pro více information:ali.ma@wecistanche.com

Identifikace a ověření cévní buňky adhezní protein 1 jako imunitní rozbočovač gen spojený s tubulointersticiálním poškozením při diabetickém onemocnění ledvin

Yan Jia, et al

ABSTRAKTNÍ

Diabetické onemocnění ledvin(DKD) je hlavní příčinouchronické onemocnění ledvin(CKD) a koncová fáze onemocnění ledvin (ESRD), ale patogeneze není zcela pochopena. Tubulointersticiální poranění hraje klíčovou roli ve vývoji a progresi DKD(Diabetické onemocnění ledvin). Cílem této studie bylo vyšetřit profil infiltrace tubulointersticiálních imunitních buněk a odhalit podklad mechanismy mezi poškozením tubulárních buněk a intersticiálním zánětem v DKD(Diabetické onemocnění ledvin)pomocí bioinformatiky strategie. Za prvé, analýza xCell identifikovala imunitní buňky vykazující významné změny v DKD(Diabetické onemocnění ledvin)tubulointerstitium, včetně upregulovaných CD4+ T lymfocytů, Th2 buněk, CD8+ T lymfocytů, M1 makrofágů, aktivované dendritické buňky (DC) a konvenční DC, stejně jako downregulované Tregs. Vteřina pyroptóza byla identifikována jako hlavní forma buněčné smrti ve srovnání s jinými formami programované buněčné smrti. Protein adheze cévních buněk 1 (VCAM1) byl identifikován jako nejlépe hodnocený hub gen. Korelační analýza ukázala, že VCAM1 byl významně pozitivně korelován s pyroptóza a infiltrované imunitní buňky v tubulointerstitiu. Upregulace VCAM1 v DKD tubulointerstitium bylo dále ověřeno v kohortě European Renal cDNA Bank a bylo bylo pozorováno, že negativně koreluje s rychlostí glomerulární filtrace (GFR). Naše studie in vitro validovaná zvýšená exprese VCAM1 v buňkách HK-2 za diabetických podmínek a pyroptóza inhibice disulfiramem snížila expresi VCAM1, zánětlivé uvolňování cytokinů a fibrózu. Závěrem lze říci, že naše studie identifikovala upregulovanou expresi VCAM1 v renálních tubulárních buňkách, které může interagovat s infiltrovanými imunitními buňkami, čímž podporuje fibrózu. Lék schválený FDA disulfiram může zlepšit fibrózu u DKD(Diabetické onemocnění ledvin)cílením na tubulární pyroptózu a expresi VCAM1.

KLÍČOVÁ SLOVA:DKD; tubulointerstitium; imunitní buňky; pyroptóza; VCAM1; disulfiram

Cistanche může léčitDiabetické onemocnění ledvin

Klikněte na Cistanche pro onemocnění ledvin

Úvod

Diabetické onemocnění ledvin(DKD), jedna z běžných komplikací diabetu, je hlavní příčinou chronického onemocnění ledvin (CKD) a konečného stadia onemocnění ledvin (ESRD) u mnoha rozvinutých a rozvojové země [1,2]. Podle zprávy od China Kidney Disease Network (CKNET), DKD(Diabetické onemocnění ledvin)představuje 26,70 % všech případů ČKD a ukládá velkou lékařskou a ekonomickou zátěž [2]. Patogeneze DKD je složitá a zahrnuje množství různých cest. Objasnění patologických charakteristik a patogeneze DKD pomůže zlepšit klinické řízení a identifikace nových terapeutických cílů.

Ačkoli glomerulární poškození je hlavním patologickým rysem DKD(Diabetické onemocnění ledvin), přibývá důkazů nedávno odhalil, že tubulointersticiální patologie [3,4], jako je tubulární atrofie, intersticiální fibróza a intersticiální infiltrační imunitní buňky, hraje kritická role ve vývoji a postupu DKD(Diabetické onemocnění ledvin)[5–7]. Bioinformatická analýza představuje efektivní metoda zpracování velkého množství data v extrémně krátkém čase a poskytuje cenné informace o nemoci. Nicméně bioinformatické studie zkoumající expresi tubulointersticiálních genů a infiltraci imunitních buněk v DKD jsou poměrně vzácné.

