Jaký je rozdíl mezi divoce pěstovanými cistanche a uměle vypěstovanými cistanche při aktivitě na posílení imunity

Kontakt: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Zhao Bing; Yang Xiumei; Wu Daocheng; Ba Xueli; Li Quanxiao; Tan Yachao; Zhang Ailian

Abstraktní:

Objektivní:Porovnat účinky na posílení imunity divoce rostoucích cistanche a uměle kultivovaných polysacharidů cistanche z cistanche (dále: WCDPS a CCDPS v tomto pořadí).

Metody:Různé dávky (nízké, střední a vysoké) WCDPS a CCDPS a ovalbuminu (OVA) byly subkutánně imunizovány pomocí ICR myší, OVA-specifická protilátka IgG a podtypy protilátek IgGl a IgG2a byly detekovány pomocí ELISA a metodou MTT. Aktivita proliferace lymfocytů specifická pro OVA, průtoková cytometrie pro detekci hladiny exprese CD4 plus T buněk a CD8 plus T buněk.

Výsledek:WCDPS i CCDPS mohou významně zvýšit hladiny exprese OVA-specifických protilátek IgG a typizace protilátek IgG1 a IgG2a (P<0.05), and="" there="" is="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" the="" same="" doses="" of="" wcdps="" and="" ccdps="" (f="">0. 05); WCDPS and CCDPS can significantly promote OVA-specific lymphocyte proliferation, and the difference between the same dose is not statistically significant (P>0.05); WCDPS a CCDPS mohou také významně zvýšit procento podobsahu CD4 plus T a CD8 plus T buněk (P<0.05), and="" the="" difference="" between="" the="" same="" dose="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05), WCDPS a CCDPS neměly žádný vliv na hmotnost imunizovaných myší.

Závěr:Jak WCDSP, tak CCDPS mohou významně zvýšit humorální a buněčné imunitní reakce specifické pro OVA a mezi nimi není žádný statisticky významný rozdíl a mají dobrou bezpečnost.

Klíčová slova: cistanche; polysacharidy z cistanche; ovalbumin; adjuvans

Cistanche (C. deserticola. YC Ma),také známý jako Cunyun a Dayun, je po mnoho let parazitická bylina z čeledi Lydanaceae. Jedná se o vzácný a vzácný čínský léčivý materiál. Mezi jeho hlavní složky patří polysacharidy z cistanche, fenylethanoidní glykosidové sloučeniny cistanche, organické kyseliny, alkaloidy atd.⑷, mají mnoho funkcí, jako je vyživující esence a krev, napomáhají jangu a tonizují ledviny a zmírňují stárnutí⑸. Kvůli extrémně vysoké léčebné hodnotě cistanche je nadměrné využívání volně žijících druhů na pokraji vyhynutí a uměle pěstované cistanche byly úspěšné. Vědci doma i v zahraničí provedli mnoho výzkumů o chemických složkách a aktivních složkách divoce rostoucích a uměle pěstovaných cistanch, ale existuje jen málo zpráv o srovnání divokých a kultivovaných polysacharidů cistanche z adjuvantní aktivity cistanche (WCDPS/CCDPS). . Velké množství studií prokázalo, že rostlinné polysacharidy z cistanche jako adjuvans mohou regulovat imunitní odpověď těla. Mnoho výzkumníků použilo čínskou bylinnou medicínu jako adjuvans vakcíny a udělalo dobrý pokrok.

Tato studie je založena na předchozím výzkumu (6) pro srovnáníposílení imunityčinnosti Xinjiang WCDPS a CCDPS. Především prostřednictvím experimentů s imunizací myší byly různé dávky WCDPS a CCDPS subkutánně imunizovány OVA u ICR myší a jejich účinky na hladinu humorálníchimunitaa buněčná imunita indukovaná OVA po imunizaci. Porovnejtedivoce rostou cistancheauměle pěstovaná cistanchepolysacharidy Imunitní aktivita polysacharidů v citrusech může poskytnout referenci pro lepší rozvoj a využití uměle pěstovaných cistanche v Xinjiang.

Materiály a metoda

Experimentální materiály:

Divoce pěstované cistanche a kultivované cistanche (komerčně dostupné). Kultivační médium RPMI 1640 bylo zakoupeno od GIBCO; Fetální bovinní sérum bylo zakoupeno od Israel Bioind; Protilátky průtokové cytometrie: PE krysí anti myší CD3, APC krysí anti myší CD4, FITC krysí anti myší CD8a byly zakoupeny od American BD company, vaječný bílek Protein (ovalbumin, OVA) Sigma produkt, kozí anti-myší značený peroxidem křenu IgG, IgGl a IgG2a byly zakoupeny od Southbiotech, USA. Ostatní experimentální chemická činidla jsou všechna domácí analytická činidla.

