Markery močového podocytu u onemocnění ledvin

další informace:ali.ma@wecistanche.com

Lingfeng Zeng a kol

Abstraktní

Podocyty hrají důležitou roli při udržování funkce ledvin a mnoho z nich se na ně primárně zaměřujeledvinanemocí. Poškození podocytů vede k vylučování buněčných fragmentů odvozených z podocytů a molekulárních cílů specifických pro podocyty do moči, které mohou sloužit jako biomarkeryledvinanemocí. Intaktní podocyty, buď životaschopné nebo mrtvé, a mikrovezikuly odvozené z podocytů mohly být kvantifikovány v moči různými metodami centrifugace, vizualizace a kultivace. Proteinové cíle specifické pro podocyty z jádra, cytoplazmy, štěrbinové diafragmy, bazální membrány glomerulární kapiláry a cytoskeletu, stejně jako jejich odpovídající messenger RNA (mRNA), v moči, lze kvantifikovat westernovým přenosem, ELISA nebo kvantitativní polymerázou řetězová reakce. Ačkoli některé z těchto technik mohou být v současnosti drahé nebo pracné, mohou se v budoucnu stát široce dostupnými kvůli zlepšení technologie a automatizace. Aplikacemočovýpodocytmarkery pro diagnostiku a sledování různýchledvinanemocíbyla prozkoumána, ale publikované údaje v této oblasti nejsou dostatečně systematické a postrádají externí validaci. Další výzkum by se měl zaměřit na standardizaci, porovnávání a automatizaci laboratorních metod a také na definování jejich přidané hodnoty k rutinním klinickým testům.

klíčová slova:Podocyt, Biomarker, mRNA, miRNA, Nefrin, Podocin, Podokalyxin, Synaptopodin,Chronickýledvinachoroba

Cistanche stonek může léčit chronické onemocnění ledvin

1. Úvod

1.1. Epidemiologie chronického onemocnění ledvin

Chronickýledvinachoroba(CKD) je důležité a nákladné neinfekční onemocnění [1]. S dostupností renální substituční terapie jsou výdaje na zdravotní péči vynaložené na léčbu CKD (Chronickýledvinachoroba)prudce vzrostl po 60. letech [2,3]. V roce 2015 bylo celosvětově více než 2,5 milionu pacientů léčených substituční terapií ledvin a předpokládá se, že tento počet se do roku 2030 zdvojnásobí [4]. Účinné prostředky pro diagnostiku, léčbu a sledováníledvinachorobajsou velmi potřebné.

1.2. Podocyt jako ohnisko onemocnění ledvin

Primární funkcí ledvin je vylučování metabolických odpadů a nadměrné tělesné vody [5], čehož je dosaženo třemi procesy: (1) filtrací cirkulující krve přes glomerulus za vzniku ultrafiltrátu v Bowmanově prostoru; (2) selektivní reabsorpce užitečných látek ledvinovým tubulem; a (3) selektivní sekrece dalších metabolických odpadů z peritubulární kapiláry do tubulární tekutiny [6]

Přestože ledvina sestává z několika typů buněk, které jsou uspořádány do jemné 3-dimenzionální architektury, podocyty hrají klíčovou roli při udržování normální funkce ledvin a jsou primárním cílem mnohaledvinanemocí. Podocyty jsou vysoce specifické terminálně diferencované buňky, které spolu s endoteliálními buňkami a glomerulární kapilární bazální membránou (GCBM) tvoří glomerulární filtrační bariéru [7]. Podocyty mají objemné buněčné tělo, které je od GCBM odděleno subpodocytovým prostorem [8]. Buněčné tělo dává vzniknout dlouhým primárním procesům, které se rozšiřují směrem k GCBM a jsou k němu připojeny rozsáhlou řadou procesů chodidel [8].

Podocyty mají několik fyziologických funkcí. Udržují morfologii glomerulární vaskulární smyčky, regulují glomerulární filtraci a podílejí se na lokální imunologické a zánětlivé odpovědi. Kromě toho jsou podocyty částečně zodpovědné za syntézu a obrat GCBM [9], stejně jako za produkci parakrinních faktorů, jako je vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF), který je důležitý v regulaci permeability a proliferace endoteliálních buněk. [10]. Dysfunkce podocytů hraje klíčovou roli v patogenezi a progresi mnohaledvinanemocí. Výsledkem jsou mutace různých genů souvisejících s podocytyledvinanemocí, který se typicky klinicky projevuje jako steroid-rezistentní nefrotický syndrom a histologicky jako fokální glomeruloskleróza (FGS). Na druhé straně získané dysfunkce podocytů, včetně snížení počtu nebo hustoty podocytů a fúze výběžků podocytové nohy, vedou různými mechanismy k sekundárnímu poškození endotelu a GCBM, ztrátě negativního náboje GCBM, abnormalitě hiátového membránového proteinu a nakonec proteinurii [ 11,12].