Účelem studie bylo popsat charakteristiky DKD(Diabetické onemocnění ledvin)tubulointersticiální imunitní buněčná infiltrace a identifikace některých klíčových imunitních buněk a zánětlivé geny, které poskytují nové poznatky do patogeneze a terapie DKD. První tubulointersticiální microarray dataset DKD(Diabetické onemocnění ledvin)byl staženo z Gene Expression Omnibus (GEO) databáze. Použití webového nástroje xCell [8] který provádí analýzu obohacení buněčného typu údaje o genové expresi pro 64 imunitních a stromálních typy buněk, nejprve jsme zkoumali rozdíly v infiltrace imunitních buněk mezi ledvinovými tkáněmi od jedinců s DKD(Diabetické onemocnění ledvin)a normální kontroly. Za druhé, seznam diferenciálně souvisejících imunit exprimované geny (DEG) byly vyšetřeny, mezi který je nejlépe hodnoceným genem, adheze cévních buněk protein 1 (VCAM1) byl identifikován jako imunní hub gen v DKD(Diabetické onemocnění ledvin). Poté jsou genové sady spojeny s různé formy buněčné smrti byly získány z GeneCards a pyroptóza byla hodnocena jako hlavní forma buněčné smrti pomocí variace genové sady analýzy (GSVA) a analýza obohacení genových sad (GSEA). Kromě toho korelační analýza ukázalo, že VCAM1 byl pozitivně korelován s tubulointersticiální infiltrací imunitních buněk a pyroptózy. Upregulovaný výraz VCAM1 v DKD tubulointerstitium byl dále ověřeno v evropské renální cDNA Bank (ERCB) kohorta a bylo pozorováno, že negativně koreluje s funkcí ledvin u pacientů s DKD. Studie in vitro potvrdila zvýšení Exprese VCAM1 v buňkách HK-2 kultivovaných pod diabetické stavy a inhibice pyroptózy lék disulfiram schválený FDA se snížil Exprese VCAM1, zánětlivé uvolňování cytokinů a fibróza. Proto tubulární pyroptóza a upregulovaný výraz VCAM1 může být cílem pro imunoterapii DKD.

Metody

Microarray data

Soubor dat lidské genové exprese GSE30529 byl staženo z Národního centra pro Gen biotechnologických informací (NCBI) Výraz Omnibus (GEO, databáze. GSE30529 (GPL571 [HGU133A_2] Affymetrix Lidský genom U133A 2.0 Array) se skládal z 10 DKD(Diabetické onemocnění ledvin)vzorky tubulů a 12 kontrolní vzorky

Zpracování dat

Nezpracovaná data v datovém souboru GSE30529 byla načtena a zpracována pomocí balíčku Limma a oligo [9,10]. Zpracování dat zahrnovalo korekci pozadí, normalizaci a výpočet výrazu. Při více sondy byly mapovány na jeden genový symbol, průměr byla vypočtena úroveň exprese sond a považovaná za úroveň genové exprese tohoto genu. Sondy, které se nemapovaly na geny, byly odstraněný.

Cistanche může léčitDiabetické onemocnění ledvin

Analýzy imunitních a stromálních buněk

Použili jsme nový genový podpis založený na metoda, xCell [8], pro odhad typu buňky skóre obohacení a určení profilu infiltrující imunitní buňky v tubulointerstiti pacientů s DKD(Diabetické onemocnění ledvin). xCell je metoda pro analýzu obohacování buněčného typu pomocí analýzy obohacování genových sad s jedním vzorkem (ssGSEA) , který vypočítá skóre obohacení pro buňku 64 typy, včetně 34 typů imunitních buněk, 30 typy stromálních buněk a dalších buněk. Překonává ostatní rozsáhlé analýzy v kilico (včetně CIBERSORT) tím, že zahrnuje více typů imunitní buňky a použití techniky kompenzace přelévání ke snížení závislostí mezi blízce příbuzné typy buněk. 34 typů imunity buňky byly rozděleny do devíti skupin, včetně Subpopulace CD4+T buněk, subpopulace CD8+ T buněk, gama delta T lymfocyty (Tγδ buňky), NK buňky, NKT buňky, subpopulace B buněk, subpopulace monocytů/makrofágů, dendritické buňky (DC) subpopulace a granulocyty Subpopulace.

