenty fetálního bovinního séra (FBS), při 37 stupních ve zvlhčené atmosféře s 5 procenty CO2. 1en, B-16buňky byly nasazeny do 96-jamkových destiček (10 x 104 buněk/jamka) po dobu 24 hodin inkubace.

2.3. Příprava různých extraktů.

Surovina dužiny Trichosanthes kirilowii byla 4,5 kg. 1e buničina byla třikrát namočená v 10násobku množství 95% etanolu. Extrakty byly spojeny a zahuštěny na přibližně 3,0 1. Ethylacetátový extrakt byl získán dispergováním ethanolového extraktu v 15 1 vody, extrahováním ethylacetátem, dokud nebyl extrakt bezbarvý. le extrakty byly spojeny a zahuštěny za sníženého tlaku.

Ethylacetátový extrakt byl smíchán se silikagelem (100–200 mesh) v poměru 1:2 (extrakt: silikagel, v/ proti). 1 rozpouštědlo bylo odpařeno a gel byl uchován. 1e skleněná chromatografická kolona (8{{30}} mm × 1200 mm) byla naplněna 200–300 mesh silikagelem a D101 makroporézní pryskyřice a poté byla kolona eluována ethylacetátem, petroletherem (10 procent, 25 procent, 50 procent, 75 procent a 100 procent) a methanolem, ethylacetátem (5 procent, 10 procent, 25 procent, 50 procent , 75 procent a 100 procent ), pro sběr každého toku. Nakonec byla každá frakce shromážděna a upravena na následující koncentrace: 0,003125 mg/ml, 0,00625 mg/ml, 0,0125 mg/ml, 0,025 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,5 mg/ml ml, 1,0 mg/ml a 2,0 mg/ml a poté se použily ke zpracování kultivovaných buněk. Na konci léčby bylo do každé jamky přidáno 20 ul roztoku MTT (5 mg/ml). 1e buňky byly inkubovány po dobu 20 minut při 37 stupních. 1 esupernatant byl odstraněn a do každé jamky bylo přidáno 100 ul DMSO. Absorbance le byla měřena při 490 nm. 1eexperiment se opakoval 3x. Míra přežití 1e byla vypočtena následovně:

procento míry přežití=(experimentální skupina, prázdná skupina)/(kontrolní skupina - prázdná skupina) × 100 procent .

Optimální koncentrace (Cl) každé frakce byla vypočtena podle funkčního vztahu mezi mírou přežití a koncentrací každé frakce. C1 byl zředěn 2, 4, 6 a 8 krát, aby se získaly koncentrace C2, C3, C4 a C5, v tomto pořadí. 1e různé extrakty z dužiny jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1: Polární extrakty z dužiny Trichosanthes a optimální koncentrace.

2.4. Bělící experiment

2.4.1. Antioxidační test.

Ke stanovení životaschopnosti buněk byl použit MTT test (MTT Kit, Kaiji Biology). 1en, B-16 buňky byly nasazeny do 96-jamkových destiček (10 × 104 buněk/jamka) po dobu 24 hodin a ošetřeny různými extrakty nebo sloučeninami po dobu 24 hodin. Po ošetření bylo kultivační médium odstraněno a promyto dvakrát PBS. 1en, bylo přidáno 0,05 procenta H202 a buňky byly kultivovány po dobu 4 hodin. Poté byly B-16 buňky inkubovány ve 20 ul roztoku MTT (5 mg/ml) při 37 stupních po dobu 4 hodin. 1en, supernatant kultury byl odstraněn a zbytek byl rozpuštěn ve 100 ul DMSO. Absorbance le byla detekována při 490 nm pomocí čtečky mikrodestiček (Tecan Trading AG). 1eexperimenty byly provedeny paralelně 3x.

2.4.2. Inhibice produkce melaninu.

Produkce melaninu byla stanovena detekcí obsahu melaninu v buňkách pyrolýzou NaOH [12]. Buňky byly nasazeny na 96-jamkové kultivační destičky po dobu 24 hodin při buněčné hustotě 10 x 104 buněk/jamka.1en, buňky byly ošetřeny různými extrakty nebo sloučeninou po dobu 24 hodin. Poté byl supernatant buněčné kultury (300 ul) odstraněn a zbytek byl rozpuštěn v NaOH (1 ml, 1,0 mol/l) po dobu 24 hodin při teplotě místnosti. Absorbance le byla měřena při 475 nm za použití čtečky mikrodestiček (Tecan Trading AG). 1e experimenty byly provedeny paralelně se 3 replikáty. 1e IC50 byla stanovena softwarem GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., San Diego, Kalifornie) a jako pozitivní kontrola byl použit arbutin (IC50 =15,6 ul).

