Použití skóre tkáňového společného rejekčního modulu při transplantaci ledviny jako objektivní měřítko zánětu aloštěpu

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Arya Zarinsefat 1*, Jose M. Arreola Guerra2, Tara Sigdel 1, Izabella Damm1, Reuben Sarwal 1, Chitranon Chan-on1, Gyula Szabo3, Jorge L. Aguilar-Frasco4, Xicohtencatl Ixtlapale-Carmona

Carlos Salinas-Ramos 4 , Leonardo Ramirez-Martinez 4, Claudio Ramirez 4 , Mario Vilatoba4 , Luis E. Morales Buenrostro4 , Josefifina M. Alberu5 a Minnie M. Sarwal 1

Katedra chirurgie, University of California, San Francisco, CA, Spojené státy americké,

2 Interní oddělení, Nemocnice Centenario Miguel Hidalgo, Aguascalientes, Mexiko,

3 Katedra patologie, University of California, San Francisco, CA, Spojené státy americké,

4 Instituto Nacional de Ciencias Medicas y Nutricio´n Salvador Zubira´n, Mexico City, Mexiko,

5 Department of Medicine, Tecnologico de Monterrey, Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Mexico City, Mexiko

Dlouhodobá transplantace ledvin(KT) výsledky aloštěpu se nezlepšily, jak se očekávalo, navzdory lepšímu pochopení rejekce a zlepšené imunosupresi. Předchozí práce ověřila vypočítané skóre rejekce, tkáňový společný modul rejekce (tCRM), měřené amplifikačním hodnocením 11 genů z bioptických vzorků zalitých ve formalínu fixovaném v parafínu (FFPE), což umožňuje kvantitativní, nestranné hodnocení imunitního systému. zranění. Použili jsme tCRM v prospektivní studii u 124 příjemců KT a kontrastní hodnocení pomocí tCRM a histologických hodnot od 2 nezávislých patologů podle protokolu a biopsie příčiny po transplantaci. Pro extrakci RNA a amplifikaci 11 genů tCRM pomocí qPCR byly použity čtyři 10-mm holení z bioptických vzorků FFPE, ze kterých bylo vypočteno skóre tCRM. Bioptické diagnózy buď akutní rejekce (AR) nebo hraniční rejekce (BL) byly považovány za přítomné záněty, zatímco stabilní biopsie neměly žádný zánět. Ze 77 biopsií, které oba patologové odečetli, byly přítomny celkem 40 neshody v diagnóze. Střední skóre tCRM pro AR, BL a stabilní diagnózy byly 4,87, 1,85 a 1,27, v tomto pořadí, s celkově významným rozdílem mezi všemi histologickými skupinami (Kruskal-Wallis, p < 0.0{="" {34}}01).="" mezi="" patology="" byly="" signifikantní="" rozdíly="" ve="" skóre="" tcrm="" jak="" nálezy="" zánětu="" vs.="" nesouhlas="" (p="0,003)," tak="" oba="" nálezy="" zánětu="" vs.="" oba="" nálezy="" bez="" zánětu="" (p="">< 0,001),="" spolu="" s="" celkovou="" významností="" mezi="" všemi="" skóre="" (="" kruskal-wallis,="" p="">< 0,001).="" logistický="" regresní="" model="" predikující="" zánět="" štěpu="" pomocí="" různých="" klinických="" prediktorových="" proměnných="" a="" tcrm="" odhalil="" skóre="" tcrm="" jako="" jediný="" významný="" prediktor="" zánětu="" štěpu="" (or:="" 1,90,="" 95%="" ci:="" 1,40–2,68,="" p="">< 0,0001).="" přesné,="" kvantitativní="" a="" nestranné="" hodnocení="" odmítnutí="" klinického="" vzorku="" je="" kritické.="" vzhledem="" k="" rozdílným="" diagnózám="" mezi="" patology="" na="" stejných="" vzorcích="" mohli="" jednotlivci="" využít="" skóre="" tcrm="" jako="" nerozhodný="" výsledek="" v="" nejasných="" situacích.="" navrhujeme,="" že="" kvantitativní="" skóre="" tcrm="" může="" poskytnout="" nezaujatou="" kvantifikaci="" zánětu="" štěpu="" a="" jeho="" rychlé="" vyhodnocení="" pomocí="" pcr="" na="" holení="" ffpe="" se="" může="" stát="" kritickým="" doplňkem,="" který="" pomůže="" řídit="" klinické="" rozhodování="" a="" dodávání="">

klíčová slova:transplantace ledvin, akutní rejekce, biomarkery, transkriptomika, formalín-fixovaný parafin-embedded (FFPE), zánět štěpu

Cistanche tubulosa zabraňuje onemocnění ledvin, kliknutím sem získáte vzorek

ÚVOD

Transplantace ledvin(KT) zůstává preferovanou léčbou u pacientů s terminálním onemocněním ledvin, se sníženou úmrtností ve srovnání s pacienty na pořadníku a lepším přežitím u různých demografických skupin (1–3). I přes výrazná zlepšení během jednoho rokuledvinapřežití aloštěpu [4], míra chronické ztráty štěpu po prvním roce po transplantaci zůstává značná. To bylo pozorováno navzdory lepšímu pochopení rejekce aloštěpu spolu s příchodem zlepšené imunosuprese. Současné klasifikační metody histologické rejekce trpí chybou ve výběru a neschopností přesně kvantifikovat zánětlivou zátěž v aloštěpu, což je důležitý prediktor dlouhodobé funkce štěpu a přežití (5–9). Důležité je, že předchozí studie ukázaly, že patologové korelace patologie renálního aloštěpu hodnoceného podle Banffa mají podstatné nesrovnalosti mezi interpretacemi biopsií (10, 11).