Charakteristickým důsledkem poškození podocytů je oslabená interakce s GCBM, která se kumulovala v oddělení podocytů od GCBM. Vzhledem k tomu, že podocyty mají omezenou kapacitu pro regeneraci a funkční kompenzaci, zbývající podocyty nejsou schopny udržet mechanické a nábojové bariérové ​​funkce GCBM, které by byly nevratně poškozeny, a konečným výsledkem je proteinurie [13]. V závislosti na závažnosti poškození může poškození podocytů vést ke ztrátě výběžků nohou, tvorbě vakuol a pseudocyst, dediferenciaci a apoptóze. Následně by byly postiženy sousední struktury, včetně proliferace parietálních epiteliálních buněk, smrštění GCBM, ztráty glomerulárního kapilárního tufu a nakonec glomerulosklerózy [14].

1.3. Metoda literární rešerše

Provedli jsme přehled literatury s hledanými výrazy včetně „podocytů“, „podocytů asociovaných molekul“ nebo „biomarkerů“ spolu s „chronickýledvinachoroba", "akutní poškození ledvin"glomerulonefritida", "diabetická nefropatie" nebo "diabetická".ledvinachoroba", byly použity k prohledávání relevantní literatury z Medline, Embase a Cochrane Library. Odkazy na relevantní publikace byly zkoumány pro další potenciální články. Vhodné studie zahrnovaly studie na lidech a zvířatech publikované před červencem 2020. Publikace s irelevantními tématy, jako je biologie buněk podocytů, membránová fyziologie a molekulární manipulace s podocyty byly vyloučeny.

1.4. Cíle specifické pro podocyty jako biomarkery

Poškození podocytů vede k uvolňování různých molekul odvozených z podocytů do močového prostoru a může sloužit jako biomarkerledvinanemocí(Obr. 1). Těla podocytů by mohla být rozdělena do tří anatomicky a funkčně odlišných kompartmentů: základní část, horní část a část s posuvnou diafragmou (SD) [15]. V každé části jsou přítomny specifické proteiny buněčné membrány a jejich interakce se systémem cytoplazmatického cytoskeletu je zodpovědná za stabilitu struktury a funkce podocytů [16]. Hlavní molekuly odvozené z podocytů, které jsou potenciálními cíli pro vývoj biomarkerů, jsou shrnuty v tabulce 1.

Obr. 1. Poškození podocytů a potenciální markery odvozené z podocytů v moči. Poranění podocytů má za následek 3 vzájemně související patologické procesy: morfologické změny, apoptózu a odchlípení. Podocyty mohou zůstat životaschopné, ale projevují se jako morfologické změny, které mají funkční následné důsledky, jako je proteinurie a tubulointersticiální fibróza. Apoptóza podocytů se může vyvinout jako výsledek kumulovaných morfologických změn nebo přímo ze specifických inzultů. Ztráta podocytů v glomerulech (tj. podocytopenie) vede k architektonickým změnám v glomerulární kapilární kličce a má za následek glomerulosklerózu. Podocyty, apoptotické nebo životaschopné v důsledku ztráty 3 1 integrinu, se mohou oddělit do močového prostoru, být identifikovány v moči a slouží jako markeryledvinachoroba. Vezikuly, mikročástice nebo molekuly specifické pro podocyty pocházející z poškozených nebo apoptotických podocytů mohou být také detekovány v moči a slouží jako biomarkery. (GCBM, glomerulární kapilární bazální membrána; AgII, angiotenzin II; TGF-, transformující růstový faktor-beta; ROS, reaktivní formy kyslíku).

1.5. Jaderné a cytoplazmatické cíle

Wilmsův tumor supresorový gen-1 (WT1) je transkripční faktor podobný zinkovému prstu v jádře podocytu a je pravděpodobně nejběžněji používaným podocytově specifickým markerem pro histologické studie [17]. Gen WT1 se skládá z 10 exonů, z nichž 7 až 10 kóduje 4 zinkové prsty domény vázající DNA. WT1 je specificky exprimován v podocytech a pravděpodobně reguluje expresi nefrinu [18]. Heterozygotní mutace v exonech 8 a 9 genu WT1 vedou k Denys-Drashově syndromu, který se projevuje nefrotickým syndromem, mužským pseudohermafroditismem a Wilmsovým tumorem [19].

Jiné jaderné a cytoplazmatické proteiny podocytů jsou jako biomarkery méně studovány. Kináza obsahující doménu aarF-4 (ADCK4) je specificky přítomna v mitochondriích ve výběžcích nohou potkaních podocytů [20]. ADCK4 je zodpovědný za stabilizaci komplexu CoQ a je nezbytný pro normální funkci homeostázy podocytů [20]. Podocytově specifická ablace ADCK4 u myší má za následek vymazání výběžku chodidla, dezorganizaci filtrační štěrbiny, zvětšené a dysfunkční mitochondrie a snížení CoQ10 [21] a léčba obnovila CoQ10, mitochondriální funkci, zlepšila morfologii podocytů a zabránila vymazání výběžků chodidla [21] ,22].