2.4.3. Stanovení aktivity tyrosinázy.

Supernatant buněčné kultury byl odstraněn a zbytek byl rozpuštěn v Tritonx{0}} (90 ul) atyrosináza(10 µL, 1,0 mg/ml, Sigma, T3824 25ku). Po smíchání byla směs inkubována při 37 stupních po dobu 30 minut. Absorbance le byla měřena při 475 nm pomocí čtečky mikrodestiček (Tecan Trading AG). 1eexperimenty byly provedeny paralelně 3x. 1e IC50 byla stanovena softwarem GraphPad Prism 5 (GraphPadSoftware, Inc., San Diego, Kalifornie) a jako pozitivní kontrola byl použit arbutin (IC50 =15,6 ul).

2.5. Extrakce a izolace. Ethylacetátový extrakt byl rozpuštěn v methanolu a kolona byla naplněna silikagelem 200–300 mesh, který byl ekvilibrován petroletherem. 1en, gradientová eluce sestávající z petroletheru a ethylacetátu v poměrech 2:1, 1:1 a 1:2; ethylacetát; ethylacetát a methanol v poměrech 2:1, 1:1 a 1:2; a methanol byl použit ve spojení s TLC k získání sloučenin A (11,5 g), B (10,4 g), C (12,1 g), D (5,2 g) a E (6,1 g).

A byla separována polyamidovou sloupcovou chromatografií za použití dichlormethanu a methanolu v poměrech 2:1, 1:1 a 1:2 jako elučního rozpouštědla. Eluát byl monitorován pomocí TLC. Skvrny se stejným retenčním faktorem (rf) byly zkombinovány a byly získány A1 a A2. 1en, A1 byl připraven TLC za použití dichlormethanu a methanolu v poměru 1:1 jako vyvíjecího činidla a několikrát přečištěn na gelové koloně. Nakonec byla získána sloučenina 1 (17 mg) a sloučenina 2 (27 mg). A2 se přečistí sloupcovou chromatografií na silikagelu za použití dichlormethanu a methanolu jako eluentu v poměrech 1:1 a 1:2. Získá se sloučenina 3 (11 mg), sloučenina 4 (12 mg) a sloučenina 5 (23 mg). B byl separován pomocí středotlaké chromatografie C18 s reverzní fází (RP-C18) za použití methanolu, vody v gradientové eluci následovně: 0 procent, 10 procent, 15 procent, 20 procent, 25 procent, 30 procent, 35 procent , 40 procent , 50 procent , 75 procent , 90 procent a 100 procent . Průtok le byl 10 ml.min-1. Byly spojeny le průtokové frakce se stejnou rf a byly získány B1 a B2. Bl byl opakovaně purifikován na gelové koloně s methanolem jako elučním rozpouštědlem. Sloučenina (24 mg), 7 (21 mg) a 8 (18 mg) byly získány po opakované eluci. B2 byla purifikována na gelové koloně a methanolem a byla získána sloučenina 9 (11 mg). C byl separován pomocí RP-C18 a eluován methanolem a vodou s průtokem 10 ml.min-1. Frakce le průtoku se stejnou hodnotou rf byly spojeny a byly získány C1, C2 a C3. C1 byl připraven na gelové koloně a eluován methanolem a byla získána sloučenina 10 (13 mg). C2 byl separován na silikagelové koloně a eluován ethylacetátem a methanolem s gradientovou elucí v poměrech 2 : 1, 1 : 1 a 1 : 2. C2 byl čištěn preparativní extrakcí v kapalné fázi a sloučeniny 11 (15 mg) a 12 (14 mg). C3 se oddělil na polyamidové koloně, eluoval se methanolem a vodou a čistil se pomocí HPLC. Byly získány sloučeniny 13 (34 mg), 14 (42 mg) a 15 (38 mg). D byl separován pomocí RP-C18 a eluován methanolem a vodou. Průtok 1e byl 10 ml.min-1. Sloučeniny 16 (36 mg), 17 (19 mg) a 18 (37 mg) byly získány pomocí HPLC. Sloučeniny 19 (29 mg) a 20 (34 mg) byly získány gradientovou elucí za použití ethylacetátu a methanolu v poměrech 1 : 1 a 1 : 2, poté 100% methanolem na silikagelové koloně.