Pokusná zvířata:

Samice myší ICR čistého stupně (6-8 týdnů, 18-22 g) byly zakoupeny z Experimental Animal Center of Xinjiang Medical University. Zvířata byla chována ve zvířecí místnosti naší laboratoře a experiment byl zahájen 7 dní poté, co byla zvířata aklimatizována.

Příprava WCDPS a CCDPS:

Odkaz [17] používá metodu extrakce vody a srážení alkoholem. Krátké kroky jsou následující: Vezměte suchý Xinjiang kultivovaný a divoký prášek cistanche, přidejte 10násobek objemu vazelíny a absolutního etanolu do ultrazvuku po dobu 1 hodiny; po sací filtraci zachyťte zbytek léku a osušte, přidejte dvakrát 10násobný objem destilované vody 37T Ultrasound, centrifugujte při 4 000 ot./min po dobu 10 minut, spojte supernatanty, rotačně odpařte a koncentrujte a srážejte přes noc s alkohol; po vakuové filtraci a sušení se získá surový extraktový prášek; Savage metoda ⑻ odstraňuje protein z WCDPS a CCDPS. Obsah polysacharidů z cistanche ve WCDPS a CCDPS stanovený metodou cibule-kyselina sírová byl 76,82 procenta a 59,58 procenta.

Očkování myší a odběr séra:

Samice myší ICR staré {{0}} týden byly použity jako experimentální zvířecí modely. Experiment byl rozdělen do 9 skupin, 5 v každé skupině: 0,9 procent NaCl, OVA 10 jig, OVA-Alum 200 |jLg, OVA-WCDPS 10 |xg, OVA -WCDPS 50 |xg, OVA- WCDPS 100 net, OVA-CCDPS 10 |jLg, OVA-CCDPS 50 |xg, OVA-CCDPS 100 net. Před imunizací se rozpustí v 0,9 procentech NaCl a myši se imunizují subkutánně dvakrát v intervalu 2 týdnů. Krev se odebere před imunizací a sérum-80Y se připraví a uloží pro pozdější použití.

Účinky WCDPS a CCDPS na růst myší:

Pro pozorování účinků WCDPS a CCDPS na růst myší byly hmotnosti myší v každé skupině zváženy v 0 d před počáteční imunizací, 14 d a 21 d po imunizaci.

Detekce IgG protilátek v myším séru a typizace po imunizaci WCDPS a CCDPS:

Ke stanovení sérových protilátek byla použita nepřímá metoda ELISA. Destička ELISA byla potažena 2,5 jig/ml OVA, 4Y přes noc; 3krát promyta PBST a poté přidáno 5 procent sušeného odtučněného mléka 37 1 pro blokování po dobu 1 hodiny; 3krát promyta PBST a přidána primární protilátka k myším po imunizaci v každé skupině Sérum, poměr ředění primární protilátky je 1:100, 100 pilulek na jamku, 37 TI h; po 3x promytí PBST přidejte sekundární protilátky: kozí anti-myší IgG, IgGl, IgG2a (l: 5 000) značené HRP 37 Inkubujte draka 1 h; po čtyřnásobném promytí PBST přidejte roztok substrátu tetramethylbenzidinu (TMB), aby se zabránilo světlu po dobu 15 minut. Přidejte 50 do každé jamky pro zastavení reakce pomocí 2 mol/l H2SO4 a změřte hodnotu A45O/655. Porovnejte hladiny protilátek v každé skupině.

Detekce proliferace lymfocytů myší sleziny po imunizaci WCDPS a CCDPS:

Metoda MTT byla použita k detekci proliferace lymfocytů ve slezině myší imunizovaných CCDPS a WCDPS. Slezina myší byla izolována za aseptických podmínek 21 dní po počáteční imunizaci a buňky sleziny byly zředěny 10 procentem FBS obsahujícím RPMI 1640 médiem, aby se jednotlivé buňky suspendovaly, spočítaly a upravily buňky(r buňky/ml rozetřete do 96-jamkové destičky pro kultivaci buněk, přidejte 20 OVA (konečná koncentrace 10 |xg/ml) a ConA (konečná koncentrace 5 prasete/ml), v tomto pořadí Stimulujte, nastavte prázdnou buněčnou kontrolu a prázdné sérum kontrola ve stejnou dobu, vložte ji do 37Y buněčného inkubátoru na 48 hodin, přidejte 20 MTT do každé jamky, 37^ a pokračujte v inkubaci po dobu 4 hodin, přidejte 100|±1 DMSO do každé jamky, aby se srdce rozpustilo a otestovalo 0 /63. Vyhodnoťte, vypočítejte stimulační index (SI) každé skupiny myší.