1.6. Proteinový komplex štěrbiny a bránice

Proteinové složky štěrbinové diafragmy podocytů byly rozsáhle studovány jako biomarkeryledvinanemocí. Mezi hlavní proteiny v této skupině patří nefrin, podocin, CD2-asociovaný protein (CD2AP) a podoplanin [23]. Nefrin je transmembránový protein s extracelulárními doménami, které tvoří jádro štěrbinové bránice. Funguje jako fyzická sítová bariéra i jako signalizační lešení [24]. Mutace genu pro nefrin byly první hlášenou příčinou kongenitálního nefrotického syndromu u lidí [25]. Podocin a CD2AP jsou zodpovědné za spojení nefrinu s aktinovým cytoskeletem pod buněčnou membránou. Podocin je vlásenkový protein z rodiny stomatinů a je exprimován výhradně v podocytech [26]. Je kódován genem NPHS2, který se skládá z osmi exonů a nachází se na chromozomu 1q25-q31 oblasti [27]. Mutace genu NPHS2 způsobují autozomálně recesivní steroid-rezistentní nefrotický syndrom u dětských i dospělých pacientů [27,28]. CD2AP je molekula lešení, která přímo interaguje s filamentózním aktinem a dalšími proteiny buněčné membrány a podílí se na dynamické remodelaci aktinu a transportu membrán [29]. Podoplanin je malý transmembránový glykoprotein s velkým počtem O-glykosidových řetězců. Selektivní ztráta podoplaninu v podocytech vede k proteinurii s následnými změnami v morfologii podocytů na potkaním modelu spontánní proteinurie [30].

Cistance je dobrý pro ledviny

1.7. Cíle spojené s GCBM

Hlavní proteinové složky bazální oblasti podocytů jsou 3 1 integrin a -dystroglykan (-DG). Tyto proteiny ukotvují podocyty ke GCBM a hrají důležitou roli při udržování správné polohy podocytu a také integrity filtrační membrány [31,32]. Integrin 3 1 je transmembránový protein s extracelulární doménou spojenou s doménou podobnou lamininu G (LG) lamininu 521 v GCBM, zatímco jeho cytoplazmatická oblast je spojena s cytoskeletem podocytů pomocí -aktininu{{ 9}}. Glykosylovaný protein -DG je připojen k cytoskeletu prostřednictvím utrofinu a k podocytu a GCBM prostřednictvím jeho interakce s lamininem 521.

1.8. Cíle na horní membráně

Podokalyxin je hlavní transmembránový protein na apikální straně podocytu. Je to negativně nabitý protein kyseliny sialové, který přispívá k nábojové bariéře glomerulární filtrace [33]. Podokalyxin má tři funkce: (1) zabránit pronikání negativně nabitého proteinu do moči; (2) k udržení separace sousedních podocytů; a (3) zabránit adhezi mezi epiteliálními buňkami a kapilárními kličkami [34]. Podokalyxin je spojen s aktinovým cytoskeletem ezrinem a regulačním faktorem 2 sodík-protonměniče (NHERF2).

1.9. Cíle související s aktinem

Řada proteinů specifických pro podocyty je spojena s aktinovým cytoskeletem a udržuje 3-rozměrnou strukturu podocytu. Nejlépe prozkoumanými cíli této skupiny jsou synaptopodin a -aktinin-4. Oba se vážou na aktinový skelet interakcí s membránově asociovanou guanylátkinázou s obrácenou orientací-1 (MAGI-1) [35]. Synaptopodin je lineární protein bohatý na prolin kódovaný genem SYNPO [36] a je exprimován v diferencujících se podocytech, když se u nich vyvinou výběžky nohy. V důsledku toho je synaptopodin považován za marker zralých podocytů [37].

2. Metody studia

2.1. Intraglomerulární podocytové markery

Přestože se tato recenze zaměřuje namočovýpodocytmarkerů, je logické krátce pojednat o detekci těchto markerů v ledvinové tkáni. Deplece podocytů může být absolutní (úbytek podocytů) nebo relativní (snížený počet podocytů na objem glomerulu) [38]. Zlatým standardem metody kvantifikace podocytů v ledvinách jsou stereologické metodiky (světelné nebo elektronové mikroskopy, konfokální laserové skenovací mikroskopy, ultrazvuk, počítačová tomografie nebo magnetická rezonance) [39]. Všechny jsou však časově a pracovně náročné. Nedávno Venkatareddy a spol. hodnotili metodu odhadu hustoty podocytů pomocí jednotlivých řezů fixovaných formalínem zalitých do parafínu, ve kterých byla jádra podocytů vizualizována nepřímou imunofluorescencí s protilátkami proti WT1 nebo transducin-like enhancer of split [40]. Následná studie ukázala, že tato metoda poskytla přesné vyčíslení podocytů v modelu selektivní deplece podocytů u transgenních myší, což potvrdilo, že tento přístup poskytuje účinný kvantitativní nástroj pro analýzu deplece podocytů v celých glomerulech [41]. Tato metoda však stále vyžaduje biopsii ledviny, a proto není vhodná pro sériové sledování.

2.2. Kvantifikace a kultivace podocytů v moči

Vzhledem k tomu, že podocyty jsou fixovány do své fyziologické polohy pouze výběžky nohou, jsou náchylné ke ztrátě jako životaschopných buněk v moči [42]. Ve skutečnosti jsou intaktní podocyty zjistitelné v moči zdravých lidí a pacientů sledvinanemocí[43] a ztráta moči je pravděpodobně hlavním mechanismem deplece podocytů během progrese CKD(Chronickýledvinachoroba)[42]. Tradiční metoda identifikace podocytů v moči zahrnuje cytospinové techniky a imunofluorescenční studii se specifickými protilátkami proti podokalyxinu [44], u kterých je částečně možná automatizace. Tato technika má však omezenou senzitivitu a specificitu kvůli kontaminaci buněčného odpadu v močovém sedimentu.