Analýzy obohacení genových sad (GSEA) a genů set variační analýzy (GSVA)

Použití charakteristických genových sad jako referenčního genu set, provedli jsme analýzy variací genových sad (GSVA) mezi DKD(Diabetické onemocnění ledvin)a kontrolní tkáně pomocí balíček biovodičů GSVA [11]. Prahové hodnoty byly stanoveny pro změnu skóre obohacení > 1,0, p-hodnota< 0.05="" and="" t="" value="">2. Oba upregulované a byly identifikovány downregulované cesty. GSEA byla provedena s desktopovou aplikací GSEA [12] a mírou falešných zjišťování (FDR)<0.25 and="" p-value=""><0.05 were="" set="" as="" the="">

Konstrukce genových sad představujících různé formy analýzy buněčné smrti a obohacení

Genové sady představující různé formy buněčné smrti byly vytvořeny vyhledáváním klíčových slov "pyroptóza", "nekróza", "nekroptóza", "apoptóza", "feroptóza" a "autofagie" v GeneCards databáze (https://www.genecards.org/). Geny nekódující neproteiny byly odstraněny. Ten genové sady jsou uvedeny v tabulce S2. Pak genová sada GSEA byla provedena pomocí pracovní plochy GSEA aplikace pro vyhodnocení formy buněčné smrti v tubulointerstitium. Provedli jsme Pearsonovy korelační analýzy, abychom prozkoumali vztah mezi stěžejní cesty buněčné smrti a infiltrace imunitní buňky v tubulointerstiu

Analýza DEG a screening imunitního centra geny

DEG mezi pacienty s DKD(Diabetické onemocnění ledvin)a zdravé kontroly byly identifikovány pomocí balíčku "Limma" [13] v softwaru R. Upravená hodnota P<0.05 and="" log="" fold="" change="" (fc)="" ≥="" 1="" were="" set="" as="" the="" thresholds.="" a="" list="" of="" 1793="" immune-related="" genes="" was="" down-loaded="" from="" immport="" shared="" data="" (https://www.="" immport.org/shared/genelists),="" and="" shared="" genes="" from="" the="" two="" datasets="" (degs="" and="" immunerelevant="" gene="" list)="" were="" determined="" by="" constructing="" a="" venn="" diagram="" to="" identify="" immune-related="" hub="" genes.="" an="" analysis="" of="" the="" functional="" interactions="" between="" proteins="" might="" provide="" insights="" into="" the="" mechanisms="" of="" dkd="">(Diabetické onemocnění ledvin). V této studii protein-proteinové interakční (PPI) sítě devadesát čtyři sdílených genů bylo generováno pomocí databáze STRING (https://string-db.org/) a vizualizováno pomocí softwaru Cytoscape (verze 3.7.1, http://www.cytoscape.org/). Skóre interakce vyšší než 0,4 (střední spolehlivost) byla považována za statisticky významnou. CytoHubba, Plugin Cytoscape, byl použit k prozkoumání PPI geny síťového rozbočovače [14]. Mezi nimi VCAM1 byl nejlépe hodnoceným genem. Obohacovací analýzy třicet genů imunitního centra identifikovaných výše bylo provádí se pomocí online nástroje Metascape [15]. Dominantní moduly v síti PPI byly dále identifikovány pomocí pluginu MCODE (verze 1.4.2, http://apps.cytoscape.org/apps/ MCODE) v softwaru Cytoscape.

