Cistanche k léčbě zánětu a onemocnění ledvin: Jaká je příčina patogenní role zánětu při zapojení ledvin do cystinopatie?
Mar 13, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com
Interakce mezi galektinem-3 a cystinosinem odhaluje patogenní roli zánětu při postižení ledvin cystinózou
Taťána Lobryová1,2 a kol
Zánětse podílí na patogenezi mnoha poruch. Základní mechanismy jsou však často neznámé. Zde testujeme, zdacystinóza, bílkoviny, která je součástícystinóza, je kritickým regulátorem galektinu-3, člen rodiny b-galaktosidázových vazebných proteinů, běhemzánět. Cystinózaje porucha lysozomálního střádání a navzdory všudypřítomnému projevu cystinózyledvinaje primární orgán postižený onemocněním.Cystinózabylo zjištěno, že zlepšuje lysozomální lokalizaci a degradaci galektinu-3. V Ctns–/–myši, model myšicystinóza, galektin-3 je nadměrně exprimován vledvina. Absence galektinu-3 u cystinotických myší zlepšuje patologickou renální funkci a strukturu a snižuje infiltraci makrofágů/monocytů v ledvinách Ctns–/–Gal3–/–myši ve srovnání s Ctns–/– myši. Tyto údaje silně naznačují, že galektin-3 zprostředkovávázánětzahrnutý do něčeho, zůčastnit se čeholedvinaprogrese onemocnění při cystinóze. Dále bylo zjištěno, že galektin-3 interaguje s prozánětlivým cytokinem MonocyteChemoattractant Protein-1, který stimuluje nábor monocytů/makrofágů, a bylo prokázáno, že je významně zvýšen v séru Ctns–/– myší a také pacienti scystinóza. Naše zjištění tedy zdůrazňují novou roli cystinózy a interakce galektinu-3 při zánětu a poskytují další mechanické vysvětlení proledvinaonemocnění cystinózy. To může vést k identifikaci nových drogových cílů ke zpožděnícystinózapostup.
KLÍČOVÁ SLOVA:chronické onemocnění ledvin; cystinóza; galektin-3;zánět; monocytový chemoatraktant protein–1
cistanche může léčit chronické onemocnění ledvin a cystinózu
Základní příčinou zánětu je, že oxid dusnatý může vést k produkci zánětlivých buněk.Cistancheje cenná čínská bylinná medicína. Jeho aktivní složky mohou inhibovat sekreci oxidu dusnatého a hrají roli v prevenci a léčbě zánětů a onemocnění ledvin.
Překladové prohlášení
I přes léčbu pacienti stále progredují do konečného stadia selhání ledvin. V této studii jsme ukázali, že absencecystinózavede k narušení lysozomální degradace galektinu-3 (Gal{1}}), což vede kzáněta progresechronické onemocnění ledvinvcystinóza. Tato zjištění otevírají nové pohledy na potenciální terapeutické cíle, které by mohly omezit nebo oddálit degeneraci ledvin u pacientů scystinóza. Jako takové mohou protizánětlivé léky a inhibitory Gal-3, jako jsou nesteroidní protizánětlivé léky nebo indomethacin, zlepšit renální patogenezi u cystinózy.
Zánětje normální akutní reakce organismu na poranění nebo infekci,1ale chronickézánětje spojena s poškozením tkáně. V případě chronických onemocnění, jako je cukrovka, poškozené tkáně aktivují imunitní systém, což vede k trvalé zánětlivé reakci a nakonec k degeneraci tkáně.2 Cytokiny jsou klíčovými modulátoryzáněta jsou schopny aktivovat nebo vyřešitzánětprocesu.3 U pacientů schronické onemocnění ledvin(CKD), zvýšená plazmatická koncentrace cytokinů (interleukin [IL]-6 a tumor nekrotizující faktor-a) azánětmarkery (C-reaktivní protein, IL-6, hyaluronan a neopterin) jsou spojeny s progresí do konečného stádia renálního onemocnění.4 Pochopení specifických mediátorů, které spouštějí zánětlivé reakce, usnadňuje objevování vhodných cílů léků k prevenci degenerativního poškození .
Cystinózaje autozomálně recesivní metabolické onemocnění, které patří do rodiny lysozomálních střádavých poruch a je charakterizováno akumulací cystinu ve všech orgánech.5 Gen je defektnícystinóza, CTNS, kóduje lysozomální kotransportér cystin/proton, cystinózu.6,7 Ačkoli CTNS je všudypřítomný,ledvinaje prvním postiženým orgánem u osob scystinóza. Pacienti obvykle v prvním roce života trpí Fanconiho syndromem, který se vyznačuje závažnými poruchami tekutin a elektrolytů, špatným růstem a křivicí.8Následně se vyvine CKD, která progreduje do konečného stádia renálního onemocnění a vyžadujeledvinatransplantace. Hromadění cystinu ve všech tkáních nakonec vede k multiorgánové dysfunkci; pacienti pociťují fotofobii a slepotu, hypotyreózu, hypogonadismus, diabetes, myopatii a zhoršení centrálního nervového systému.9 Na pozadí C57BL/6 je model knockout myši (Ctns–/–) 10 replikuje ledvinový fenotyp cystinotických pacientů,11 stejně jako ukládání krystalů cystinu v rohovce12a dysfunkci štítné žlázy.13