Alternativně mohou být podocyty identifikovány detekcí tryptických peptidů specifických pro podocyty kapalinovou chromatografií spojenou s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS). Přestože náklady na vybavení této techniky jsou vysoké, má výhody nezávislosti na operátorovi a vysoké reprodukovatelnosti [45] a pravděpodobně bude mít rostoucí použitelnost v klinické laboratorní praxi.

Předchozí studie ukázaly, že pomocí cytospinové imunofluorescenční techniky vylučují zdraví lidé méně než 0,5 podocytů/mg kreatininu, zatímco pacienti s aktivním glomerulárním onemocněním vylučují až 400 podocytů/mg kreatininu [43]. Většinamočovýpodocytyjsou životaschopné při testování s vyloučením propidium jodidu a barvením TUNEL [43]. Teoreticky by tedy kultivace životaschopných podocytů ex vivo zlepšila specificitu identifikace podocytů odstraněním mrtvých a nespecifických buněk. Podocyty však normálně neproliferují in vivo a pro jejich kultivaci ex vivo jsou nutné speciální experimentální podmínky [46]. Předchozí zprávy ukázaly, že podocyty mohly být nejprve pěstovány za růstově permisivních podmínek, kde se replikují imortalizované podocyty [46]. Buněčné kultivační médium pro tento účel obecně sestává z Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 nebo Dulbeccova modifikovaného Eagleova média s 10 procenty fetálního bovinního séra doplněného 20–100 U/ml myšího interferonu-gama (INF-) a kultivační misky jsou obvykle potaženy kolagenem typu I, aby se podpořila proliferace podocytů [46]. Tato metoda má velkou hodnotu v translační studii a identifikaci terapeutického cíle, ale je příliš komplikovaná pro rutinní klinické použití.

Cistanche může zlepšit funkci ledvin

2.3. Fragmenty pocházející z močového podocytu

Extracelulární vezikuly (EV) jsou sférická membránová tělíska uvolňovaná různými typy buněk [47]. V močovém systému jsou EV obsahující apikální membránu a intracelulární tekutinu vylučovány ze všech segmentů nefronů, včetně podocytů, renálních tubulárních epiteliálních buněk a uroepiteliálních buněk do moči. Močové EV obsahují proteinové markery dysfunkce a strukturálního poškození ledviny. Nedávné studie dále naznačují, že EV mohou být relevantní pro mezibuněčnou komunikaci [48]. Kromě toho předchozí studie také ukázaly, že fragmenty apikálních buněčných membrán se vylučují z poraněných podocytů do moči [49] a lze je elektronovou mikroskopií identifikovat jako podokalyxin-pozitivní granulární struktury (PPGS) [49]. V modelech diabetických myší mohly být močové exosomy z podocytů izolovány sériovou centrifugací a mikročástice mohly být kvantifikovány průtokovou cytometrií s použitím protilátky annexinu V (která detekuje všechny mikročástice) a následně protilátky proti podokalyxinu nebo podoplaninu (které specificky identifikují mikročástice odvozené z podocytů). [50,51]. Další analýza rozptylu světla by mohla být použita k dalšímu určení velikosti mikročástic [52]. Pomocí těchto sofistikovaných technik bylo prokázáno, že mikročástice odvozené z podocytů jsou zvýšeny u myší po expozici vysoké hladině glukózy [51], stejně jako u diabetických myší před nástupem albuminurie [52]. V prvním případě byla abnormalita potlačena inhibitorem Rho-kinázy, což naznačuje, že reorganizace cytoskeletu je hlavním spouštěčem uvolňování mikročástic [51]. Nicméně aplikace těchto technik na člověkaledvinachorobanebyl prozkoumán.

Spíše než měření počtu a velikosti EV a mikročástic pocházejících z podocytů v moči v poslední době vzrůstá zájem o měření molekul specifických pro podocyty v močových exozomech. Například signální transdukční faktory odvozené od podocytů (PDSTF) v močových EV byly navrženy jako potenciální kandidáti pro hodnocení poškození podocytů [52]. Jejich klinické aplikace však zůstávají ve vývoji.

2.4. Cíle proteinů specifické pro močové podocyty

Hladiny několika proteinových cílů specifických pro podocyty v moči jsou snadno měřeny a jejich role jako biomarkerůledvinachorobabyl studován. Hladinu podokalyxinu v moči lze měřit nepřímou imunofluorescencí, ELISA nebo průtokovou cytometrií [53] a byla navržena jako marker promočovýpodocytpočet. Předchozí studie však ukázala, že močový podokalyxin většinou pocházel z apikální membrány poraněných podocytů spíše než z intaktních podocytů rozřezaných do moči a jeho hladina je zvýšená u časného poškození ledvin [49]. Podokalyxin a nefrin, další důležitý proteinový cíl specifický pro podocyty v moči, nejsou detekovatelné v moči zdravých lidí tradičním Western blottingem [54], ale jsou detekovatelné konvenční ELISA u pacientů s preeklampsií [55]. Kromě toho hladina nefrinu v moči koreluje se závažností proteinurie [56] a funkcí ledvin [57]. Plazmatická hladina nefrinu mohla být také měřena [57], ale její biologický nebo klinický význam nebyl stanoven. Hlavním problémem použití hladin proteinů specifických pro podocyty v moči jako klinického biomarkeru je nízká koncentrace (obvykle v rozmezí ng/ml) a matoucí účinek koncentrace-ředění moči.