Ověření VCAM1 a korelační analýza s funkce ledvin

Diferenciální exprese VCAM1 v tubulointerstiti pacientů s DKD(Diabetické onemocnění ledvin)byl ověřen v kohortě ERCB (31 zdravých kontrol a 17 pacientů s DKD). Pak jsme použili Nephroseq online databáze v5 (http://v5.nephroseq.org), integrovaná platforma pro dolování dat pro datové soubory genové exprese onemocnění ledvin za účelem ověření korelace mezi expresí VCAM1 a klinickými rysy pacientů s DKD pomocí Pearsonovy korelační analýza v ERCB. P-hodnota<0.05 was="" considered="" statistically="">

Imunofluorescenční barvení pro VCAM1

Parafínové ledvinové řezy od pacienta klinicky diagnostikovaného s DKD(Diabetické onemocnění ledvin)byly obarveny s VCAM1. To bylo schváleno Výbor pro výzkum etiky Pekingu První univerzitní nemocnice (č. 20171280). Nespecifická vazba byla zablokována 3% BSA po fixaci a tepelném ošetření antigenu znovunabytí. Ledvinové řezy byly poté inkubovány s primární protilátkou proti VCAM1 (Abcam, ab134047, 1:200) přes noc při 4°C. Ten Byla získána sekundární protilátka značená Cy3 od Jackson ImmunoResearch. Nádor-sousední ledvinová tkáň ze vzorků nefrektomie byla používá se jako normální kontrola. Reprezentativní obrázky byly pořízeny kamerou Leica DFC 7000 T prostřednictvím softwaru Leica Application Suite V4.7.1.

Buněčná kultura

Lidské ledvinové 2 (HK-2) buňky, lidská ledvina proximální tubulární epiteliální buněčná linie, byly kultivovány v DMEM (11885084, Gibco, USA) doplněn s 10% fetálním bovinním sérem (10099141 C, Gibco, USA) a 1% penicilin/streptomycin (10378016, Gibco, USA) při 37 °C s 5 % CO2. Vysoká hladina glukózy (30 mM D-glukóza, G8644, Sigma) [16] a TNFα (40 ng/ml, 300–01A, PeproTech) [17] k vyvolání poranění buněk HK-2 in vitro. Disulfiram (DSL, 0,3 μM [18,19], NSC190940, Selleck), inhibitor tvorby pórů, byl přidán 3 hodiny před indukcí poranění buněk HK-2.

Západní skvrna

Celkový protein byl extrahován z buněk HK-2 pomocí RIPA pufr (Sigma, R0278) a koncentrace proteinu byla stanovena pomocí Pierce BCA Protein Testovací sada (Thermo Fisher Scientific, 23227). Další denaturované proteiny byly odděleny dodecylem sodným sulfát-polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS– PAGE) a poté elektricky převedeny na polyvinylidendifluoridové membrány (Millipore, IPVH00010). Membrány byly blokovány po dobu 60 minut s 5% mléko bez tuku rozpuštěné ve fyziologickém roztoku pufrovaném trisem obsahujícím 0,1 % Tween 20 (TBST). Skvrny byly inkubovány s následujícími relevantními primárními protilátkami přes noc při 4 °C: GSDMD (Abcam, ab209845, 1:1000), VCAM1 (Abcam, ab134047, 1:2000) a tubulin (ZSBio, TA-10, 1:5000). Inkubace s 1:1000 ředění sekundární protilátky konjugované HRP byla prováděna po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Po pět promývání TBST, membrány byly inkubovány s chemiluminiscenčním substrátem (Millipore, WBKLS0100) po dobu 5 minut a obrázky byly pořízeny pomocí přístroje Image Quant LAS 4000 Mini systém (GE Healthcare). Semikvantitativní analýza byla provedena pomocí softwaru ImageJ (Media Kybernetika, Stříbrný pramen, MD).