V této studii odhalujeme novou roli procystinózavzánětprostřednictvím interakce s Gal-3. Gal-3 je členem rodiny proteinů vážících lektin a b-galaktosid 21 a podílí se na mnoha biologických funkcích, včetnězánět.22V kontextuledvinaonemocnění, bylo prokázáno, že inhibice Gal-3 snižuje expresi prozánětlivých markerů a renální fibrózu a zabraňuje poklesu rychlosti glomerulární filtrace v modelech hyperaldosteronismu, hypertenze nebo obezity.23–26Zde přinášíme důkazy, že vcystinóza, Nepřítomnostcystinózavede k nadměrné expresi Gal-3ledvinyzvyšující infiltraci makrofágy a progresi CKD. Kromě toho identifikujeme monocytový chemoatraktant protein–1 (MCP-1) jako potenciální mediátor, který odhaluje nové genové cíle pro lékovou terapii. VÝSLEDKY Gal-3 interaguje s cystinózou prostřednictvím své domény rozpoznávání sacharidů, aby identifikovala specifickou interakci partnery pomocí kvantitativní hmotnostní spektrometrie, Madin-Darby psíledvina(MDCK) buňky byly transdukovány lentivirovým konstruktem, aby stabilně exprimovaly fúzní protein cystinóza – zelený FL fluorescenční protein (GFP). Kromě 9 podjednotek Hþ adenosintrifosfatázy vakuolárního typu publikovaných dříve,19Gal-3 byl identifikován jako jeden z interagujících proteinůcystinóza(Obrázek 1a). Tato interakce byla dále potvrzena koimunoprecipitací následovanou Western blotováním (obrázek lb a c). Kromě toho jsme ukázali interakci mezi Gal-3 acystinózabyl zprostředkován Gal-3 sacharidovou rozpoznávací doménou (CRD) lokalizovanou v C-terminálním konci proteinu. Interakce byla inhibována thiodigalaktosidem, silným inhibitorem interakcí galektin-sacharid (obrázek 1d). Jako všechny galektiny má Gal-3 afinitu ke glykosylovaným proteinům,21 takže je pravděpodobné, že k interakci s Gal-3 dochází prostřednictvím cystinózy glykosylované skupiny umístěné v intralysozomálním N-terminálním konci proteinu.27
Cystinosin zvyšuje Gal-3 lysozomální lokalizaci a degradaci
Chcete-li ověřit potenciální lysozomální lokalizaci Gal-3 při interakci scystinóza, ukázali jsme, že Gal-3, stejně jako katepsin D (intralysozomální proteáza), byl chráněn před trávením proteinázou K, zatímco oba proteiny byly natráveny, když byly lysozomy permeabilizovány Tritonem X- 100 (obrázek 2a a doplňková Obrázek S1). Podobná data byla získána v lysozomech izolovaných z myších jater, což potvrdilo lysozomální lokalizaci Gal-3 in vivo (obrázek 2b a c). Kvůli absenci spolehlivé protilátky k detekcicystinózabylo provedeno imunobarvenícystinóza-GFP-exprimující MDCK buněčné linie s anti-Gal-3 protilátkou. Potvrdila přítomnost Gal-3 v lumen lysozomů, zatímco cystinóza-GFP a Lamp-2 (lyzozomální transmembránový protein) byly nalezeny pouze na membráně vezikul (obrázek 2d).
Prozkoumat, jestlicystinosinbyl zapojen do obchodování s Gal-3, analyzovali jsme dynamiku oboucystinózaa Gal-3–pozitivní vezikuly využívající dvoubarevnou fluorescenční mikroskopii s totální vnitřní reflexí živých buněk FL v myších embryonálních fibroblastech (MEF) z divokého typu (WT) a Ctns–/–myši exprimující CTNS-DsRed i Gal-3–GFP. Naše analýza to potvrdilacystinózaa Gal-3 procházejí skutečnou kolokalizací v Ctns–/– MEF, jak je potvrzeno podobnou časoprostorovou distribucí těchto molekul v zóně fluorescenční mikroskopie s úplným vnitřním odrazem FL (obrázek 2e). Data ve WT MEF byla podobná (data nejsou uvedena). Navíc, když byly analyzovány MEF transfekované pouze Gal- 3–GFP, Gal-3–GFP byl nalezen v cytoplazmě a nebyla pozorována žádná odlišná vezikulární struktura, na rozdíl od kotransfekce s CTNS-DsRed ( údaje nejsou uvedeny).
Tato data byla potvrzena v buňkách 293T, u kterých byl pozorován silný signál GFP v cytoplazmě v buňkách exprimujících pouze Gal-3–GFP, zatímco v buňkách exprimujících jak Gal-3–GFP, takcystinosin-DsRed, Gal-3-GFP byl lokalizován hlavně v lysozomech exprimujících cystinózu-DsRed (obrázek 3a). Navíc kvantifikace exprese Gal-3 proteinu v buňkách transfekovaných samotným Gal-3–GFP nebo Gal- 3–GFP a CTNS-DsRed a Gal-3–GFP a DsRed jako kontrola vykazovala významně méně proteinů Gal-3-GFP v buňkách kotransfekovaných s CTNS-DsRed ve srovnání s buňkami transfekovanými samotným Gal-3-GFP nebo kotransfekovanými s DsRed (obrázek 3b). Celkově tomu tyto výsledky naznačujícystinosinzlepšuje lysozomální lokalizaci a degradaci Gal-3. Bylo prokázáno, že cystinosin je zapojen do CMA.28 Protein tepelného šoku 70 kDa (Hsc70) se účastní CMA tím, že napomáhá rozbalování a translokaci substrátových proteinů přes membránu do lysozomálního lumenu způsobem závislým na LAMP2A.29,30 Protože Gal{ {8}} bylo navrženo jako degradované pomocí CMA,31 jsme zkoumali lokalizaci Gal{10}} vzhledem k Hsc70 v cystinotických MEF. Analýza konfokální mikroskopií potvrdila kolokalizaci Gal-3–GFP na Hsc70- pozitivních strukturách ve WT (data nejsou uvedena) i Ctns–/–buňky (obrázek 3c), což podporuje kotransportaci Gal-3 s Hsc70 a naznačuje, že lysozomální internalizace, ale nikoli rozpoznání Gal-3 chaperonem je vadnécystinóza.