Předchozí práce v naší laboratoři analyzující data mikročipů celého genomu od 1 030ledvinaidentifikované biopsie aloštěpu srdce, plic a jater aspolečná imunModul odpovědi (CRM) 11 genů, které definují akutní odmítnutí (AR) napříč různými aloštěpy (12–14) a následně byl validován naledvinabiopsie aloštěpu (15, 16). I když tato data prokázala potenciální užitečnost použití objektivního měřítka, jako je skóre CRM, na pomoc při bioptické diagnóze, jednalo se o retrospektivní analýzy dříve uložené tkáně. Kromě toho nebyla provedena žádná srovnání mezi vícenásobnými zaslepenými patologickými čteními stejné biopsie nebo potenciální schopností skóre CRM být použito jako objektivní rozhodovací bod nebo pomocný datový bod, který by pomohl dospět k robustnější diagnóze.

V této analýze jsme se podívali na seriálledvinabiopsie, které byly získány jako součást klinické studie v KT. Použili jsme náš protokol, který měří genovou expresi 11 CRM genů z RNA izolované ze čtyř 10-mikrometrových odřezků bloku ve formalínu fixovaném parafínem (FFPE) s histologicky potvrzenými fenotypy AR, hraniční rejekcí (BL), a stabilní diagnózy. Toto skóre označujeme jako tkáňové CRM (tCRM) vzhledem k aplikaci skóre CRM na bioptickou tkáň (15, 16). Poté jsme porovnali diagnózy od 2 zaslepených patologů a porovnali je se skóre tCRM pro každou biopsii. Předpokládali jsme, že skóre tCRM by mohlo být použito jako datový bod pro pomoc při bioptické diagnostice a možná jako objektivní rozhodovací faktor, pokud mezi patology existuje neshoda.

cistanche přínos: protizánětlivý

METODY

Zápis pacientů a návrh studie

Pacienti a vzorky byly odebrány v rámci klinické studie TITRATE (Testing Immunosupression Threshold in Renal Allografts To Extend eGFR). Jeho metodiku lze konzultovat na portálu ClinicalTrials.gov (Identifikátor: NCT02581436). Stručně řečeno, toto je prospektivní, zaslepená, kontrolovaná klinická studie se 124 příjemci KT, kteří byli přiřazeni ke dvěma typům manévrů, aby se vyhodnotila účinnost a bezpečnost z hlediska včasné detekce AR, glomerulární filtrace (GFR) a indexů fibrózy. v protokolárních biopsiích 12 měsíců po KT. Monitorování renálních funkcí bylo založeno na GFR a biopsiích štěpu provedených podle protokolu 3 a 12 měsíců po KT a pro příčinu. Indukční imunosuprese (IS) byla přiřazena na základě imunologického rizika s Basiliximabem (nízké riziko), anti-thymocytárním globulinem (vysoké riziko) nebo bez indukční terapie u pacientů, kteří sdíleli dva haplotypy. Udržovací IS byl založen na takrolimu, mykofenolátu a prednisonu.

Současná studie byla doplňkovou analýzou genů tCRM (15) ve všech dostupných biopsiích KT. Pro naši studii bylo po vyloučení biopsií nultého dne k dispozici celkem 136 biopsií s odpovídající histologií biopsie, které byly všechny interpretovány patologem z Národního institutu lékařských věd v Mexiku. Z těchto 136 biopsií bylo 77 zasláno také do UCSF, aby byly provedeny slepé výsledky pro další posouzení korelace patologa. Biopsie byly interpretovány na základě nejnovějších Banffových kritérií v době studie (17). Jakákoli forma štěpu AR (akutní buněčná nebo zprostředkovaná protilátkou) byla kombinována do jedné kategorie AR. U biopsií odebraných z UCSF byla k dispozici podrobnější histopatologická diagnostická data, včetně typu protilátkami zprostředkované rejekce (ABMR) a typu rejekce zprostředkované T-buňkami (TCMR).

Celková extrakce RNA

Postupovali jsme podle dříve publikovaného protokolu pro extrakci RNA z tkání FFPE (18). Na základě našich předchozích zkušeností jsme použili 4 × 10 mm silné řezy k extrakci celkové RNA ze vzorků FFPE pomocí PureLink FFPE Total RNA Isolation it (Thermo Fisher Scientific, Foster City, CA). Kvalita dat RNA byla hodnocena poměrem absorpčního signálu 260/280 a číslem RIN.