Izolace RNA a RT–PCR analýza

Celková RNA byla extrahována z buněk HK-2 pomocí RNAsimple Total RNA Kit (Tiangen, DP419) podle pokynů výrobce a reverzní přepsáno do cDNA pomocí sady FastKing RT Kit (Tchien-čen, KR116). Byla provedena kvantitativní PCR použití systému StepOne Real-Time PCR (aplikované Biosystems, USA) dvoustupňovými metodami. Ten sekvence použitých primerů jsou uvedeny v tabulce S4. Byla vypočtena srovnávací genová exprese pomocí metody 2−ΔΔCt, jak je popsána výše.

Statistická analýza

GraphPad Prism 6.0 software byl použit pro statistické analýzy a data jsou prezentována jako prostředek ± SEM. Pro srovnání mezi dvěma skupinami byl použit dvoustranný nepárový t-test. Rozdíly na P< 0.05="" level="" were="" considered="" statistically="">

Cistanche může léčitDiabetické onemocnění ledvin

Výsledky

Shromažďování důkazů nedávno odhalilo, že tubulointersticiální patologie hraje kritickou roli v vývoj a progrese DKD(Diabetické onemocnění ledvin). Účel studie bylo popsat charakteristiky DKD(Diabetické onemocnění ledvin)tubulointersticiální infiltrace imunitních buněk a identifikace některých klíčových imunitních a zánětlivých genů poskytují nové pohledy na patogenezi a terapii DKD. V této studii jsme zkoumali profil tubulointersticiální infiltrace imunitních buněk a identifikoval pyroptózu jako hlavní formu programované buňky úmrtí v DKD(Diabetické onemocnění ledvin)pomocí bioinformatické analýzy. VCAM1 byl identifikován jako nejlépe hodnocený imunitní rozbočovač a byl pozitivně korelován s pyroptózou a infiltrované imunitní buňky. Kromě toho VCAM1 bylo potvrzeno, že zvýšení u renálních tubulárních buňky kultivované za diabetických podmínek. Léčivo disulfiram schválené FDA inhibovalo renální tubulární buňky pyroptóza a snížená exprese VCAM1, zánětlivé hladiny cytokinů a fibróza in vitro.

1. Pracovní postupy analýzy bioinformatiky

Hlavní kroky pracovního postupu jsou znázorněny na obrázku 1. Nejprve jsme hodnotili infiltraci imunitních buněk v tubulointersticiálních tkáních u pacientů s DKD(Diabetické onemocnění ledvin). Potom pyroptóza, hlavní forma buněčné smrti v tubulointerstitiu, byla objevena pomocí GSEA a GSVA. Dále jsme prověřili seznam genů blízce příbuzných k infiltraci imunitních buněk a identifikovaným genům náboje. Byla provedena korelační analýza mezi infiltrovanými imunitními buňkami, pyroptózou a genem horního náboje VCAM1. Kromě toho byla provedena klinická validace a imunobarvující validace VCAM1. Nakonec jsme dále provedli studii in vitro, abychom validovat výsledky bioinformatické analýzy.

2. Imunitní a stromální buněčná dekonvoluce analýzy

Použili jsme xCell, který generuje skóre obohacení buněčného typu pomocí hromadných dat genové exprese, abychom určit typy buněk, které se potenciálně podílejí na tubulointersticiální poranění udiabetické onemocnění ledvin. Skóre obohacení 64 typů buněk, včetně 34 typů imunitních buněk a 30 typů stromálních a jiných buněk, byly získány pro každou vzorek (obrázek 2 a)). Heatmapa 34 imunní skóre obohacení buněk bylo ilustrováno k identifikaci imunitní krajina DKD(Diabetické onemocnění ledvin)tubulointerstitium (obrázek 2 b)). Ve srovnání s normálním kontroly, většina skóre obohacení T buněk byly relativně vyšší u pacientů s DKD(Diabetické onemocnění ledvin), kromě CD4+ Tcm, Tregs, Th1 buněk, CD8+ naivní T buňky a NKT buňky. Obohacení skóre ADC a cDC bylo vyšší u pacientů s DKD(Diabetické onemocnění ledvin)než v ovládacích prvcích, zatímco Pro-B buňka skóre obohacení bylo nižší u pacientů s DKD. Skóre obohacení většiny podskupin monocytů/makrofágů a granulocytů bylo mezi DKD se významně neliší(Diabetické onemocnění ledvin)a normální tkáně, s výjimkou makrofágů M1 a neutrofily a eozinofily (tabulka 1).