Gal-3 se podílí na zánětu ledvin v Ctns–/–myši
Studovat roli Gal-3 vcystinózain vivo jsme vytvořili myší model s dvojitým knockoutem, který je v obou případech deficitnícystinosina Gal-3 (Ctns–/–Holka-3–/–myši). WT, Ctns–/–a Gal-3–/–myši byly použity jako kontrolní subjekty. V C57BL/6 Ctns–/–u myší se renální anomálie objevují kolem 10. měsíce věku.11 Studie byly proto provedeny v 8. až 9. měsíci, kdyledvinaanomálie začínají být detekovány a ve 12 až 15 měsících, kdy anomálie ledvin progredují. Protože bylo zjištěno, že obsah cystinu je odlišný u mužských a ženských Ctns–/– ledvinybyly analyzovány samostatně. Pokud se obsah cystinu zvyšuje s věkem u obou genotypů, nebyl pozorován žádný významný rozdíl v ledvinách samců a samic mezi Ctns–/– Gal-3–/– myší a Ctns–/– myši ve věku 8 až 9 měsíců a 12 až 15 měsíců (obrázek 4a).
Renální funkce byla hodnocena v séru a moči a nebyl pozorován žádný významný rozdíl mezi WT a Ctns–/–myši ve věku 8 až 9 měsíců (data nejsou uvedena), ale ve věku 12 až 15 měsíců, Ctns–/–myši vykazovaly významně vyšší hladiny sérového kreatininu a močoviny ve srovnání s WT myšmi. Zajímavé je, že Ctns–/–Holka-3–/–myši vykazovaly zlepšenou funkci ledvin ve srovnání s Ctns–/–myši ve věku 12 až 15 měsíců, s nižším sérovým kreatininem (P < 0.05) a močovinou (P < 0,05; tabulka 1).
Histologické studie 8- až 9-měsíční myši a 12- až 15-měsíční myšiledvinařezy odhalily přítomnost závažných anomálií v Ctns–/– ledvinyvčetně tubulární atrofie, zatažených glomerulů a mononukleárních infiltrátů. Slepá analýza řezů ledvin pohybovala rozsahem poškození kortikální kůry od 1 (zachovaná struktura tkáně) do 6. Průměrné skóre pro Ctns–/–myši byly 2.64 - 0,36 ve věku 9 měsíců (n ¼ 7) a 4,12 0,37 ve věku 12 až 15 měsíců (n ¼ 16). V ledvinách Ctns–/–Holka-3–/–myší ve stejném věku byly tyto anomálie podstatně méně rozsáhlé: 1.{1}.11 ve věku 9 měsíců (n ¼ 21; P < 0.05,="" mann-whitney="" t-="" test)="" a="" 3.{10}}.22="" ve="" věku="" 12="" až="" 15="" měsíců="" (n="" ¼="" 33;="" p="">< 0,05,="" mann-whitney="" t-test)="" (obrázek="" 4b="" a="" doplňkový="" obrázek="" s2).="" kromě="" toho="" bylo="" každé="" tkáni="" přiřazeno="" procento="" tubulární="" atrofie="" a="" průměr="" pro="">–/–myši a Ctns–/–Holka-3–/–myši byly 66 procent a 42 procent, v daném pořadí, ve 12 až 15 měsících (P ¼ 0,01). Dále markantní rozdíl mezi Ctns–/–a Ctns–/– Holka-3–/– ledvinasekce byla přítomnost několika mononukleárních infiltrátů v Ctns–/–Holka-3–/–sekce, zatímco těžké infiltráty byly trvale pozorovány v Ctns–/– ledvina(Obrázek 4b).
Charakterizovali jsme mononukleární infiltráty pozorované histologickým vyšetřením u 8- až 9-měsíců starých Ctns–/– ledvinyjako makrofágy/monocyty společným imunobarvením s CD68 a CD45 a s CD68 a hlavní histokompatibilitou třídy II (doplňkový obrázek S3), ale ne s CD68 a CD163, což naznačuje, že tyto makrofágy mají prozánětlivý profil podobný M1-.32 ,33 Kvantifikace CD68- pozitivních buněk odhalila významně méně makrofágů/monocytů ve WT, Gal-3–/–a Ctns–/–Holka-3–/– ledvinyve srovnání s Ctns–/– ledviny(obrázek 4c), potvrzující histologická data (obrázek 4b).
Celkově tato zjištění naznačují, že Gal-3 se podílí na získávání makrofágů/monocytů v cystinotickémledvinya že jeho nepřítomnost zlepšuje onemocnění ledvin inCtns–/–myši. Proto to naznačujezánětje odpovědný, alespoň částečně, za zhoršení ledvin v Ctns–/– myši.
Ledviny s nedostatkem Ctns vykazují nadměrnou expresi Gal-3
Pomocí analýzy Western blot jsme zjistili, že exprese Gal-3 byla významně zvýšena vledvinyz 12-měsíců Ctns–/–myši ve srovnání s myšmi WT (obrázek 5a a b). Chcete-li zjistit, zda je tato zvýšená exprese Gal-3 specifická pro Ctns–/– ledvinyjsme kvantifikovali expresi Gal-3 na úrovni transkriptu a proteinu vledvinyod myší s CKD vyvolaným standardní mezisoučtovou 2-krokovou nefrektomií a od zvířat, která podstoupila falešnou operaci. WT a Ctns–/–myši byly použity jako kontrolní subjekty. Transkripty Gal{0}} byly významně zvýšeny u Ctns–/– a falešných ledvin, ale vysoce zvýšené u CKDledvinyve srovnání s WT myšmi (obrázek 5c). Naproti tomu na úrovni proteinu byl Gal-3 detekován pouze v Ctns–/–ledviny, což silně naznačuje, že pouze Ctns–/–ledviny nebyly schopny degradovat Gal-3 protein (obrázek 5d). Imunofluorescenční barvení Gal-3 u myšíledvinav 8 až 9 měsících také prokázala nadměrnou expresi Gal-3 v Ctns–/– ledvinyve srovnání s WTledviny(Obrázek 5e). Kromě toho byl Gal-3 exprimován CD68þ makrofágy a také renálními buňkami v Ctns–/– ledvinyv 8 až 9 měsících (doplňkový obrázek S4). Celkově jsou tato data v souladu se sníženou degradací Gal-3 v nepřítomnosticystinózajak bylo prokázáno in vitro (obrázek 3a a b), což vede k akumulaci Gal-3 proteinu v Ctns–/– ledviny.