Syntéza cDNA a kvantifikace genové exprese pomocí qPCR

Celkem 50 ng RNA bylo reverzně transkribováno do komplementární DNA (cDNA) pomocí SuperScript VILO (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Foster City, CA) a poté amplifikováno v cílově specifickém amplifikačním kroku pro všech 11 genů pomocí TaqMan PreAmp Master Mix a TaqMan primery a sondy (Thermo Fisher Scientific, Foster City, CA) pro celkem 18 amplifikačních cyklů. Reakce qPCR byly provedeny v systému Fluidigm BioMark FD (Fluidigm, South San Francisco, CA) s použitím genu pro udržování genu 18S a lidské XpressRef Universal Total RNA (Qiagen, Valencia, CA) jako referenční RNA pro 40 cyklů. Výsledná data čipu byla zpočátku analyzována pro kontrolu kvality pomocí softwaru BioMark Analysis Software verze 2.0 (Fluidigm, South San Francisco, CA) a hodnoty Ct byly exportovány do tabulkového procesoru. Normalizace dat byla provedena ve dvou krocích. Hodnoty Ct jednotlivých genů byly normalizovány proti hodnotě Ct 18S pro každý gen pro získání hodnot dCt. Hodnoty dCt každého vzorku byly normalizovány proti hodnotám dCt referenčního vzorku, aby se získaly hodnoty ddCt, které byly následně použity k výpočtu hodnot násobné změny (RQ) pro každý gen v každém vzorku. Skóre tCRM bylo vypočteno pomocí geometrického průměru 11 genů CRM pro každý vzorek, jak bylo popsáno dříve (12).

Statistická analýza

Všechna data byla importována do R verze 3.6.2 (R Foundation, Vídeň, Rakousko) pro následné analýzy. Demografické údaje pacientů (tabulka 1) jsou uvedeny na základě skóre tCRM vyšším nebo nižším než 2,2, což je naše dříve stanovená hranice s optimálním AUROC pro predikci AR (15). Statistické testování bylo provedeno Studentovým t-testem pro spojité proměnné a chí-kvadrát testem pro kategorické proměnné. Bublinové a sloupcové grafy skóre tCRM pro každou skupinu patologické diagnózy byly vytvořeny pomocí balíčku ggplot2. Signifikantní rozdíly mezi všemi patologickými skupinami a párové rozdíly mezi každou skupinou byly stanoveny Kruskal-Wallisovým testem. Bylo provedeno hierarchické shlukování bez dozoru využívající různé patologické skupiny a geny tCRM s následnými tepelnými mapami vytvořenými pomocí balíčku heatmap. Považovali jsme skóre tCRM vyšší než 2,2 za molekulární diagnózu rejekce. Biopsii jsme definovali jako pozitivní na zánět, pokud byla patologická diagnóza buď AR nebo BL, a negativní na zánět, pokud byla diagnóza stabilní. Poté jsme vytvořili proměnnou shody mezi patology, kde oba uvedli, že zánět byl přítomen, oba uvedli, že žádný zánět nebyl, nebo nesouhlasili, pokud byl nějaký zánět přítomen. Sloupcové grafy a teplotní mapy pro skóre tCRM mezi proměnnou shody byly poté vytvořeny, jak je popsáno výše.

Vypočítali jsme logistický regresní model, abychom předpověděli binární výsledek zánětu na biopsii. Jako prediktorové proměnné zadáváme věk příjemce, index tělesné hmotnosti (BMI), opožděnou funkci štěpu (DGF), pohlaví, indukční režim, stav žijícího dárce, mužský dárce příjemci, předchozí KT, dialýzu před KT a skóre tCRM model.

Získali jsme delta GFR každého pacienta, vypočítanou jako změna v čase GFR při biopsii od jejich konečné GFR dva roky po KT. Použili jsme Pearsonův korelační koeficient ke korelaci delta GFR se skóre tCRM pacienta, které bylo získáno z biopsie. To se opakovalo po vyloučení skóre tCRM menšího než 2. Použili jsme nejvyšší hladiny dárcovských protilátek (DSA), které byly měřeny jinou cytometrií pro každého pacienta, reprezentované jako průměrná intenzita fluorescence FL (MFI), abychom provedli korelaci se skóre tCRM a vypočítat související Pearsonův korelační koeficient. Tato korelace byla také prezentována ve formátu bodového grafu. Pro analýzu sériových skóre jsme vynesli pacienty se sériovým skóre tCRM podle dnů po transplantaci se zaměřením na čtyři pacienty, kteří měli původní diagnózu AR, byli léčeni a poté následovala následná biopsie. Dva další pacienti, kteří měli zvýšené skóre tCRM, u nichž bylo vyhodnoceno, že mají stabilní diagnózu, ale poté se na jejich následných biopsiích vyvinula nová diagnóza AR, byli také vyneseni do grafu. Návrh studie a následná analýza jsou dále shrnuty v obrázkové podobě (obrázek 1).