2.5. mRNA specifické pro močové podocyty

MěřenímočovýpodocytJako alternativní metoda pro stanovení počtu podocytů v moči byla navržena specifická hladina mRNA. Množství mRNA specifické pro podocyty v moči obvykle není dostatečné pro tradiční studii Northern blot, ale lze jej snadno měřit kvantitativní polymerázovou řetězovou reakcí v reálném čase (RT-QPCR). Dvě předchozí studie ukázaly, že hladiny mRNA nefrinu v moči úzce korelovaly s počtem podocytů v moči [56,58]. Na myším modelu antiglomerulárního onemocnění bazální membrány se sériovou biopsií ledvinmočovýpodocyt-specifické hladiny mRNA korelovaly s rychlostí ztráty glomerulárních podocytů [52].

Nedávné studie však přesunuly zaměření na odvozené indexy mRNA v moči jako náhradní markery stresu podocytů nebo relativního poškození podocytů. Na potkaním modelu bylo progresivní glomerulární onemocnění spojeno se snížením hladiny nefrinu ve srovnání s hladinami mRNA podocinu a poměr mRNA podocinu k nefrinu v moči koreloval se závažností histologické progrese [59]. V následné studii se ukázalo, že průměrný arteriální tlak zdravých lidí koreluje s poměrem mRNA podocinu ke kreatininu v moči (marker oddělení podocytů), poměrem mRNA podocinu k nefrinu (marker stresu podocytů) a podocinem v moči. poměr -k-aquaporin-2 mRNA (marker relativního poškození podocytů versus tubulárního poškození) [60]. Glomerulární poškození je specificky spojeno se zvýšenými poměry mRNA podocin-aquaporin-2 a nefrin-k-aquaporin-2 v moči [61].

2.6. Urinární miRNA markery specifické pro podocyty

Mikro-RNA (miRNA) jsou krátké nekódující RNA, které regulují mnoho biologických drah zacílením na specifické mRNA [62]. Podobně jako mRNA se miRNA z moči snadno kvantifikuje pomocí RT-qPCR [63]. Z pohledu vývoje biomarkerů má miRNA výhodu v odolnosti vůči degradaci, což usnadňuje její klinické použití i studium archivních vzorků [63]. Byla pozorována řada specifických změn miRNAledvinanemocí[9]. Bylo například zjištěno, že podocytově specifická ztráta funkčních miRNA, včetně miR-23b, miR-24 a miR{4}}a, vede k rychlému glomerulárnímu a tubulárnímu poškození [64]. Konkrétně miR-27b reguluje přežití podocytů prostřednictvím cílení na adenosinový receptor 2B [65]. Podobně bylo hlášeno, že hladiny miR-21, miR-124 a miR{11}} v moči korelují se závažností dysfunkce ledvin (albuminurie a odhadovaná GFR) amočovýpodocytmarkery (nefrin, synaptopodin a podokalyxin) u diabetických pacientů [66]. Nedávné studie dále identifikovaly specifické downstream cesty pro několik miRNA, které mohou být relevantní pro patogenezi nebo progresiledvinanemocí. Zejména miR{0}}a potlačuje expresi WT- 1, která ovlivňuje diferenciaci podocytů [67] a může hrát roli v patogenezi glomerulárního onemocnění [68]. Na druhou stranu miR-21 inhibuje expresi tkáňového inhibitoru metaloproteinázy 3 (TIMP3) [69,70], miR-26a inhibuje transformující růstový faktor beta-1 (TGF{{ 11}}) exprese [71,72], miR-23b cílí na Ras GTPázu aktivující protein SH3 doménu vázající protein 2 (G3BP2) [73], miR-29}c cílí na Sprouty homolog 1 (Spry1 ) [74]; z nichž všechny se podílejí na progresi diabetické nefropatie.

Cistanche pro zlepšení funkce ledvin

Podocyt se však podílí pouze na malé části močové miRNA. Jakékoli specifické změny miRNA pozorované v podocytech nemusí být v moči snadno rozpoznatelné, zatímco jakákoli změna v hladinách miRNA v moči může odrážet patologické změny v jiných typech renálních buněk [75,76]. Například i když se hladiny miR-155, miR-663 a miR-1915 v moči významně liší mezi pacienty s FGS nebo nefropatií s minimálními změnami (MCN) a zdravými kontrolami [77], nebylo prokázáno, že miR-155, miR-663 nebo miR-1915 specificky pocházejí z podocytů. Významné korelace mezi mnoha hladinami miRNA a markery tubulárního poškození, včetně hladin N-acetyl- -D-glukosaminidázy (NAG) a molekuly poškození ledvin-1 (KIM-1) v moči [66], byly také hlášeny. Jinými slovy, je obtížné potvrdit jejich specificitu jako markerů poškození podocytů. Pozoruhodnou výjimkou z tohoto pravidla je miR{15}}a. Nedávná studie ukázala, že hladiny exosomálního miR-26a v moči byly významně vyšší u lupusové nefritidy než u zdravé kontroly, miR{17}}a byla nejhojněji exprimovaná miRNA v glomerulu normální myši C57BL/6 a miR-26a byla zodpovědná za regulaci diferenciace podocytů a integrity cytoskeletu [78]. Úlohu močového miR-26a jako markeru specifického pro podocyty je však třeba ověřit.