Exprese CD4 a CD8 na CD3 plus T buňkách po imunizaci WCDPS a CCDPS:

Průtoková cytometrie byla použita k detekci exprese CD4 plus T a CD8*T buněk na povrchu CD3 plus T buněk. Myší slezina byla izolována za aseptických podmínek 21 dní po primární imunizaci a slezina byla ošetřena médiem RPMI 1640 obsahujícím 10 procent FBS. Připravte jednobuněčnou suspenzi, spočítejte a upravte počet buněk na 1x106 buněk/vzorek, proveďte barvení CD4 a CD8 na povrchu CD3 plus T buněk, chraňte před světlem při pokojové teplotě po dobu 25 minut a použijte 10 ml fosfátem pufrovaný roztok obsahující 0,5 procenta FBS (fosfátem pufrovaný roztok). fyziologický roztok, PBS) 1 200 r/min 7 min jednou promyjte, přidejte 250 |jil PBS, nechte projít 200 mesh měděným meshem, průtokovou cytometrií pro detekci exprese CD4 a CD8 na povrchu CD3*T buněk.

Statistické metody:

Software Flowjo 7.6 zpracovává výsledky testů průtokové cytometrie; Pro analýzu dat se používá GraphPad Prism 5.0 a všechna data jsou založena na průměru ± standardní odchylce. Použijte Student a test k porovnání dat mezi experimentálními skupinami. P<0.05 means="" that="" there="" is="" a="" difference.="" statistical="">

Výsledek

1. The effect of WCDPS and CCDPS on the growth of mice: After co-immunization with WCDPS and CCDPS and OVA, weigh the weight of the mice (Table 1). There was no statistically significant difference in the bodyweight of mice in each group during the same growth period ( P>0.05).

2. Účinek WCDPS a CCDPS na OVA-specifickou protilátku IgG: WCDPS a CCDPS byly subkutánně imunizovány OVA pro detekci exprese OVA-specifické protilátky IgG v séru po 14 dnech a 21 dnech imunizace. Výsledky jsou ukázány na obrázku 1, WCDPS a CCDPS podporovaly expresi protilátky IgG v séru způsobem závislým na dávce; OVA plus WCDPS 50 p,g ve srovnání s OVA plus CCDPS 50 |xg může významně podporovat OVA-specifické protilátky ve srovnání s OVA plus CCDPS 50 |xg. Exprese IgG (F<0.05), but="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" significant="" compared="" with="" the="" aluminum="" adjuvant="" group="" (p="">0.05); the difference between WCDPS and CCDPS at the same dose was not statistically significant (P>0.05).

3. Vliv WCDPS a CCDPS na typizaci OVA-specifických protilátek: 21 dní po imunizaci byla detekována exprese OVA-specifické protilátky typizující IgG1 a IgG2a v séru. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 2. OVA-WCDPS 50 přípravek a OVA-WCDPS 100 |xg Mumu významně podpořily expresi protilátky IgG2a v séru než samotná skupina OVA (P<0.05); both="" ova-wcdps="" 50="" and="" ova-ccdps="" 50="" pigs="" could="" significantly="" promote="" the="" expression="" of="" ova-specific="" antibody="" iggl=""><0. 001);="" compared="" with="" ova-wcdps="" 50="" p,g,="" and="" ova-wcdps="" 100="" jig,="" the="" aluminum="" adjuvant="" group="" can="" significantly="" promote="" the="" expression="" of="" antibody="" igg2a=""><0.05); the="" expression="" of="" antibody="" typing="" is="" different="" between="" wcdps="" and="" ccdps="" at="" the="" same="" dose="" no="" statistical="" significance="" (p="">0.05).