VÝSLEDEK

Nálezy biopsie aloštěpu ledviny od dvou nezávislých, zaslepených patologů

Demografie pacientů a sledované klinické proměnné nevykazovaly žádné velké rozdíly mezi pacienty, kteří měli skóre tCRM vyšší nebo nižší než 2,2, s výjimkou vyššího věku dárce u pacientů se zvýšeným skóre tCRM v potransplantačních biopsiích (tabulka 1). Obě centra odečetla celkem 77 biopsií, přičemž patolog 1 (Mexiko) diagnostikoval 16 AR, 21 BL a 40 stabilních biopsií, zatímco patolog 2 (UCSF) diagnostikoval 10 AR, 39 BL a 28 stabilních biopsií (tabulka 2) . Mezi patology bylo celkem 40 neshodných diagnóz, přičemž většina těchto neshod pocházela z rozdílů v kategorii BL.

Tkáňový společný odmítací modul jako rozhodovací prvek rozlišuje mezi patologickými diagnózami

Poté jsme se podívali na schopnost skóre tCRM rozlišovat mezi patologickými diagnózami u jednoho patologa (s využitím biopsií odečtených na UCSF, vzhledem k tomu, že jsme měli k dispozici nejpodrobnější histopatologická data). Při pohledu na skóre tCRM podle histologické diagnózy jsme viděli jasné oddělení s vyšším skóre tCRM u pacientů s AR ve srovnání s BL/stabilní as vyšším podílem skóre > 2,2 u pacientů s AR (obrázek 2A). Střední skóre tCRM a interkvartilové rozsahy (IQR) pro AR, BL a stabilní diagnózy byly 4,87 (IQR: 2,44–6,99), 1,85 (IQR: 1,21–2,48) a 1,27 (IQR: 0,96– 2.14), resp. Navíc byl celkově významný rozdíl mezi všemi histologickými skupinami (p < 0="" 0,001),="" spolu="" s="" významnými="" rozdíly="" mezi="" ar="" vs.="" bl="" a="" ar="" vs.="" stabilní="" párová="" srovnání="" (obrázek="" 2b).="" to="" zdůrazňuje="" korelaci="" skóre="" tcrm="" s="" patologií="" klasifikovanou="" podle="">

Při provádění nekontrolovaného hierarchického shlukování genů tCRM vidíme relativně přesné shlukování podle patologické diagnózy (obrázek 2C). Při podrobném zkoumání každé biopsie, i když shlukování podle diagnózy ukazuje heterogenitu ve skupinách shluků, má odpovídající skóre tCRM (zobrazené jako barevný gradient) tendenci korelovat s diagnózou. Vidíme vyšší skóre u diagnóz odrážejících vyšší úrovně zánětu, což znamená schopnost tCRM rozlišovat a objektivně kvantifikovat zánět v aloštěpu bez zkreslení. Když jsme použili naši hranici tCRM 2,2 (molekulární diagnóza zánětu), vidíme silné shlukování pomocí molekulární diagnózy. Bez ohledu na to se většina AR a BL shlukuje společně s vysokou genovou expresí a vysokým skóre tCRM, s opakem u většiny histologicky odstupňovaných stabilních biopsií.

Tkáňový společný modul rejekce rozlišuje mezi konkrétními typy rejekce štěpu

Poté jsme se podívali na schopnost skóre tCRM rozlišovat mezi různými typy odmítnutí: C4d-pozitivní (n=9) a negativní ABMR (n=4), TCMR (n=3) , BL (n=21) a stabilní (n=40) biopsie. Střední skóre tCRM a IQR pro C4d pozitivní ABMR, C4d-negativní ABMR, TCMR, BL a stabilní diagnózy byly 4,22 (IQR: 3,80–5,98), 3,47 (IQR: 1,71–6,51), 2.{.{101} {23}} (IQR: 2,58–3.05), 1,91 (IQR: 1,32–2,88) a 1,37 (IQR: 0,99–2.00). Kromě toho existoval celkově významný rozdíl mezi všemi histologickými skupinami (p < 0,001)="" spolu="" s="" významnými="" rozdíly="" mezi="" párovými="" srovnáními="" zaměřenými="" na="" c4d-pozitivní="" abmr="" vs.="" tcmr,="" c4d-pozitivní="" abmr="" vs.="" bl,="" c4d-pozitivní="" abmr="" vs.="" stabilní="" ,="" tcmr="" vs.="" stabilní="" a="" bl="" vs.="" stabilní="" skupiny="" (obrázek="" 3a).="" to="" opět="" zdůrazňuje="" korelaci="" skóre="" tcrm="" se="" specifickou="" patologií="" klasifikovanou="">

Při provádění nekontrolovaného hierarchického shlukování genů tCRM vidíme podobné vzorce shlukování založené na zánětu štěpu, jak bylo popsáno dříve (obrázek 3B). Se specifičtějšími diagnostickými kategoriemi C4d-pozitivních a negativních ABMR a TCMR vidíme nejpozoruhodnější homogenní shlukování mezi skupinami ABMR. Stejně jako dříve, při podrobném zkoumání každé biopsie, i když shlukování podle diagnózy ukazuje heterogenitu ve skupinách shluků, má odpovídající skóre tCRM (zobrazené jako barevný gradient) tendenci korelovat s diagnózou. Vidíme vyšší skóre u diagnóz odrážejících vyšší úrovně zánětu, což znamená schopnost tCRM rozlišovat a objektivně kvantifikovat zánět v aloštěpu bez zkreslení. Nakonec první větev našeho shlukování bez dozoru obsahovala většinu vzorků, které měly jakýkoli stupeň zánětu štěpu, konkrétně všechny případy ABMR, TCMR nebo BL (obrázek 3B).