2.7. Cirkulující podocytové markery

Mnohé z výše uvedených podocytových markerů, zejména proteinové cíle a mRNA specifické pro podocyty, lze měřit v systémové cirkulaci [56,79,80] a jejich plazmatické hladiny jako biomarkerledvinanemocíbyly prozkoumány [55,81–84]. Úplná diskuse na toto téma však přesahuje rámec této recenze. Klíčové výhody a nevýhody výše uvedených metodik shrnuje tabulka 2.

3. Močové podocytární markery u specifických onemocnění ledvin

3.1. Diabetické onemocnění ledvin

Diabetikledvinachoroba(DKD) je nejčastější příčinou CKD(Chronickýledvinachoroba)po celém světě a existuje velké množství literatury o použití různýchmočovýpodocytmarkery pro diagnostiku a sledování DKD. Například Jim et al [14] uvedli, že hladiny nefrinu v moči byly detekovatelné u všech pacientů s DKD s albuminurií, ale pouze 54 procent u pacientů bez albuminurie. Hladiny nefrinu v moči korelovaly s úrovní albuminurie a naopak s funkcí ledvin [14]. Ma et al uvedli, že hladina angiopoetinu podobného-4 (Angptl4) v moči byla u DKD zvýšená [85]. Hladina podokalyxinu v moči byla zvýšena u diabetických pacientů před nástupem mikroalbuminurie a byla pravděpodobně citlivější než mikroalbuminurie pro časnou detekci DKD [86]. U prokázané DKD hladina podokalyxinu v moči pozitivně korelovala s hladinou HbA1c a poměrem albuminu ke kreatininu [87,88]. Celkově dostupné výsledky naznačují, že hladiny několika podocytově specifických cílů v moči jsou časnými indikátory DKD a hladina podokalyxinu v moči je v tomto ohledu nejslibnějším markerem [54].

Byly také zkoumány hladiny cíle specifického pro podocyty v jednotlivých složkách moči.Močovépodocythladiny mikročástic, stanovené průtokovou cytometrií, byly vyšší u diabetu 1. typu než u zdravých kontrol a hladina se dále zvyšovala s hyperglykemickým clampem [89]. Hladiny exosomální WT-1 v moči korelovaly se závažností proteinurie, funkcí ledvin, glomerulárním poškozením a rychlostí poklesu funkce ledvin u diabetických pacientů [58,90]. V jiné studii byly hladiny glykogensyntázy kinázy (GSK)3 v močových exfoliovaných buňkách přesnější než albuminurie u rozlišujících diabetických pacientů s progresivní poruchou ledvin a bez ní [91]. Metodika tohoto testu je však těžkopádná a nemusí být použitelná v běžné klinické praxi.

Pokud jde o markery mRNA specifické pro podocyty v moči, předchozí studie ukázala, že hladiny mRNA nefrinu, podocinu, synaptopodinu, WT-1 a -aktinu-4 v moči byly vyšší u pacientů s DKD než u normálních kontrol [92]. U diabetických pacientů s různou závažností albuminurie byl signifikantní rozdíl v hladinách mRNA nefrinu, podocinu, -aktininu-4 a CD{7}}asociovaného proteinu v moči [93]. Hladiny mRNA nefrinu, podocinu, synaptopodinu, WT-1 a -aktinu-4 v moči také korelovaly smočovýpodocytpočet, hladina nefrinu v moči, albuminurie a závažnost renálního poškození [93]. Nedávno bylo zjištěno, že hladiny mRNA specifické pro podocyty v moči předcházely nástupu mikroalbuminurie u pacientů s diabetem 2. typu [94] a poměr mRNA a kreatininu močového podocinu, markeru odloučení podocytů, významně koreloval s následnou mírou pokles funkce ledvin [94]. Kromě toho hladina mRNA synaptopodinu v moči byla nižší po 12 týdnech kombinované terapie inhibitorem angiotenzin-konvertujícího enzymu (ACE) a blokátorem receptoru pro angiotenzin (ARB) ve srovnání s monoterapií inhibitorem ACE [95]. Souhrnně dostupné důkazy naznačují, že měření hladin mRNA specifické pro podocyty v moči může být cenné pro stratifikaci rizika a monitorování terapeutické odpovědi u DKD.

3.2. Minimální změna u nefropatie a fokální glomerulosklerózy

MCN a FGS jsou často považovány za onemocnění podocytů a jejich rolemočovýpodocytcíle byly testovány. Zhou a kol. [96] uvedli, že hladina exosomálního WT-1 v moči, měřená technikou imunoblotování, byla významně vyšší u pacientů s FGS než u pacientů s nefrotickým syndromem citlivým na steroidy (SSNS) nebo u zdravých dobrovolníků. Hladiny exosomálního WT-1 v moči významně poklesly po léčbě kortikosteroidy a remisi FGS nebo SSNS [96]. V jiné studii byla hladina nefrinu v moči, měřená konvenčním testem ELISA, významně vyšší u dospělých s FGS než u jiných příčin nefrotického syndromu [97].