Absence cystinosinu vede ke zvýšení sérové MCP-1 prostřednictvím zvýšené regulace Gal-3
Gal-3 regulujezánětprostřednictvím různých mechanismů.34 K získání dalších poznatků o mechanismu vcystinózajsme zkoumali expresi různých prozánětlivých nebo protizánětlivých cytokinů v séru 12- až 15-měsíců starých WT, Ctns–/–, dívka-3–/–a Ctns–/–Holka- 3–/–myši. Šest hladin cytokinů bylo měřeno pomocí myšího cytometric bead array, MCP{0}}, interferonu-g, tumor nekrotizujícího faktoru a IL-10, IL-6 a IL-12p70. Pouze exprese MCP-1 byla významně zvýšena v séru myší Ctns–/– ve srovnání s myšími WT a Gal-3–/– a také s Ctns–/–Holka-3–/–myši, jejichž sérové hladiny MCP{0}} byly srovnatelné s WT myšmi (obrázek 6a). MCP-1 je produkován různými typy buněk, přičemž hlavním zdrojem MCP-1 jsou makrofágy a monocyty35 a působí jako chemoatraktant pro monocyty a makrofágy regulující jejich migraci a infiltraci. Naproti tomu ve stejném věku bylo zjištěno, že exprese Gal-3 je podobná v séru myší Ctns–/– (44,33 9,81 ng/ml; n ¼ 5) a myší WT (40).{12} },41 ng/ml; n=7).
Vztah mezi Gal-3 a MCP-1 byl dále zkoumán koimunoprecipitací pomocí Gal-3–GFP a MCP-1–DsRed– nebo Gal-3– GFP a CTNS-DsRed– (jako pozitivní kontrola) exprimující 293T buňky. Byla pozorována interakce mezi Gal-3 a MCP-1 (obrázek 6b), což naznačuje přímou indukci MCP-1 Gal-3. Inkubace s N-acetyl-D-laktosaminem (LacNAc), inhibitorem Gal-3 CRD, ukázala, že na rozdíl odcystinosininterakce, CRD není zapojen do interakce mezi Gal-3 a MCP-1 (obrázek 6c).
Abychom vyhodnotili, zda je toto zjištění relevantní u lidí, měřili jsme hladiny Gal-3 a MCP-1 u pacientů scystinózakteří nepodstupovali imunosupresivní léčbu nebo neužívali protizánětlivé léky. Přestože bylo zjištěno, že hladina Gal-3 je mírně zvýšená v séru pacientů s cystinózou ve srovnání se zdravými dárci, rozdíl nebyl významný (obrázek 6e), což potvrzuje naše výsledky získané v Ctns–/–myši. Pouze 2 pacienti měli vysokou hladinu Gal-3 (25,34 a 39,54 ng/ml); byly považovány za odlehlé hodnoty, a proto nebyly zahrnuty do obrázku 6e. Naproti tomu při použití enzymatického imunosorbentního testu namířeného proti lidskému MCP-1 (obrázek 6d) bylo zjištěno, že hladiny MCP{10}} v séru jsou významně zvýšené u pacientů scystinóza(252.1 - 18,4 pg/ml; n ¼ 19; věkové rozmezí 1–23 let) navzdory léčbě cysteaminem ve srovnání se zdravými kontrolními subjekty (166.9 -13,5 pg/ml; n ¼ 1 0; věkové rozmezí 8–63 let) (P < 0,001).="" u="" obou="" pacientů="" nebyla="" nalezena="" žádná="" korelace="" mezi="" věkem="" a="" hladinou="">cystinózaa zdravé dárce (data nejsou uvedena).
Cistanchemáprotizánětlivévlastnosti
DISKUSE
Nehledě na to, že cystin se u pacientů postižených hromadí ve všech tkáníchcystinózaledviny jsou orgány, které jsou vůči poškození nejzranitelnější. Domníváme se tedy, že akumulace cystinu není odpovědná pouze za degeneraci ledvin. Zde popisujeme novou roli procystinosinv regulacizánětpodílí se na progresi chronického onemocnění ledvin vcystinóza. Tato studie může vysvětlit, proč se pacienti vyvinou do konečného stadia renálního selhání navzdory léčbě cysteaminem.
Studie molekulárních partnerů cystinózy odhalila přímou interakci s Gal-3, kterou lze inhibovat inhibitory Gal-3 CRD. Nedávné studie ukázaly, že Gal-3 by mohl interagovat s glykany umístěnými v lysozomálním lumen po poškození lysozomů, jako je nahromadění krystalů.36 V naší studii byla interakce mezi Gal-3 acystinosinbyl studován na zdravých buňkách exprimujícíchcystinosina tudíž neakumulovat cysteinové nebo cystinové krystaly. Nadměrná exprese Gal-3 i cystinosinu ve zdravých buňkách navíc modifikovala subcelulární lokalizaci Gal-3, která byla poté lokalizována do lysozomů, ve srovnání s nadměrnou expresí pouze Gal-3, která se nacházel v cytoplazmě. Tyto výsledky silně naznačují, že interakce mezi Gal-3 a cystinosinem probíhá nezávisle na poškození lysozomů a že cystinosin je aktivně zodpovědný za lokalizaci Gal-3 lysozomů. Dříve se ukázalo, že Gal-3 je degradován prostřednictvím lysozomálně závislé proteolýzy v nepřítomnosti Abl a Arg, 2 tyrosinkináz.31
Navíc jsme to ukázalicystinózaa Gal-3 se společně lokalizují v dynamických vezikulárních strukturách a jsou společně mobilizovány časoprostorovým způsobem.Cystinosindříve byl spojován s transportními mechanismy lysozomálního LAMP2A, jediného známého CMA receptoru, který je chybně lokalizován vcystinóza.28Dříve se ukázalo, že degradace Gal-3 je zprostředkovaná CMA.31Analýza konfokální mikroskopií potvrdila kolokalizaci Gal-3 na Hsc70-pozitivních strukturách v obou Ctns–/– a WT buňky, které podporují ko-transportaci Gal-3 s Hsc70 pro prezentaci v lysozomu a degradaci pomocí CMA, protože Hsc70 napomáhá translokaci substrátových proteinů přes membránu do lysozomálního lumenu.29,30Možná interpretace našich výsledků je takovácystinosinreguluje obchodování a dodávání Gal-3 do CMA-aktivních lysozomů za účelem degradace.