Obrázek 2. Analýza infiltrace imunitních buněk pomocí xCell v tubulointerstitiu DKD(Diabetické onemocnění ledvin). a) Porovnání skóre buněk 64 typů buněk v tubulointerstitiu mezi DKD a kontrolní renální tkání v souboru údajů GSE30529. b) Buněčná krajina imunitního mikroprostředí v DKD(Diabetické onemocnění ledvin). Heatmapa představuje skóre obohacení buněčného typu každého typu imunitní buňky pro všechny vzorky. DC, dendritická buňka; Tcm, centrální paměť T buňka; Tem, efektivní paměť T buňka; Tγδ buňka, gama delta T buňka.

3. GSVA a GSEA charakteristických genových sad

Provedli jsme GSVA a GSEA charakteristického genu v datové sadě GSE30529 a prozkoumejte biologické procesy v DKD(Diabetické onemocnění ledvin)tubulointerstitium. Signalizace "interferon-alfa odezva", "interferon-gama odezva" a "komplement" cesty byly významně aktivovány v patogenezi tubulointersticiálního poranění u pacientů s DKD (obrázek 3 a)) a shrnutí GSVA výsledky jsou zobrazeny v tabulce S1. Poté jsme provedli GSEA tří genových sad a zjistili jsme že byly pozitivně obohaceny v datovém souboru. Normalizované skóre obohacení (NES) bylo 1,89, 1,89 a 1,70, s normalizovanými hodnotami p (hodnoty NOM p) 0,000, 0,002 a 0,019 (obrázek 3(b-d)). Všechny významné obohacené cesty identifikované pomocí GSEA jsou uvedené v tabulce 2. Tyto údaje naznačují, že tubulointersticiální imunitní odpověď hraje důležitou roli v patogenezi DKD(Diabetické onemocnění ledvin).

4. GSEA a GSVA genových souborů spojených s různé formy buněčné smrti

Buněčná smrt zahrnuje pyroptózu, nekrózu, nekroptózu, apoptózu, feroptózu a autofagii, která mají různé patofyziologické mechanismy a signální dráhy. Byly hlášeny různé formy programované buněčné smrti spojené se zánětlivými a imunitními odpovědi. Zkonstruovali jsme genové sady několika typy buněčné smrti z genokartů (tabulka S2) a poté provedl gSEA i GSVA prozkoumat zapojení buněčné smrti do tubulointersticiální zánět u pacientů s Moderátor(Diabetické onemocnění ledvin). GSEA ukázala, že pouze pyroptóza Genové soubory byly významně obohaceny u pacientů s DKD(Diabetické onemocnění ledvin)ve srovnání s běžnými kontrolami (NES = 1,65, FDR q hodnota = 0,023, FWER = 0,013) (obrázek 3(e)). Mezitím Skóre GSVA pro pyroptózu bylo nejvyšší ze všech různých analyzovaných typů buněčné smrti (tabulka S3). Na základě tohoto výsledku pyroptóza může hrát roli v patogenezi tubulointersticiálních poranění u pacientů s DKD(Diabetické onemocnění ledvin).

Obrázek 3. Analýzy obohacení genových sad (GSEA) a analýzy variací genových sad (GSVA). a) Barplot výsledků GSVA 50 charakteristických genových sad. b)-d) výsledky GSEA "Hallmark_ odezva interferon-alfa", "Hallmark_ interferon-gama odezva" a "puncovní doplněk". e) GSEA výsledek pyroptózy.