herba epimedium sagittatum na kůži

3. Výsledky a diskuse

3.1. Stanovení aktivních extraktů (E1–E11).

Byla vypočtena optimální koncentrace (jmenovitě C1) každého extraktu a je uvedena v tabulce 1. Experiment s antioxidanty ukazuje, že všechny extrakty mají antioxidační opravný účinek, ale ve srovnání s VC je antioxidační účinek každé skupiny slabý. Antioxidační aktivita E1, E3, E4, E7 a E11 se snižovala se zvyšující se koncentrací, jak je znázorněno na obrázku 1. Test inhibice melaninu ukázal, že všechny polární složky v pulpof Trichosanthes kirilowii inhibovaly syntézu melaninu. Zejména míra inhibice melaninu byla významně vyšší pro E2, E3 a E4 než u pozitivní kontroly arbutin, jak ukazuje obrázek 2. 1e výsledkytyrosinázaaktivity ukazují, že všechny polární složky v dužině Trichosanthes kirilowii inhibovaly aktivitu tyrosinázy a trend inhibice byl podobný jako u inhibice melaninu. le inhibice tyrosinázové aktivity byla významně vyšší pro E2, E3, E4 a E8 než u pozitivní kontroly. Obecně platí, že extrakty z petroletheru mají nízký inhibiční účinek na tyrosinázu. Extrakty z ethylacetátu mají vysoký inhibiční účinek na tyrosinázu, zejména polární složky z ethylacetátu. Extrakty z n-butanolu mají také vysoký inhibiční účinek na tyrosinázu, jak je znázorněno na obrázku 3.

3.2. Izolace a identifikace komponent monomeru.

20 sloučenin bylo separováno na silikagelu a na ODS chromatogramových kolonách, stejně jako preparativní HPLC. Na základě analýzy dat NMR a MS byly objasněny jejich struktury. 20 sloučenin je uvedeno v tabulce 2 a specifická analytická data monomerů jsou uvedena v příloze 1.

3.3. Validační analýza účinných sloučenin

3.3.1. Validační analýza antioxidačních sloučenin.

E1, E2, E3, E4 a E5 mají antioxidační účinky. 1e hlavními sloučeninami izolovanými z výše uvedených složek bylydrechslerol-B (sloučenina 9), cyklohexanol 3-palmitát (sloučenina 10), 5-acetoxymethyl-2-furaldehyd (sloučenina 11), 5-hydroxymethylfurfural ( sloučenina 12), diosmetin (sloučenina 13), apigenin (sloučenina 14), chrysoberyl (sloučenina 15), luteolin (sloučenina 16), 4′-hydroxy-scutellarin (sloučenina 17), kvercetin (sloučenina 18), 3′, {{ Hlavními sloučeninami byly glykosidy, což ukazuje, že glykosidy mají dobré antioxidační aktivity. Fenolové kyseliny, jako je 5-acetoxymethyl-2-furaldehyd (sloučenina 11), 5-hydroxymethylfurfural (sloučenina 12), diosmetin (sloučenina 13), apigenin (sloučenina 14), chrysoberyl (sloučenina 15) ,luteolin (sloučenina 16), 4′-hydroxyscutellarin (sloučenina 17), kvercetin (sloučenina 18) a 3′,5-dihydroxy-7-(-Dglukopyranosyloxy)-4′-methoxyflavon, mají také dobré antioxidační aktivity díky fenolické hydroxylové skupině a nenasyceným dvojným vazbám [26, 27]. 1e výsledky jsou uvedeny na obrázku 4.

Obrázek 4: Míra přežití buněk (v procentech) antioxidačního experimentu různých sloučenin z extraktů Trichosanthes

3.3.2. Validační analýza sloučenin inhibujících melanin.

E11, E12, E13, E16, E17 a E18 mají dobré inhibiční účinky na syntézu melaninu. Hlavní sloučeniny izolované z výše uvedených složek jsou uvedeny v tabulce 2. Podle metody v části 2.4.2 byl stanoven účinek každé sloučeniny na syntézu melaninu. Každá sloučenina byla hodnocena v následujících koncentracích: 1000 ug/ml, 800 ug/ml, 400 ug/ml, 200 ug/ml a 100 ug/ml. Každé měření bylo provedeno trojmo a byla vypočtena rychlost inhibice syntézy melaninu.

Protokatechuát (sloučenina 5), ​​5-acetoxymethyl-2-furaldehyd (sloučenina 11), 5-hydroxymethylfurfural (sloučenina 12), diosmetin (sloučenina 13), p-hydroxybenzaldehyd (sloučenina 1), kyselina salicylová (sloučenina 2), kyselina vanilová (sloučenina 3), kyselina isovanilová (sloučenina 4), kyselina trans-skořicová (sloučenina 6), 4-kyselina kumarová (sloučenina 7), apigenin (sloučenina 14), chrysoberyl (sloučenina 15 ), luteolin (sloučenina 16), 4′-hydroxyscutellarin (sloučenina 17), kvercetin (sloučenina 18), 3′,5-dihydroxy-7-(-D-glukopyranosyloxy)-4′ -methoxyflavon (sloučenina 19), ofloxacin-7-O- -D-glukosid (sloučenina 20) může inhibovat produkci melaninu [28]. Zejména kyselina vanilová (sloučenina 3), kyselina isovanilová (sloučenina 4), protokatechuát (sloučenina 5), ​​kyselina trans-skořicová (sloučenina 6) a kyselina 4-kumarová (sloučenina 7) mají vysokou inhibici melaninu. 1e výsledky jsou uvedeny na obrázku 5.