Tato nová cestacystinosin-dependentní Gal-3 lysozomální lokalizace a degradace je podporována in vivo, protože myši s deficitem Ctns vykazují nadměrnou expresi Gal-3 vledvina. Navíc, zatímco zvýšená Gal-3 mRNA byla omezena v Ctns–/–ledvin ve srovnání s jiným modelem CKD bylo velké množství proteinu Gal-3 detekováno pouze v Ctns–/– ledviny. Tyto údaje silně podporují závěr, žecystinosinse podílí na degradaci Gal-3 proteinu, který může řídit nadměrnou expresi Gal-3 mRNA ve stresových podmínkách, jako je CKD.
Gal-3 má několik biologických rolí, včetně rolí v akutní a chronické fázizánětpřitahováním monocytů a makrofágů.37,38V Ctns–/– u myší jsme pozorovali těžké mononukleární infiltráty hlavně vledvinajak bylo dříve popsáno,11,39které byly charakterizovány jako monocyty/makrofágy. Naproti tomu ledviny z dvojitého knockoutu Ctns–/–Holka-3–/–myši vykazovaly velmi málo monocytů/makrofágových infiltrátů, což silně naznačuje, že se Gal-3 podílí nazánětv ledvinách Ctns–/–myši. V kontextu opakovaného poškození tkáně může Gal-3 spustit přechod do chronickéhozáněta fibróza.34V souladu s těmito zjištěními naše data ukazují zapojení Gal-3 do progrese CKD vcystinóza. Opravdu, dvojitý knockout Ctns–/– Holka-3–/–myši se projevovaly lépeledvinafunkce a struktura ve srovnání s Ctns–/–myši. Podobně myši s deficitem Gal-3 vykazují méně renální fibrózy vledvinave srovnání s WT myšmi po jednostranné ureterické obstrukci,40 a Gal-3 knockout myši vystavené ischemicko-reperfuznímu poškození měly lepší funkci ledvin ve srovnání s WT myšmi vystavenými ischemicko-reperfuznímu poškození.41
Přestože byla nalezena korelace mezi hladinami Gal-3 v plazmě a rozvojem CKD,42 nebyl pozorován žádný rozdíl v expresi Gal-3 v séru myší a lidí postiženýchcystinózaa zdravé kontrolní subjekty. Měřením různých hladin cytokinů v séru jsme zjistili významný nárůst MCP-1 v Ctns–/–myši, zatímco Ctns–/–Holka-3–/–myši měly hladiny srovnatelné s hladinami WT myší. MCP-1 je cytokin, který se může uvolňovat v séru a tvoří gradient k přitahování monocytů a makrofágů k místu poranění.35 Nárůst MCP-1 v séru Ctns–/–myši ve srovnání s Ctns–/–Holka-3–/–myši byly nezávislé na akumulaci cystinu, protoželedvinaobsah cystinu byl u obou genotypů podobný. Kromě toho, navzdory léčbě cysteaminem, která umožnila únik cystinu z lysozomů, bylo zjištěno, že MCP-1 byl významně zvýšen v séru pacientů scystinózave srovnání se zdravými dárci. Tyto údaje silně naznačují, že absencecystinosin, spíše než akumulace cystinu, je odpovědná za zvýšení MCP-1 v séru. Kromě toho jsme ukázali přímou interakci mezi Gal-3 a MCP-1, kterou nedávno navrhli Gordon-Alonso et al.43, ale nebyla dále studována. Mechanismus aktivace MCP-1 zprostředkované Gal-3 zde nebyl studován. Hypotézou je přítomnost signálního peptidu v lidském MCP-1, který lze štěpit, aby se zvýšila jeho sekrece.44 Kromě toho může plasmin štěpit C-konec MCP-1, což zvyšuje jeho chemoatraktant potence.45 Kromě toho, v korelaci s našimi údaji, inhibice MCP-1 na myším modelu diabetické nefropatie zabránila infiltraci renálních makrofágů a zlepšila funkci ledvin.46,47 Vcystinóza, naše data silně naznačují, že absencecystinosinvede ke zvýšení Gal-3, což aktivuje MCP-1 mobilizaci krve a zlepšuje ledvinyzáněta progresechronické onemocnění ledvin.
Tato zjištění otevírají nové pohledy na potenciální terapeutické cíle, které by mohly omezit nebo oddálit degeneraci ledvin u pacientů scystinóza. Bylo zjištěno, že nesteroidní protizánětlivé léky, jako je aspirin a indometacin, inhibují expresi Gal-3 inhibicí jeho transkripce.48 Indomethacin se ve skutečnosti používá k regulaci polyurie a polydipsiecystinóza,49 a nedávná studie 307 evropských pacientů s cystinózou prokázala zlepšený renální výsledek u pacientů léčených indomethacinem.50 Ve světle naší studie je použití indomethacinu nebo nesteroidních protizánětlivých lékůcystinózapacienti mohou být přehodnoceni.
METODY
Pokusy na zvířatech
C57BL/6 Ctns–/–myši poskytl Dr. Antignac (Inserm U1163, Paříž, Francie). C57BL/6 galektin-3 null (Gal-3–/–) myši poskytli Dr. Fu-Tong Liu (University of California, Davis) a Dr. Jerrold M. Olefsky (University of California, San Diego). Strategie šlechtění pro generování WT, Ctns–/–, dívka-3–/–, Ctns–/– a Gal- 3–/–myši jsou popsány v doplňkových metodách.