Modul Tissue Common Rejection Module Diskriminuje dohodou/nesouhlasem patologa

Poté jsme se podívali na skóre tCRM pro shodu a nesouhlas mezi patology, což bylo definováno, jak bylo vysvětleno dříve. Ze 77 potransplantačních biopsií, které přečetli oba patologové, oba uvedli, že u 33,8 procenta byl zánět, u 22,1 procenta žádný zánět, a nesouhlasili s přítomností zánětu u 44,2 procent vzorků. Při zkoumání skóre tCRM jsme zaznamenali zvýšení skóre, protože proměnná shody postupovala od žádného zánětu, nesouhlasu a souhlasu s přítomností zánětu (obrázek 4A). Mezi patology byly signifikantní rozdíly ve skóre tCRM, a to jak nálezy zánětu, tak nesouhlasu (p=0.003), a obou nálezů zánětu oproti oběma nálezům bez zánětu (p < 0,001="" ),="" spolu="" s="" celkovou="" významností="" mezi="" všemi="" skóre="" (p=""><>

Při provádění hierarchického shlukování genů tCRM bez dozoru jsme viděli shlukování vzorků biopsie na základě proměnné shody (obrázek 4B). Můžeme vidět, že shluky vysoké genové exprese odpovídají tomu, že se oba patologové shodují na přítomnosti zánětu, zatímco naopak nízká genová exprese odpovídá tomu, že se oba patologové shodují na tom, že mezi nimi není žádný zánět nebo neshoda. Navíc vidíme, že odpovídající skóre tCRM pro každou biopsii má tendenci upřednostňovat vyšší a nižší skóre, kde se patologové shodli na zánětu nebo žádném zánětu. I když shlukování není dokonalé, je viditelný jasný trend.

Tkáňový společný rejekční modul jako prediktor rejekce a funkce štěpu Výše ​​jsme ukázali klinickou užitečnost tCRM, pokud jde o stanovení přesných patologických diagnóz. Ačkoli se jeho aplikace týká toho, co je tradičně biopsií ověřená diagnóza, chtěli jsme prozkoumat použití tCRM v modelu pro predikci rejekce/zánětu. Pomocí naší binární proměnné zánětu (AR a BL biopsie) jsme vytvořili logistický regresní model pro predikci binárního výsledku zánětu na biopsii. Použité klinické proměnné byly popsány dříve (tabulka 3). Je zajímavé, že jediným významným prediktorem zánětu diagnostikovaného patologií bylo skóre tCRM (OR: 1,90, 95procentní CI: 1,40–2,68, p < 0.{{16="" }}01),="" zatímco="" přítomnost="" mužského="" dárce="" příjemkyni="" byla="" ochranná="" s="" hraniční="" významností="" (or:="" 0,27,="" 95%="" ci:="" 0,07–0,98,="" p="">

Poté jsme sledovali schopnost tCRM předpovídat dlouhodobé změny v GFR. Korelovali jsme delta GFR (od GFR v době biopsie po konečnou GFR) se skóre tCRM pacienta z této biopsie (Pearsonův korelační koeficient=0.21, p=0.{{6} }25). Poté jsme to zopakovali po vyloučení skóre tCRM menšího než 2, takže jsme se dívali pouze na nejvyšší hodnoty tCRM, abychom viděli účinek na delta GFR, což vedlo ke zvýšení korelačního koeficientu na 0,32 (p=0. 05). Také jsme se podívali na korelaci nejvyšší hladiny DSA každého pacienta s jejich přidruženým skóre tCRM (doplňkový obrázek 1), abychom zjistili, zda existuje nějaká souvislost mezi hladinami DSA a skóre tCRM, které jsme nezjistili jako korelační (Pearsonův korelační koeficient { {11}}, str.=0.99).

Nakonec jsme se podívali na pacienty, kteří měli sériové biopsie a skóre tCRM. Sériová skóre tCRM byla vynesena na pacienta podle dnů po transplantaci (obrázek 4C). Byli to čtyři pacienti, kteří měli původní diagnózu AR a byli léčeni, poté následovala následná biopsie (obrázek 4C, červené čáry). Zaznamenali jsme, že všichni čtyři pacienti měli zpočátku zvýšené skóre tCRM a po léčbě došlo ke snížení jejich skóre, přičemž pouze u jednoho pacienta byla při druhé biopsii diagnostikována AR. Je třeba poznamenat, že u dvou pacientů, kteří měli zvýšené skóre tCRM a které patolog vyhodnotil jako stabilní, došlo ke zvýšení jejich skóre tCRM a nové diagnóze AR při jejich následných biopsiích (obrázek 4C, modré čáry).