5. Korelace mezi obohacením pyroptózy skóre a infiltrace imunitních buněk

Skóre obohacení GSVA pro pyroptózu korelovalo s podílem infiltrace imunitních buněk provedením Pearsonovy korelace analýza k vyhodnocení korelace mezi pyroptózou a infiltrací imunitních buněk. My byla pozorována významná korelace mezi 15 typy imunitních buněk a pyroptóza (obrázek 4), což naznačuje úzkou interakci mezi imunitními buňky a pyroptóza.

6. Objev jádrových genů

Analýza diferenciálního výrazu byla provedena za dále zkoumat vztah mezi renálními tubulárními buňkami a intersticiálními imunitními buňkami. Mezi DKD bylo identifikováno čtyři sta osm DEG(Diabetické onemocnění ledvin)skupina a kontrolní skupina, z toho 65 bylo sníženo a 343 zvýšeno (Obrázek 5). Byl stažen seznam genů souvisejících s imunitou, aby bylo možné identifikovat DEG související s imunitou, a bylo získáno devadesát čtyři imunitních genů hubu ze dvou datových souborů (DEG a imunitně podmíněné seznam genů) pomocí Vennova diagramu (obrázek 6 a)). Ten PPI analýza těchto devadesáti čtyř hub imunní geny odhalily 97 uzlů a 694 interakcí (Obrázek S1). Prvních 30 uzlů vypočtených pomocí Algoritmus MCC byl identifikován jako geny rozbočovače (Obrázek 6 b) a tabulka 3). Pak obohacení byla provedena analýza hub genů. "Odmítnutí alogenního štěpu", "interferon-gama odpověď", "zánětlivá odpověď", "odpověď interferon-alfa", "epitelálně-mezenchymální přechod" a "komplement" byly nejvíce obohacenými položkami v analýze puncovních značek. "Revmatoidní artritida", "interakce cytokinových receptorů", "Toll-like receptor signální dráha", "černý kašel" a "NF-kappa" B signální dráha" byla nejvíce obohacena Podmínky KEGG. "Interferon buněčné odpovědi gama", "chemokinová aktivita", "buňka leukocytů adheze" a "regulace produkce cytokinů" byly nejvíce obohacenými pojmy GO (obrázek 6 c)). Bodovací systém MCODE navíc identifikoval dva klastry se skóre ≥5. PTRPC, TRIM22, PSMB8, KNG1 a CXCL6 byly rozbočovací uzly s vyšší stupně uzlů v modulu 1 (obrázek 6 písm. d)), a CD1C, EGF, FCER1G, CD3D a CD48 byly uzly rozbočovače v modulu 2 (obrázek 6(e)).

7. Korelace mezi výrazem VCAM1 a infiltrující imunitní buňky

Mezi identifikovanými geny hubu se umístily na prvním místě Gen VCAM1 byl identifikován jako imunitní rozbočovač gen v DKD(Diabetické onemocnění ledvin). Exprese VCAM1 byla významně zvýšena u pacientů s DKD(Diabetické onemocnění ledvin)(Obrázek 7 a)). Korelační analýza ukázala, že Exprese VCAM1 byla pozitivně korelována s CD4+ T buňky (r = 0,6877, P = 0,0004), CD4+ T paměťové buňky (r = 0,7102, P = 0,0002), Th2 buňky (r = 0,7358, P< 0.0001),="" cd8+="" tcm="" (r="0.6026," p="0.0030)," tγδ="" cells="" (r="0.5864," p="0.0041)," nk="" cells="" (r="0.5692," p="0.0057)," macrophages="" (r="0.5068," p="0.0161)," m1="" macrophages="" (r="0.4441," p="0.0384)," adcs="" (r="0.4814," p="0.0233)" and="" cdcs="" (r="0.6562," p="0.0009)" but="" negatively="" correlated="" with="" naïve="" cd8+="" t="" cells="" (r="−0.4909," p="0.0204)" and="" nkt="" cells="" (r="−0.5548," p="0.0074)" (figure="">

8. Korelace mezi výrazem VCAM1 a pyroptóza

Pearsonova korelační analýza byla provedena za prozkoumat, zda upregulovaná exprese VCAM1 v tubulointerstitiu pacientů s Moderátor(Diabetické onemocnění ledvin)souvisí s pyroptózou. Výraz VCAM1 úzce souvisel s pyroptózou (r = 0,6118, P = 0,0025) (obrázek 7(c)), což naznačuje, že pyroptóza může vyvolat expresi VCAM1.