Buněčné linie
nepořádek byl vytvořen z novorozeneckých kožních biopsií WT a Ctns–/–myši. Buněčné linie MEF, 293T a MDCK typu II (ATCC, Manassas, VA) byly pěstovány v Dulbeccově modifikovaném Eagle médiu obsahujícím 10 procenta fetálního telecího séra nebo fetálního hovězího séra, 100 jednotek/ml penicilinu, 0,1 mg/ml streptomycinu a 2 mM L-glutaminu.
Koimunoprecipitační a hmotnostní spektrometrická analýza
Ke studiu interakcí protein-protein byly MDCK buňky transdukovány pomocí lentivirového vektoru pRRL.SIN.cPPT.PGK/WPRE, aby se stabilně exprimovalycystinosin-GFP.51Koimunoprecipitace byla provedena tak, jak je popsáno v Doplňkové metody. Koimunoprecipitované proteiny byly rozděleny elektroforézou na dodecylsulfát-polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) a analyzovány hmotnostní spektrometrií, LTQ Orbitrap, jak již bylo popsáno.19
Buňky 293T exprimující Gal-3–GFP a MCP-1–DsRed nebo Gal-3– GFP a CTNS-DsRed byly použity pro koimunoprecipitaci, jak je popsáno v Doplňkové metody. Koimunoprecipitované proteiny byly rozděleny pomocí SDS-PAGE a Gal-3-vazebný MCP-1 byl detekován pomocí protilátky anti-DsRed (Clontech Laboratories, Mountain View, CA).
Subcelulární frakcionace
Osm jater bylo získáno od C57BL/6 myší a připraveno tak, jak bylo popsáno dříve.52 Podmínky gradientu byly v podstatě stejné, jako jsou popsány v původní publikaci,52 kromě toho, že místo metrizamidu byl použit Nycodenz.
Léčba pomocí inhibitoru Gal-3 a proteinázy K
Lyzáty zcystinosin-GFP MDCK buňky a 293T exprimující Gal-3–GFP a CTNS-DsRed nebo Gal-3–GFP a MCP-1–DsRed byly inkubovány s nebo bez 5 mM thiodigalaktosidu nebo 5 mM N - Acetyl-D-laktosamin, respektive 2 inhibitory Gal-3 CRD. Po 30 minutách inkubace při 4 - C za stálého třepání byly lyzáty inkubovány s 50 ml anti-GFP mikrokuliček a byla provedena imunoprecipitace, jak bylo uvedeno výše. Precipitované proteiny byly rozděleny pomocí SDS-PAGE na 10% gelu.
Lyzáty zcystinosin-GFP MDCK buňky a frakce obohacené o lysozomy myších jater byly inkubovány s nebo bez 2% Tritonu X-100 po dobu 10 minut při 4 - C a poté inkubovány 30 minut s nebo bez 2,5 mg/ml a 25 mg /ml proteinázy K, v daném pořadí. Po inaktivaci enzymu 1 mM fenylmethylsulfonylfluoridem po dobu 5 minut při 4 - C byly proteiny rozděleny pomocí SDS-PAGE na 10% gelu.
Imunofluorescenční analýza
Fixované MDCK buňky byly inkubovány s protilátkou anti-Lamp{0}} (OriGeneTechnologies, Rockville, MD) a anti-Gal-3 protilátkou (CedarlaneLaboratories, Burlington, Ontario, Kanada) 2 hodiny při pokojové teplotě a poté Alexa Fluor 555 sekundární protilátky (Invitrogen, Carlsbad, CA) po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Konfokální snímky byly pořízeny pomocí mikroskopu Zeiss LSM 700 (Carl ZeissMicroscopy, Jena, Německo).
293T buňky přechodně exprimující Gal-3–GFP samotný, Gal-3–GFP a DsRed nebo Gal-3–GFP acystinosin-DsRed byly kultivovány na krycím sklíčku před nasazením na sklíčko. Buňky byly zobrazeny pomocí přístroje Keyence BZ-X700 (Keyence Corp., Osaka, Japonsko).
Pevnýledvinařezy byly inkubovány přes noc při 4 - C s anti-CD68 (BioLegend, San Diego, CA) nebo anti-Gal-3 protilátkou (BioLegend), následovanou sekundární protilátkou Alexa Fluor 488 (Invitrogen), 1 hodina pokojová teplota. Snímky byly pořízeny pomocí přístroje Keyence BZ-X700. Kvantifikace exprese CD68 je popsána v Doplňkových metodách.
MEF exprimující Gal-3-GFP byly obarveny pomocí protilátky anti-Hsc70 (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) a zobrazeny, jak bylo popsáno dříve.53
Totální vnitřní odraz FL fluorescenční mikroskopie
WT a Ctns–/–MEF exprimující Gal-3–GFP a CTNS-DsRed byly nasazeny na 4-komorovou 35- mm borosilikátovou misku se dnem (Cellvis, Mountain View, CA). Po 2 dnech v kultuře byly MEF analyzovány totální vnitřní reflexní FL fluorescenční mikroskopií, jak bylo popsáno dříve54a v doplňkových metodách. Obrázky byly analyzovány pomocí softwaru ImageJ.
Analýza výrazu Gal-3
293T buňky exprimující Gal-3–GFP, Gal-3–GFP a DsRed nebo Gal-3–GFP a CTNS-DsRed a explantovanéledvinybyly lyžovány v radioimunoprecipitačním testovacím pufru obsahujícím koktejl inhibitorů proteinázy. Proteiny byly separovány na 4% až 15% gelu a odhaleny pomocí anti-Gal-3 (Abcam, Cambridge, UK) nebo anti-glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) .
Ledvinybyly homogenizovány v RLT pufru obsahujícím b-merkaptoethanol za použití Precellys 24 (Bertin Instruments, Montigny-le-Bretonneux, Francie). Byla izolována RNA a byla provedena Gal-3 – specifická kapková digitální polymerázová řetězová reakce, jak je popsáno v Doplňkové metody. Exprese transkriptu Gal-3 byla vyjádřena jako poměr ve srovnání s endogenní kontrolou 18S. K detekci hladiny Gal-3 v myších a lidských sérech byl použit enzymatický imunosorbentní test (Abcam) podle pokynů výrobce.