extrakt z cistanche tubulosa:zlepšit funkci ledvin

DISKUSE

Předpokládali jsme, že skóre tCRM by mohlo být použito jako datový bod pro pomoc při bioptické diagnostice a možná jako objektivní rozhodovací faktor, pokud mezi patology existuje neshoda. Výše jsme ukázali, že skóre tCRM může rozlišovat mezi patologickými diagnózami. tCRM je schopen rozlišovat mezi kombinovanou AR vs. BL vs. stabilními vzorky a je také schopen rozlišovat mezi specifičtějšími diagnózami AR, jako je ABMR vs. TCMR a ABMR vs. BL, jak jsme demonstrovali výše. Jednou ze známých nevýhod kombinované subjektivní/objektivní povahy Banffových kritérií je to, že mezi patology, kteří sledují identické bioptické vzorky, mohou existovat nesrovnalosti. Výše jsme prokázali, že neshody mezi patology ohledně zánětlivé zátěže v biopsiích ledvin jsou běžné. Ukazujeme, že pokud existuje shoda mezi patology o přítomnosti nebo nepřítomnosti zánětu, má tendenci být na extrémech skóre tCRM. Část užitečnosti ve skóre tCRM může spočívat zde v jeho schopnosti poskytnout objektivní měřítko zánětu, ale také sloužit jako nerozhodný výsledek v případech, kdy diagnóza není jasná, ale skóre tCRM jasně ukazuje tak či onak. Například patolog, který čte biopsii, u které si není jistý, že ji klasifikuje jako AR nebo BL, ale s velmi vysokým skóre tCRM, by mohl být objektivnější a přesnější při stanovení diagnózy AR.

Kromě toho tato studie naznačuje, že skóre tCRM lze použít k predikci dlouhodobějších klinických výsledků. I když je korelace mezi změnami v GFR a vyšším skóre tCRM slabá, ukázali jsme statisticky významnou pozitivní korelaci mezi nimi, s ještě větší korelací, když jsme filtrovali skóre tCRM vyšší než 2, což naznačuje, že vyšší skóre naznačuje vyšší stupeň aloštěpu poranění, které může predikovat dlouhodobou sníženou funkci štěpu (větší delta GFR). Je zajímavé, že jsme nenašli korelaci mezi hladinami DSA u pacientů a skóre tCRM. To může být částečně způsobeno skutečností, že mnoho pacientů s DSA nemusí nutně pokračovat v rozvoji ABMR, spolu s vědomím, že různé DSA mohou přinášet různá rizika skutečného rozvoje ABMR. Sledováním pacientů se sériovými biopsiemi a skóre tCRM jsme navíc ukázali, že u většiny pacientů se zvýšeným skóre tCRM a AR došlo k následnému snížení jejich skóre spolu se zlepšením zánětu štěpu při následných biopsiích (následná histologie přešla z AR na stabilní ). Pozoruhodné byly 2 případy, kdy bylo skóre tCRM výrazně zvýšené, přesto byla patologická diagnóza při biopsii stabilní. Oba tyto případy vedly k ještě většímu zvýšení skóre tCRM při následné biopsii s odpovídající patologickou diagnózou AR. To naznačuje možnost buď chybné diagnózy v důsledku subjektivní povahy histologické klasifikace, nebo toho, že zvýšená exprese genů tCRM, které korelují se zánětem štěpu, může předcházet skutečným patologickým nálezům, které by vedly k diagnóze AR. Bez ohledu na to to naznačuje užitečnost objektivnějšího skóre tCRM při stanovení diagnózy AR.

V době invazivní biopsie je důležité stanovit molekulární kvantifikaci celkové zánětlivé zátěže v renálním aloštěpu (5, 6, 9). Naše metoda usnadňuje použití již dostupných bioptických vzorků účinným způsobem (celkové doby experimentu jsou 4–6 hodin pro uvedené testy). Zatímco neinvazivní testy, jako je dárcovská bezbuněčná DNA (dd-cfDNA), jsou navrhovány pro časnou diagnostiku AR (19–23), jednou z nevýhod těchto testů je, že přímo nevyšetřují cílovou tkáň zájem, i když se dd-cfDNA uvolní z aloštěpu. Pomocí tCRM lze bioptickou tkáň, která již byla získána, zpracovat s použitím minimální tkáně buď z čerstvých biopsií, nebo z archivovaných bloků FFPE, čímž se většina rodičovského bloku FFPE zachová pro další histologické analýzy.

Naše studie je částečně omezena invazivní povahou tCRM. Biopsie zůstávají zlatým standardem a jsou často získávány, což umožňuje molekulární profilování pomocí tCRM, ale nakonec by byl pro pacienty nejideálnější přechod na neinvazivní testy krve nebo moči. Naše laboratoř v současné době pracuje na použití genů CRM v moči jako pomoc při diagnostice rejekce štěpu (14). Navíc, zatímco tato studie byla prospektivní studií, aplikace tCRM nebyla použita pro klinické rozhodování a byla spíše průzkumnou analýzou. Pro naši budoucí práci by bylo přínosné zvážit skóre tCRM jako možný cílový bod nebo skutečně zohlednit skóre při rozhodování o konečné patologické diagnóze pro bioptický vzorek. Navíc, zatímco naše studijní vzorky zahrnovaly diagnózy TCMR, většina našich dostupných vzorků pro analýzu byly vzorky ABMR. I když ukazujeme, že skóre tCRM je zvýšené bez ohledu na typ přítomné AR, budoucí práce bude muset využít větší počet vzorků v každé kategorii konkrétního typu AR.