Rovněž byly studovány hladiny podocytově specifické mRNA v moči. Časná studie ukázala, že hladiny mRNA nefrinu a podocinu v moči se významně nelišily mezi pacienty s MCN a zdravými dobrovolníky a jejich hladiny byly významně nižší než u pacientů s DKD [98]. Následná studie ukázala, že hladiny mRNA nefrinu a podocinu v moči byly nižší u pacientů s MCN než u FGS nebo zdravých kontrol a velikost snížení korelovala se stupněm proteinurie [99]. V této studii bylo zjištěno, že hladiny mRNA synaptopodinu v moči korelují s následnou mírou poklesu renálních funkcí u pacientů s FGS [99], což naznačuje, že v moči lze identifikovat kvalitativní změnu v podocytech FGS.

3.3. Membranózní nefropatie

Přestože hlavní patologickou změnou membranózní nefropatie (MGN) je ukládání imunitního komplexu v subepiteliálním prostoru, což má za následek změnu bariéry glomerulární filtrace, studie omočovýpodocytmarkerů v MGN je málo. Hladiny mRNA nefrinu, podocinu a synaptopodinu v močovém sedimentu byly u MGN významně zvýšené, ale hladiny MGN spolehlivě odlišily od jiných příčin nefrotického syndromu [98]. Nedávno Lu et al [100] uvedli, že početmočovýpodocyt-odvozené mikročástice se snížily současně se zlepšením klinických parametrů po imunosupresivní léčbě, což naznačuje roli při monitorování MGN.

3.4. IgA nefropatie

I když je imunoglobulinová nefropatie (IgAN) primárně mezangiálním onemocněním, rolimočovýpodocytpočítat jako biomarker byl prozkoumán. Shen et al [101] zjistili, že u pacientů s IgAN došlo ve vzorcích biopsie ledviny ke zvýšené ztrátě podocytů močí, menšímu počtu podocytů v glomerulech a závažnější fúzi výběžků nohou. V této studii byly podocyty v moči identifikovány nepřímou imunofluorescenční studií podokalyxinu amočovýpodocytpočet koreloval se sérovým kreatininem a proteinurií [101]. Následná studie ukázala, že počet podocytů v moči u pacientů s IgAN se segmentální sklerózou byl vyšší než u pacientů bez segmentální sklerózy [102]. U dětí s IgAN nebo Henoch-Sch¨ online purpurovou nefritidou Hara et al [103] prokázali, že kumulativní ztráta podocytů v moči koreluje se závažností histologického poškození a stupněm glomerulosklerózy při biopsii ledvin au pacientů s přetrvávajícímočovýpodocytvylučování mělo rychlou histologickou progresi.

Studie podocytově specifických molekul v moči jako biomarkerů IgAN jsou fragmentované a neúplné. Hladina podokalyxinu v moči významně korelovala se závažností akutních extrakapilárních lézí u dospělých IgAN [102]. Uvádí se, že hladina mRNA podocinu v moči odráží závažnost aktivního glomerulárního poškození při biopsii ledvin a poskytuje prognostické informace doplňující hladinu proteinurie [104]. Vzhledem k tomu, že IgAN je nejběžnější primární glomerulonefritidou na celém světě, je v této oblasti jistě zapotřebí více studií.

Kromě IgAN hraje rolimočovýpodocytmarkery byly zkoumány u jiných mesangiálních glomerulopatií. Například,močovýpodocytztráty jsou výrazně zvýšené jak u dědičných, tak u získaných forem difuzní mezangiální sklerózy [102]. Tato oblast je však hůře prozkoumána, pravděpodobně kvůli heterogenitě v její patologické klasifikaci.

3.5. Lupusová nefritida

Močovépodocytbylo studováno vylučování u lupusové nefritidy. Předchozí zpráva ukázala, že hlavní zmočovýpodocytyu pacientů s aktivní lupusovou nefritidou byly životaschopné, ale dediferencované a podíl apoptotických podocytů v moči byl významně nižší než u zdravých kontrol [105]. V této studii byly hladiny podokalyxinu, synaptopodinu, podocinu, nefrinu a WT-1 v moči (měřeno metodou Western blotting) významně zvýšeny u systémového lupusu, zejména u aktivní lupusové nefritidy, a jejich hladiny významně korelovaly se závažností proteinurie a histologické aktivity [105]. Následná studie dále uvádí, že hladiny mRNA nefrinu, podocinu a synaptopodinu v moči byly významně vyšší u pacientů s aktivní lupusovou nefritidou než u klidového lupusu [106]. Konkrétně hladina mRNA nefrinu v moči korelovala s proteinurií a aktivitou systémového onemocnění, ale ne s histologickou třídou lupusové nefritidy, zatímco hladina mRNA podocinu v moči byla nezávislým prediktorem následného poklesu renálních funkcí [107].