Funkce ledvin
Hladiny fosfátu v séru a moči, sérového kreatininu a močoviny byly odhadnuty pomocí soupravy QuantiChrom Phosphate Assay Kit, Quanti Chrom Creatinine Kit a QuantiChrom Urea Assay Kit (BioassaySystems, Hayward, CA). Hladiny proteinu v moči byly měřeny pomocí Pierce BCA Protein Assay Kit (Rockford, IL).
Histologie
V době, kdy byly myši zabity,ledvinybyly shromážděny, fixovány ve formalínu a zality do parafínu. Řezy obarvené hematoxylinem a eosinem byly zkontrolovány zaslepeným způsobem Dr. Marie Claire Gubler, jak je popsáno v Doplňkových metodách.
Měření obsahu cystinu
Měření tkáňového cystinu bylo provedeno hmotnostní spektrometrií (LC-ESI-MS/MS), jak bylo popsáno dříve.39
Standardní nefrektomie a simulovaná operace
CKD u myší bylo vyvoláno standardní operací mezisoučtu 2-stadia nefrektomie, jak bylo popsáno dříve.55,56Falešná skupina myší podstoupila stejný postup, ale bez řezáníledvinatkáň.
Hladina cytokinů v séru
Pro měření hladin cytokinů v myším séru, myšzánětkit cytometric bead array (BD Biosciences, San Jose, CA) byl proveden podle pokynů výrobce. Koncentrace MCP-1 v lidském séru byla stanovena pomocí enzymatického imunosorbentního testu zaměřeného proti MCP-1 (Abcam, Cambridge, UK) podle pokynů výrobce.
Statistická analýza
Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr - SEM. Významnost výsledku byla hodnocena nepárovým 2-tailed t-testem nebo nepárovým 2-tailed t-testem s Welchovou korekcí. Skupinová srovnání 3 nebo více podmínek byla provedena pomocí parametrických analýz rozptylu, po kterých následoval Tukeyho vícenásobný srovnávací test pro párová srovnání. Histologická skóre byla porovnána pomocí Mann-Whitneyho testu. Analýzy byly provedeny pomocí softwaru Prism 6 (GraphPad, San Diego, CA). P-hodnota nižší než 0,05 byla považována za významnou.
Schválení studie
Experimenty na myších byly prováděny v souladu s protokoly InstitutionalAnimal Use Committee. Použití lidské tkáně v této studii bylo schváleno University of California, San Diego, HumanResearch Protections Program.
ZVEŘEJNĚNÍ
SC je členem vědecké rady a členem správní radycystinózaVýzkumná nadace. SC je spoluzakladatelem, akcionářem a členem vědecké rady a představenstva společnosti GenStem TherapeuticsInc. Podmínky tohoto ujednání byly přezkoumány a schváleny Kalifornskou univerzitou v San Diegu v souladu s jejími zásadami střetu zájmů. Všichni ostatní autoři deklarovali žádné konkurenční zájmy.
poskytování Gal-3–/–myši. Děkujeme Lou Devanneaux a NicholeFlerchinger za jejich technickou pomoc a Elizabeth Souter za recenzi rukopisu. Za poskytnutí myši děkujeme Christopheru Alfonsovi z BDBiosciencezánětcytometric bead array a za jeho pomoc s interpretací výsledků. Tato práce byla podpořena granty Národního institutu zdraví RO1-DK090058 a R01-DK110162,CystinózaResearch Foundation a California Institute of Regenerative Medicine (CIRM, CLIN-09230). TL je podporována absolventským stipendiem z Vaincre Les MaladiesLysosomales. AB a JZ jsou podporovány společenstvem zcystinózaVýzkumná nadace. UCSD Neuroscience MicroscopyShared Facility bylo financováno grantem P30-NS047101 Národního institutu neurologických poruch a mrtvice (NINDS).
REFERENCE
1. Medzhitov R. Původ a fyziologické rolezánět. Příroda. 2008;454:428–435.
2. Donath MY. Cílenízánětpři léčbě diabetu 2. typu. Diabetes Obes Metab. 2013;15(suppl 3):193–196.
3. Jaffer U, Wade RG, Gourlay T. Cytokiny v syndromu systémové zánětlivé odpovědi: přehled. HSR Proc Intensive Care Cardiovasc Anesth. 2010;2:161–175.
4. Pecoits-Filho R, Heimburger O., Barany P. a kol. Asociace mezi cirkulujícími zánětlivými markery a reziduální renální funkcí u pacientů s CHRS. jsem JledvinyDis. 2003;41:1212–1218.
5. Gahl WA, Thoene JG, Schneider JA.Cystinóza. N Engl J Med. 2002;347: 111–121.
6. Cherqui S, Kalatzis V, Trugnan G, Antignac C. Cílenícystinosink lysozomální membráně vyžaduje signál na bázi tyrosinu a nový třídící motiv. J Biol Chem. 2001;276:13314–13321.
7. Kalatzis V, Cherqui S, Antignac C, Gasnier B.Cystinosin, protein defektní vcystinóza, je H()-řízený lysozomální cystinový transportér. EMBO J. 2001;20:5940–5949.
8. Cherqui S, Courtoy PJ. Renální Fanconiho syndrom ucystinóza: patogenní pohledy a terapeutické perspektivy. Nat Rev Nephrol. 2017;13:115–131.
9. Nesterová G, Gahl W. Nefropatickácystinóza: pozdní komplikace multisystémového onemocnění. Pediatr Nephrol. 2008;23:863–878.
10. Cherqui S, Sevin C, Hamard G, a kol. Intralysozomální akumulace cystinu u myší chybícystinosin, protein defektní vcystinóza. Mol Cell Biol. 2002;22:7622–7632.
11. Nevo N, Chol M, Bailleux A, et al. Renální fenotypcystinózamyší model závisí na genetickém pozadí. Transplantace nefrolového číselníku. 2010;25:1059–1066.