3.3.3. Ověření a analýza sloučenin inhibujících aktivitu tyrosinázy.

E2, E3, E4, E7, E8 a E9 mají dobré inhibiční účinky natyrosinázaaktivita. 1e hlavní sloučeniny izolované z výše uvedených složek jsou uvedeny v tabulce 2. Podle metody uvedené v části 2.4.3 byl jako kontrola použit arbutin a koncentrace sloučeniny byla 1000 ug/ml, 800 ug/ml, 400 ug/ml 200 ug/ml a 100 ug/ml. Každé měření bylo provedeno 5krát a byla vypočtena míra inhibice tyrosinázy. 1e výsledky jsou ukázány na obrázku 6.

Výsledky 1e ukazují, že diosmetin (sloučenina 13), apigenin (sloučenina 14), chrysoberyl (sloučenina 15), luteolin (sloučenina 16), 4'-hydroxyscutellarin (sloučenina 17), kvercetin (sloučenina 18), 3′, {{10} }dihydroxy-7-(-D-glukopyranosyloxy)-4′-methoxyflavon (sloučenina 19), ciprofloxacin-7-O- -D-glukosid (sloučenina 20), p-hydroxybenzaldehyd (sloučenina 1), kyselina salicylová (sloučenina 2), kyselina vanilová (sloučenina 3), kyselina isovanilová (sloučenina 4), protokatechuát (sloučenina 5), ​​kyselina trans-skořicová (sloučenina 6), kyselina 4-kumarová (sloučenina 7 ) a kyselina trans-ferulová (sloučenina 8) mají všechny zřejmétyrosinázainhibiční aktivity.

Rostlina Cistanche inhibuje aktivitu tyrosinázy.

Klikněte na obrázek a získejte další podrobnosti.

Hydroxylem substituované sloučeniny na benzenovém kruhu, jako je p-hydroxybenzaldehyd (sloučenina 1), kyselina salicylová (sloučenina 2), kyselina vanilová (sloučenina 3), kyselina isovanilová (sloučenina 4), protokatechuát (sloučenina 5), ​​kyselina trans-skořicová ( sloučenina 6), 4-kyselina kumarová (sloučenina 7), kyselina trans-ferulová (sloučenina 8) a flavonoidy vykazovaly vysokou inhibici tyrosinázy a míra inhibice para-substituovaných sloučenin byla významně vyšší než u ortho-substituovaných sloučenin . Například inhibiční aktivita p-hydroxybenzaldehydu byla významně vyšší než inhibiční aktivita kyseliny salicylové a inhibiční aktivita kyseliny vanilové byla významně vyšší než inhibiční aktivita kyseliny isovanilové. Navíc inhibiční aktivita p-hydroxybenzaldehydu byla významně vyšší než u kyseliny salicylové, kyseliny vanilové, kyseliny isovanilové a protokatechuátu. Důvodem může být to, že nukleofilní skupiny kolem aktivního centratyrosináza, jako jsou –SH, –NH2 a –OH, zabírají prostor kolem aktivního centra a brání tak tyrosinu v útoku na aktivní centrum. Nakonec byla inhibována syntéza melaninu [28]. Inhibiční aktivita sloučenin obsahujících o-dihydroxy byla silnější než u para hydroxysloučenin a inhibiční aktivita protokatechuátu byla významně vyšší než u kyseliny vanilinové. Výše uvedené jevy existují také u flavonoidů. Míra inhibice flavonoidů obsahujících 7 a 4′ hydroxylové skupiny byla významně vyšší, než kdyby byly nahrazeny 7 a 4′ hydroxylové skupiny. Například inhibiční aktivita chrysoberylu byla významně vyšší než u diosmetinu, zatímco inhibiční aktivita diosmetinu byla vyšší než u 3′,5-dihydroxy-7-(-D-glukopyranosyloxy)-4 ′- methoxyflavon a ciprofloxacin-7-O- -D-glukosid. Míra inhibice flavonoidů obsahujících 3-hydroxyskupinu byla výrazně vyšší než u sloučenin bez 3-hydroxyskupiny nebo pokud byla 3-hydroxyskupina nahrazena. Například inhibiční aktivita kvercetinu byla významně vyšší než u 4′-hydroxyscutellarinu, ale inhibiční aktivita 4′-hydroxyscutellarinu byla vyšší než u kvercetinu-3-glukosidu. Navíc inhibiční aktivita koellinu je vyšší než u apigeninu, ale nižší než u luteolinu. Navrhuje se, že substituenty B-kruhu, zejména hydroxylová skupina, mohou zvýšittyrosinázainhibiční aktivitu a ortodihydroxyskupina B-kruhu měla vyšší inhibiční aktivitu [29].