4. Účinek WCDPS a CCDPS na proliferaci myších OVA-specifických lymfocytů: Za účelem detekce účinku WCDPS a CCDPS na slezinné lymfocyty byly polysacharidy z cistanche subkutánně imunizovány OVA a buňky sleziny byly odděleny 21 dní po imunizaci. a metoda MTT byla použita k jejich detekci. Podporujte OVA-specifickou proliferaci lymfocytů. Výsledky jsou ukázány na obrázku 3. WCDPS a CCDPS zvýšily OVA-specifickou proliferaci lymfocytů způsobem závislým na dávce. Kombinace WCDPS a CCDPS se skupinou OVA může významně podporovat OVA specifickou proliferaci lymfocytů ve srovnání se samotnou skupinou OVA. Proliferace lymfocytů (P<0.05); ova-wcdps="" 50="" jig="" and="" ova-ccdps="" 50="" |xg="" compared="" with="" an="" aluminum="" adjuvant="" group="" can="" significantly="" promote="" ova-specific="" lymphocyte="" proliferation=""><0.05); the="" same="" dose="" of="" wcdps="" there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" ccdps="" and="" ccdps="" (p="">0.05).

5. Účinek WCDPS a CCDPS na CD3 plus CD4 plus T a CD3 plus CD8 plus T buňky: 21 dní po subkutánní imunizaci WCDPS a CCDPS pomocí OVA byla exprese CD4 a CD8 v CD3 plus T buňkách detekována průtokovou cytometrií , jak je znázorněno na obrázku 4A Je ukázáno, že OVA-WCDPS 50, OVA-CCDPS 50 přípravek a OVA-WCDPS 100 mohou významně podporovat proliferaci CD3 plus CD4 plus T buněk (P<0.05); as="" shown="" in="" figure="" 4b,="" ova-wcdps="" 10="" a,="" ova-wcdps="" 50="" zhao="" significantly="" promotes="" the="" proliferation="" of="" cd3+cd8+="" t="" cells=""><0.05), ova-wcdps="" 100="" |xg,="" ova-ccdps="" 100="" significantly="" promotes="" the="" proliferation="" of="" cd3+cd8+="" t="" cells=""><0.01); but="" the="" same="" dose="" there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" wcdps="" and="" ccdps="" (p="">0.05); there was no significant difference between WCDPS and CCDPS and OVA compared with an aluminum adjuvant group (P>0.05).

Diskuse

Četné studie prokázaly, že čínská bylinná medicína má imunomodulační funkci "Da], a existuje také velké množství zpráv dokazujících, že polysacharidy čínské bylinné medicíny z cistanche lze použít jako adjuvans pro posílení imunitního účinku vakcín"3], a pouštní maso Xinjiang z Congrong vybrané v této studii je jedinečným léčivým materiálem v Sin-ťiangu a volně žijící druhy jsou na pokraji vyhynutí, v kombinaci s jejich vyšší léčebnou hodnotou je pěstování kulturních druhů zvláště důležité pro rozvoj a využití zdrojů léčivých rostlin . Nové vakcíny na současném trhu mají dobrou antigenní specificitu, ale špatnou imunogenicitu. Rostlinné polysacharidy z cistanche mohou tento nedostatek nahradit. moje země má velkou výhodu ve výzkumu čínské bylinné medicíny. Vyšetřujeme adjuvans vakcín z přírodních čínských bylinných léků. Vysoká proveditelnost. Studie ukázaly, že čínské rostlinné polysacharidy z cistanche mají různý stupeň regulace specifické imunity a nespecifické imunity, jako jsou polysacharidy Ganoderma z cistanche, polysacharidy Radixisatidis z cistanche, polysacharidy Poria cocos z cistanche, inulin polysacharidy z cistanche, atd.27ci Může zvýšit imunitní účinek vakcíny.

Kvůli rychlému nárůstu poptávky po cistanche byly její divoké druhy vytěženy a nyní jsou v mé zemi uvedeny jako ohrožené a chráněné rostliny. Na základě úspěchu umělé výsadby pouštního Caulis Carlsbad se očekává, že pěstované druhy nahradí divoké druhy. V tomto experimentu byly divoce pěstované cistanche a kultivované uměle kultivované cistanche polysacharidy použity jako OVA adjuvans k provádění in vivo experimentů imunizace myší. Testováním různých indikátorů byl zpočátku vyhodnocen imunitní účinek divoké a kultivované cistanche, což poskytlo referenci pro efektivní využití kultivované cistanche v Sin-ťiangu.