Ukázali jsme, že skóre tCRM je schopno rozlišit mezi patologickými diagnózami pomocí již dostupných vzorků FFPE. Důležité je, že mezi různými patology existuje variabilita, což bylo prokázáno v našich datech na základě dvou zaslepených patologů, kteří stanovovali diagnózy. Jako takové prokazujeme, že tCRM může nejen pomoci při patologické diagnóze, ale zejména pokud existuje neshoda nebo nejistota, může být skóre použito k dosažení konečného, ​​robustnějšího závěru.

cistanche tubulosa přínos: léčba onemocnění ledvin

PROHLÁŠENÍ O DOSTUPNOSTI DAT

Nezpracovaná data podporující závěry tohoto článku budou zpřístupněna autory bez nepřiměřených výhrad.

ETICKÉ PROHLÁŠENÍ

Studie zahrnující lidské účastníky byly přezkoumány a schváleny UCSF IRB. Pacienti/účastníci poskytli svůj písemný informovaný souhlas s účastí v této studii.

AUTORSKÉ PŘÍSPĚVKY

AZ se podílela na návrhu analýzy, analýze dat, interpretaci, psaní rukopisů a úpravách rukopisů. JG přispěl k návrhu studie, sběru dat a kontrole rukopisu. TS se podílel na analýze dat a úpravě rukopisu. ID přispělo ke zpracování vzorku. Na zpracování vzorku se podílely RS a GS. Na zpracování a recenzi vzorku se podílela CC. JF, XC, CSR, LM a CR přispěly ke sběru vzorků a databází. MV přispěl k náboru pacientů a transplantacím. LB přispěla k zápisu pacientů. JA přispěl k návrhu studie, sběru dat a kontrole rukopisu. MS přispěl k návrhu studie, sběru dat, návrhu analýzy a revizi rukopisu. Všichni autoři přispěli k článku a schválili předloženou verzi.

zlepšit funkci ledvin cistanche tubulosa

REFERENCE

1. Wolfe RA, Ashby VB, Milford EL, Ojo AO, Ettenger RE, Agodoa LY a kol. Porovnání mortality u všech dialyzovaných pacientů, dialyzovaných pacientů čekajících na transplantaci a příjemců první kadaverózní transplantace.N EnglJ Med(1999) 341 (23): 1725-30. doi: 10.1056/NEJM 199912023412303

2. Meier-Kriesche HU, Ojo AO, Port FK, Arndorfer JA, Cibik DM, Kaplan B. Zlepšení přežití u pacientů s terminálním onemocněním ledvin: trendy v čase pro příjemce transplantátu a pacienty na čekací listině.J Dopoledne Soc Nephrol(2001) 12(6):1293-6. DOI: 10.1111/j.{7}}.2004.00332.x

3. Oniscu GC, Brown H, Forsythe JLR. Vliv kadaverózní transplantace ledvin na přežití u pacientů zařazených k transplantaci.J Am Soc Nephrol(2005) 16 (6): 1859–65. DOI: 10.1681/ASN.2004121092

4. Hariharan S, Johnson CP, Bresnahan BA, Taranto SE, McIntosh MJ, Stablein D. Zlepšené přežití štěpu po transplantaci ledvin ve Spojených státech, 1988 až 1996.N EnglJ Med(2000) 342 (9): 605–12. DOI: 10.1056/NEJM 200003023420901

5. Pineda S, Sigdel TK, Liberto JM, Vincenti F, Sirota M, Sarwal MM. Charakterizace rizika rejekce ledvin před transplantací a po transplantaci pomocí sekvenování imunitního repertoáru B buněk.Nat Commun(2019) 10(1):1906. DOI: 10 1038/s41467-019-09930-3

6. Halloran PF, Famulski K, Reeve J. Molekulární fenotypy rejekce v biopsiích transplantovaných ledvin.Curr Opin Orgán Transplantace (2015) 20 (3): 359–67. DOI: 10.1097/MOT.0000000000000193

7. Li L, Khatri P, Sigdel TK, Tran T, Ying L, Vitalone MJ a kol. Diagnostický test periferní krve pro akutní odmítnutí při transplantaci ledvin.jsem JTransplantace(2012) 12(10):2710–8. DOI: 10.1111/j.{7}}.2012. 04253.x

8. Roedder S, Sigdel T, Salomonis N, Hsieh S, Dai H, Bastard O a kol. Krátký test k detekci pacientů po transplantaci ledvin s vysokým rizikem akutní rejekce: výsledky multicentrické studie AART.PloS Med(2014) 11(11): e1001759. DOI: 10.1371/journal.pmed.1001759