9. Ověření, klinický význam a imunofluorescenční validace VCAM1 výraz

Provedli jsme relevantní analýzu pacientů s Moderátor(Diabetické onemocnění ledvin)od ERCB k ověření změny ve VCAM1 výraz v DKD(Diabetické onemocnění ledvin)tubulointerstitium. Konzistentně byly hladiny VCAM1 mRNA významně vyšší u pacientů s DKD(Diabetické onemocnění ledvin)(Obrázek 8 a)). Exprese VCAM1 byla negativně korelována s rychlost glomerulární filtrace (GFR) (r = −0,5920, P = 0,0123) (obrázek 8 b)) a pozitivně korelované s hladinami kreatininu v séru (r = 0,5189, P = 0,0328) (Obrázek 8 písm. c)). Dále jsme provedli imunofluorescenční barvení VCAM1 v ledvinové tkáni pacienta s DKD(Diabetické onemocnění ledvin)a zjistil, že ledviny tubulární exprese VCAM1 byla signifikantně upregulována ve srovnání s expresí normálních ledvin (Obrázek 8 písm. d)).

10. DSL inhibuje HG-indukovanou HK-2 buněčnou pyroptózu, expresi VCAM1 a zánět

Kultivované buňky HK-2 jsme vystavili vysokým hladinám glukózy (HG) a TNF-α po dobu 48 hodin, abychom dále určili vztah mezi tubulární buněčnou pyroptózou, expresí VCAM1 a tubulointersticiální imunitní odpovědí u jedinců s DKD(Diabetické onemocnění ledvin). Vzhledem k tomu, že jádrem buněčné pyroptózy je tvorba membránových pórů vyvolaná štěpeným GSDMD, detekovali jsme hladiny GSDMD N-terminálové domény (GSDMD-NT) a VCAM1 pomocí western blottingu. Indukované HG i TNF-α významné zvýšení úrovně GSDMD-NT, indikující výskyt GSDMD zprostředkovaného pyroptóza (obrázek 9 a)). Výraz VCAM1 byl statisticky významně se zvýšila u HG a TNF-α skupiny (obrázek 9 b)). Disulfiram (DSL) je účinný inhibitor tvorby pórů GSDMD [18]. Předběžná úprava přípravkem DSL zmírnila zvýšení v hladinách GSDMD-NT, což naznačuje, že buněčná pyroptóza byla potlačena. Mezitím byla exprese VCAM1 snížena v HG předléčeném DSL a TNF-α skupiny (obrázek 9(a-b)). Dále byl stanoven profil zánětlivých cytokinů pomocí qPCR. Výsledky ukázaly, že upregulované úrovně MCP-1, IL-1β a IL-18 mRNA indukované HG byly významně sníženy poté, co Předúprava DSL. Ve skupině TNF-α úroveň IL-1β významně poklesl ve skupině předléčené DSL a hladiny MCP-1 a IL-18 se významně nezměnil. Žádné významné změny hladin IL-6 a IL-8 mRNA byly nalezeny v jakékoli skupině. Důležité je, že TGF-β1 Hladiny mRNA byly také sníženy ve skupinách předléčených DSL. Tedy pyroptotické tubulární buňky zvýšená exprese VCAM1 při diabetických stavech a léčba zmírňující pyroptózu inhibovaná exprese VCAM1, zánět a fibróza v buňkách HK-2.

Cistanche může léčitDiabetické onemocnění ledvin

Klikněte zde na část II

Od: "Identifikace a ověření proteinu adheze cévních buněk 1 jako genu imunitního rozbočovače spojeného s tubulointersticiálním poškozením u diabetického onemocnění ledvin" Yan Jia a kol.

---BIOINŽENÝR 2021, VOL. 12, NO. 1, 6655–6673