Abychom pochopili bezpečnost divoce rostoucí cistanche a pěstované uměle pěstovanécistanche sacharidyz cistanche, experimenty in vivo s imunizací zvířat pozorovaly vzhledové charakteristiky myší a zjistily, že myši nemají po imunizaci žádný průjem, vztyčené chlupy nebo slzy a jejich aktivity a dýchání jsou normální a nevyskytují se žádné svalové záškuby. Nebyl žádný významný rozdíl v tělesné hmotnosti myší v každé skupině kvůli fenoménu poruchy, což naznačuje, že imunizace WCDPS a CCDPS neovlivnila růst myší a má určitý stupeň bezpečnosti. Výsledky IgG protilátek a typizačních testů ukazují: WCDPS a CCDPS mohou významně zvýšit expresi OVA-specifické protilátky IgG po společné imunizaci s OVA a účinek je ekvivalentní hliníkovému adjuvans; může významně zvýšit expresi OVA-specifických protilátek typu IgG2a a IgGl. Ukazuje, že polysacharidy z cistanche současně zesilují Th1 a Th2 imunitní odpověď a není žádný významný rozdíl mezi WCDPS a CCDPS. Výsledky typizace protilátek IgG2a zjistily, že WCDPS a CCDPS a koimunizační skupina OVA může významně zvýšit expresi IgG2a ve srovnání se skupinou hliníkového adjuvans, hliníkové adjuvans je slabší v podpoře exprese T buněk, což dokazuje, že se používají WCDPS a CCDPS jako adjuvancia Schopnost podporovat buněčnou imunitu je výrazně vyšší než u hliníkových adjuvans.

Výsledky detekce proliferace lymfocytů metodou MTT ukázaly, že slezinné buňky myší v každé skupině byly stimulovány OVA. Stimulační index (SI) proliferace lymfocytů u WCDPS a CCDPS v kombinaci s OVA byl významně vyšší než u imunizační skupiny se samotným OVA. OVA- Index stimulace WCDPS 50 Ah a OVA-CCDPS 50 jig skupiny byl významně vyšší než u skupiny s hliníkovým adjuvans; ukazuje, že WCDPS a CCDPS v kombinaci se skupinou OVA mohou významně zvýšit proliferaci lymfocytů specifických pro OVA ve srovnání se skupinou OVA a skupinou s hliníkovým adjuvans.

Existují různé podskupiny T lymfocytů. CD3 je povrchová molekula všech T lymfocytů. Podle různých fenotypů je lze rozdělit na CD8 plus T buňky a CD4 T buňky. Molekuly CD4 plus mohou vznikat působením molekul MHC fl, které se po aktivaci používají především jako pomocné (Th) buňky. Molekuly CD8 plus musí být vytvořeny působením molekul MHC I. Po aktivaci se z nich stávají zabijácké (TC nebo CTL) buňky, které hrají důležitou roli v imunitě proti virovým infekcím a nádorové imunitě. 3". Průtoková cytometrie detekuje expresi CD3PD4 plus T a CD3 plus CD8 plus T lymfocytů, výsledky ukazují, že WCDPS a CCDPS mohou významně podporovat proliferaci CD4 plus T a CD8 plus T lymfocytů v určitém rozmezí dávek a neexistuje žádný významný rozdíl mezi WCDPS a CCDPS ve stejné dávce Kombinace CCDPS a OVA může stimulovat expresi CD3 plus CD4 plus T a CD3 plus CD8 plus T buněk a oba účinky jsou ekvivalentní.

Stručně řečeno, WCDPS a CCDPS jsou jako adjuvancia bezpečné. Po imunizaci OVA mohou současně zvýšit specifickou humorální imunitu a buněčnou imunitu. Ve srovnání s hliníkovými adjuvans mají WCDPS a CCDPS lepší účinky na posílení buněčné imunity a není žádný rozdíl v posilovacích účincích dvou polysacharidů z cistanche. Tyto výsledky výzkumu poskytují materiálové reference pro Xinjiang uměle kultivované polysacharidy cistanche z cistanche jako adjuvans a také poskytují materiálový základ pro screening bezpečných a účinných imunitních adjuvans z pouště Xinjiangcistanche.

Reference

[1] Zhao X, Sun W, Zhang S, a kol. Imunitní adjuvantní odpověď polysacharidů z Atractylodis macrocephalus Koidz u kuřat očkovaných proti newcastleské chorobě (ND) [J]. Carbohydr Polym, 2016, 190-196. DOI: 10. 1016/j. carb pop. 2016. 01.033.

[2]Li J, Wang X, Wang W, a kol. Vodní extrakt Pleurotus ferulate zvyšuje zrání a funkci dendritických buněk odvozených z myší kostní dřeně prostřednictvím signální dráhy TLR4 [J]. Vaccine, 2015, 33(16): 1923-1933. DOI: 10.1016/j. vakcína.2015.02. 063.

[3]Zhao H, Luo Y, Lu C, a kol. Enterická slizniční imunitní odpověď může spustit imunomodulační aktivitu polysacharidu Ganoderma u myší[J]. Planta Med, 2010, 76(3): 223-227. DOI: 10. 1055/S-0029-1186055.