3.6. Vaskulitida spojená s anti-neutrofilními cytoplazmatickými protilátkami (ANCA).

Ačkoli podocyty nejsou primárním cílem poškození ledvin u ANCA-asociované glomerulonefritidy, intraglomerulární hustota podocytů je charakteristicky snížena [108]. Zou et al [108] zjistili, že míra oddělení podocytů do moči předpovídá následnou ztrátu funkce ledvin u glomerulonefritidy spojené s ANCA, a Minakawa et al [109] uvedli, že poměr mRNA podocinu k nefrinu v moči, náhradní marker intraglomerulárních podocytů napětí, korelovalo s procentem tvorby srpku [109]. V poslední studii byli pacienti s vysokými hladinamimočovýpodocytmRNA odvozená od mRNA měla příznivý renální výsledek, pravděpodobně kvůli lepší glomerulární rezervě podocytů a potenciálu reverzibility [109].

3.7. Ostatní CKD

Užitečnostmočovýpodocytmarkery v konkrétníchledvinanemocíje shrnuta v tabulce 3. Řada markerů specifických pro podocyty v moči byla také zkoumána jako generické markery CKD(Chronickýledvinachoroba). Například,močovýpodocyt-extracelulární mikrovezikuly, kvantifikované průtokovou cytometrií, byly významně zvýšeny u pacientů s hypertenzí s poruchou funkce ledvin než u pacientů bez poškození ledvin [110]. Hladina synaptopodinu v moči, jak byla stanovena metodou Western blotting, korelovala s funkcí ledvin u diabetického i nediabetického CKD(Chronickýledvinachoroba)bez ohledu na stupeň albuminurie, což naznačuje, že synaptopodin v moči je generickým markerem poškození podocytů [110]. Mezi panelem podocytově specifických urinárních mRNA cílů měla hladina mRNA neurotrofického faktoru derivovaného z mozku (BDNF) nejlepší korelaci s molekulou močového poškození ledvin-1 (KIM-1), což je generický marker poškození ledvin [111]. U miRNA cílů byly hladiny exosomálního miR-21 v moči zvýšeny na zvířecích modelech poškození podocytů a také CKD(Chronickýledvinachoroba)pacientů [112], ale buněčný původ miR-21 nebyl v této studii stanoven.

Je však důležité poznamenat, že ne všechnyledvinanemocímají poranění podocytů. Zvýšení vmočovýpodocytztráta byla hlášena u různých glomerulárních onemocnění, ale ne u autozomálně dominantních polycystickýchledvinachoroba(ADPKD) [113]. Ještě důležitější je, že souvislost mezi podocyturií a proteinurií se mezi různými glomerulárními onemocněními výrazně lišila, což naznačuje, žemočovýpodocytmarkery by měly být lépe považovány za specifické pro onemocnění [113].

4. Závěr

Poranění podocytů hraje důležitou roli v patogenezi a progresi mnohaledvinanemocí. Buněčné fragmenty odvozené z podocytů a molekulární cíle specifické pro podocyty v moči mají velký potenciál být vyvinuty jako biomarkery pro diagnostiku a monitorováníledvinanemocí. Proces vývoje biomarkerů zahrnuje identifikaci specifických markerů, stanovení metodiky měření a rozhodnutí o klinickém kontextu pro aplikaci (obr. 2). S pokrokem v našem chápání biologie podocytů a dostupností nových technologií,močovýpodocytOčekává se, že markery budou mít rozšiřující se rozsah použití, a to jak kvůli identifikaci nových cílů, tak kvůli vývoji nových metod pro jejich kvantifikaci. Na oplátku může validace markerů podocytů v moči vrhnout světlo na naše chápání patofyziologieledvinanemocí. Existuje velké množství metod pro kvantifikaci podocytů a různých podocytově specifických markerů v moči. V nadcházejícím desetiletí by se výzkumné úsilí mělo zaměřit na standardizaci, porovnávání a automatizaci laboratorních metod a také na definování jejich přidané hodnoty k rutinním klinickým testům.

Obr. 2. Aspekty, které je třeba vzít v úvahu při vývoji biomarkerů souvisejících s močovými podocyty proledvinanemocí. (GCBM, glomerulární kapilární bazální membrána; CKD,chronickýledvinachoroba; DKD, diabetikledvinachoroba; FGS, fokální glomeruloskleróza).

Prohlášení o konkurenčním zájmu

Autoři prohlašují, že nemají žádné známé konkurenční finanční zájmy nebo osobní vztahy, které by se mohly zdát ovlivnit práci uvedenou v tomto článku.

Potvrzení

Tato studie byla podpořena PD Research Fund Richard Yu Chinese University of Hong Kong (CUHK) a výzkumnými účty CUHK 6905134 a 8601286. Financovatelé neměli žádnou roli při návrhu studie, sběru dat a analýze, rozhodování o publikování nebo přípravě rukopisu. Autoři neuvádějí žádný jiný střet zájmů. Výsledky prezentované v tomto článku nebyly dříve zcela nebo částečně publikovány.

Zlepšení onemocnění ledvin--Akteosid Cistanche

Od: 'Urinární podocytové markery vledvinanemocí' odLingfeng Zeng a kol

---Clinica Chimica Acta 523 (2021) 315–324