12. Kalatzis V, Serratrice N, Hippert C, a kol. Oční anomálie v acystinózazvířecí model napodobuje patogenezi onemocnění. Pediatr Res. 2007;62:156–162.
13. Průvodce Chevronnay HP, Janssens V, Van Der Smissen P, et al. Myší model naznačuje dva mechanismy změn štítné žlázy u kojencůcystinóza: snížená syntéza tyreoglobulinu v důsledku stresu endoplazmatického retikula/odpovědi na rozbalenou bílkovinu a zhoršeného lysozomálního zpracování. Endokrinologie. 2015;156:2349–2362.
14. Brodin-Sartorius A, Tete MJ, Niaudet P, et al. Cysteamine terapie oddaluje progresi nefropatickécystinózau pozdních adolescentů a dospělých.ledvinyInt. 2012;81:179–189.
15. Cherqui S. Cysteamine terapie: léčba procystinóza, není lék.ledvinyInt. 2012;81:127–129.
16. Gahl WA, Balog JZ, Kleta R. Nefropatickécystinózau dospělých: přirozená historie a účinky perorální terapie cysteaminem. Ann Intern Med. 2007;147:242–250.
17. Cherqui S, Courtoy PJ. Renální Fanconiho syndrom ucystinóza: patogenní pohledy a terapeutické perspektivy. Nat Rev Nephrol. 2017;13:115–131.
18. Napolitano G, Johnson JL, He J, et al. Poškození autofagie zprostředkované chaperony vede k selektivním defektům lysozomální degradace u lysozomálního střádavého onemocněnícystinóza. EMBO Mol Med. 2015;7:158–174.
19. Andrzejewska Z, Nevo N, Thomas L, et al.Cystinosinje složkou vakuolárního komplexu H-ATPáza-regulátor-hadr řídící savčí cíl signalizace rapamycinového komplexu 1. J Am Soc Nephrol. 2016;27: 1678–1688.
20. Rega LR, Polishchuk E, Montefusco S, et al. Aktivace transkripčního faktoru EB zachraňuje lysozomální abnormality u cystinotikledvinabuňky.ledvinyInt. 2016;89:862–873.
21. Dumic J, Dabelic S, Flogel M. Galectin-3: příběh s otevřeným koncem. Biochim Biophys Acta. 2006;1760:616–635.
22. Sciacchitano S, Lavra L, Morgante A, et al. Galektin-3: jedna molekula pro abecedu nemocí od A do Z. Int J Mol Sci. 2018;19(2).
23. Calvier L, Martinez-Martinez E, Miana M a kol. Vliv inhibice galektinu-3 na poškození srdce a ledvin vyvolané aldosteronem. Selhání srdce JACC. 2015;3:59–67.
24. Frenay AR, Yu L, van der Velde AR, et al. Farmakologická inhibice galektinu-3 chrání před hypertenzní nefropatií. Am J Physiol Renální Physiol. 2015;308:F500–F509.
25. Kolatsi-Joannou M, Cena KL, Winyard PJ, Long DA. Modifikovaný citrusový pektin snižuje expresi galektinu-3 a závažnost onemocnění u experimentálních akutních onemocněníledvinazranění. PloS One. 2011;6:e18683.
26. Martinez-Martinez E, Ibarrola J, Clavier L, et al. Blokáda galektinu-3 snižuje renální fibrózu u dvou normotenzních experimentálních modelů poškození ledvin. PloS One. 2016;11:e0166272.
27. Nevo N, Thomas L, Chhuon C, a kol. Dopadcystinózaglykosylace na stabilitu proteinu pomocí diferenciálního dynamického stabilního izotopového značení aminokyselinami v buněčné kultuře (SILAC). Mol Cell Proteomics. 2017;16:457–468.
28. Napolitano G, Johnson JL, He J, et al. Poškození autofagie zprostředkované chaperony vede k selektivním defektům lysozomální degradace u lysozomálního střádavého onemocněnícystinóza. EMBO Mol Med. 2015;7:158–174.
29. Majeski AE, Kostky JF. Mechanismy autofagie zprostředkované chaperony. Int J Biochem Cell Biol. 2004;36:2435–2444.
30. Xie W, Zhang L, Jiao H a kol. autofagie zprostředkovaná chaperony zabraňuje apoptóze degradací BBC3/PUMA. Autofagie. 2015;11:1623–1635.
31. Li X, Ma Q, Wang J a kol. c-Abl a Arg tyrosinkinázy regulují lysozomální degradaci onkoproteinu Galektin-3. Cell Death Differ. 2010;17:1277–1287.
32. Takeuchi H, Tanaka M, Tanaka A, et al. Převaha M2-polarizovaných makrofágů u rakoviny močového měchýře ovlivňuje angiogenezi, stupeň nádoru a invazivitu. Oncol Lett. 2016;11:3403–3408.
33.Chavez-Galan L, Olleros ML, Vesin D, Garcia I. Mnohem více než makrofágy M1 a M2 existují také makrofágy CD169( ) a TCR( ). Front Immunol. 2015;6:263.
34. Henderson NC, Sethi T. Regulacezánětgalektinem-3. Immunologic Rev. 2009;230:160–171.
35. Deshmane SL, Kremlev S, Amini S, Sawaya BE. Monocytový chemoatraktant protein-1 (MCP-1): přehled. J Interferon Cytokine Res. 2009;29:313–326.
36.Skowyra ML, Schlesinger PH, Naismith TV, Hanson PI. Spuštěný nábor strojů ESCRT podporuje endolysozomální opravu. Věda. 2018;360(6384).
37. MacKinnon AC, Farnworth SL, Hodkinson PS, et al. Regulace alternativní aktivace makrofágů galektinem-3. J Immunol. 2008;180: 2650–2658.
38. Sano H, Hsu DK, Yu L, a kol. Lidský galektin-3 je nový chemoatraktant pro monocyty a makrofágy. J Immunol. 2000;165:2156–2164.