9. Naesens M, Khatri P, Li L, Sigdel TK, Vitalone MJ, Chen R, et al. Progresivní histologické poškození renálních aloštěpů je spojeno s expresí genů vrozené a adaptivní imunity.Kidney Int(2011) 80 (12): 1364–76. DOI: 10.1038/ki.2011.245

10. Furness PN, Taub N, Assmann KJM, Ban G, Cosyns JP, Dorman AM, et al. Mezinárodní rozdíly v histologickém gradingu jsou velké a přetrvávající zpětná vazba nezlepšuje reprodukovatelnost.Dopoledne J Surg Pathol (2003) 27 (6): 805–10. doi: 10.1097/00000478-200306000-00012

11. Veronese FV, Manfro RC, Roman FR, Edelweiss MI, Rush DN, Dance S, et al. Reprodukovatelnost Banffovy klasifikace při subklinické rejekci transplantátu ledviny.ClinTransplantace(2005) 19 (4): 518–21. doi: 10.1111/j.{7}}.2005.00377.x

12. Khatri P, Roedder S, Kimura N, De Vusser K, Morgan AA, Gong Y a kol. Společný rejekční modul (CRM) pro akutní rejekci napříč více orgány identifikuje nová terapeutika pro transplantaci orgánů.J Exp Med(2013) 210 (11): 2205–21. doi: 10.1084/jem.20122709

13. Sacreas A, Yang JYC, Vanaudenaerde BM, Sigdel TK, Liberto JM, Damm I a kol. Společný modul rejekce při chronické rejekci po transplantaci plic.PloS One(2018) 13(10):e0205107. doi: 10.1371/ journal.pone.0205107

14. Sigdel TK, Yang JYC, Bestard O, Schroeder A, Hsieh SC, Liberto JM a kol. Skóre CRM (Urinary Common Rejection Module) pro neinvazivní monitorování transplantace ledvin.PloS One(2019) 14(7):e0220052. doi: 10.1371/ journal.pone.0220052

15. Sigdel TK, Bestard O, Tran TQ, Hsieh SC, Roedder S, Damm I a kol. Výpočetní skóre genové exprese pro predikci imunitního poškození u renálních aloštěpů.PloS One(2015) 10(9):e0138133. doi: 10.1371/žurnál. pone.0138133

16. Sigdel T, Nguyen M, Liberto J, Dobi D, Junger H, Vincenti F a kol. Posouzení 19 genů a validace CRM genového panelu pro kvantitativní transkripční analýzu molekulárního odmítnutí a zánětu v archivních biopsiích transplantovaných ledvin.Přední Med (2019) 6:213. doi: 10.3389/ feed.2019.00213

17. Haas M, Loupy A, Lefaucheur C, Roufosse C, Glotz D, Seron D a kol. Zpráva Banff 2017 Kidney Meeting: Revidovaná diagnostická kritéria pro chronickou aktivní rejekci zprostředkovanou T lymfocyty, rejekci zprostředkovanou protilátkami a vyhlídky na integrativní koncové body pro klinické studie nové generace.Am J Transplant(2018) 18(2):293–307. doi: 10.1111/ajt.14625

18. Sigdel TK, Nguyen M, Dobi D, Hsieh SC, Liberto JM, Vincenti F a kol. Cílené transkripční profilování biopsií transplantovaných ledvin.ledvinyIntRep(2018) 3(3):722–31. doi: 10.1016/j.ekir.2018.01.014

19. Bloom RD, Bromberg JS, Poggio ED, Bunnaradist S, Langone AJ, Sood P a kol. Bezbuněčná DNA a aktivní rejekce v aloštěpech ledvin.J Am Soc Nephrol(2017) 28(7):2221–32. doi: 10.1681/ASN.2016091034

20. Lee H, Park YM, We YM, Han DJ, Seo JW, Moon H a kol. Hodnocení digitální PCR jako techniky pro monitorování akutní rejekce při transplantaci ledviny.GenomikaInformovat(2017) 15(1):2–10. doi: 10.5808/ GI.2017.15.1.2

21. Adámek M, Opelz G, Klein K, Morath C, Tran TH. Rychlá a jednoduchá metoda pro detekci a kvantifikaci bezbuněčné DNA pocházející od dárce v séru příjemců transplantátu solidních orgánů jako biomarker pro funkci štěpu.Clin Chem Lab Med(2016) 54 (7): 1147–55. doi: 10,1515/cclm-2015-0622

22. Beck J, Oellerich M, Schulz U, Schauerte V, Reinhard L, Fuchs U a kol. Bezbuněčná DNA odvozená od dárce je nový univerzální biomarker pro rejekci aloštěpu při transplantaci pevných orgánů.Transplant Proc(2015) 47 (8): 2400–3. doi: 10.1016/j.transproceed.2015.08.035

23. Beck J, Bureau S, Balzer S, Andag R, Kanzow P, Schmitz J a kol. Digitální kapénková PCR pro rychlou kvantifikaci dárcovské DNA v oběhu příjemců transplantátu jako potenciální univerzální biomarker poškození štěpu.Clin Chem (2013) 59 (12): 1732–41. doi: 10.1373/clinchem.2013.210328