Porozumění třídění adenovirových kapsid po vstupu; Šance změnit vlastnosti vektoru vakcíny, část 1

Abstraktní:

Genetické vakcíny založené na adenovirových vektorech se ukázaly jako účinná strategie proti zdravotní krizi SARS-CoV-2. Tento úspěch není neočekávaný, protože adenoviry kombinují mnoho žádoucích vlastností genetické vakcíny. Jsou vysoce imunogenní a mají nízký a dobře charakterizovaný patogenní profil spojený s technologickou přístupností. Pokračující snahy o zlepšení adenovirových vakcinačních vektorů zahrnují použití vzácných sérotypů a nehumánních adenovirů. V tomto přehledu se zaměřujeme na virovou kapsidu a na to, jak výběr genotypů ovlivňuje příjem a následné subcelulární třídění. Popisujeme, jak pochopení vlastností kapsidy, jako je stabilita během vstupního procesu, může změnit osud vstupujících částic a jak se to promítá do rozdílů ve výsledcích imunity. Podrobně diskutujeme o tom, jak mutace membránového lytického kapsidového proteinu VI ovlivňuje post-vstupní třídění virů druhu C a stručně diskutujeme, zda by takové přístupy mohly mít širší dopad na vývoj vakcín a/nebo vektorů.

Klikněte na čisté cistancheprodukt

For more information:1950477648nn@gmail.com

1. Úvod

Virové infekce, na rozdíl od bakteriálních infekcí, které lze léčit antibiotiky, zůstávají hrozbou pro zdraví, protože existuje jen velmi málo antivirových léků. Proto je očkování jedinou široce použitelnou strategií ochrany lidské (a zvířecí) populace před virovými infekcemi.

Donedávna se o očkování proti virovým infekcím uvažovalo především v rámci prevence dětských nemocí nebo jako každoroční „chřipková“ injekce pro prevenci chřipkové infekce. S vypuknutím zdravotní krize SARS-CoV-2 v roce 2020 se očkování vrátilo do středu pozornosti veřejnosti, protože je nyní považováno za jediné udržitelné východisko z této pandemie. V tomto kontextu se vakcíny na bázi adenoviru (Ad) ukázaly jako jedna ze dvou hlavních úspěšných vakcinačních strategií. Po nouzovém schválení jsou nyní vakcíny Ad vstřikovány do velké části populace Země v bezprecedentním úsilí zavést planetární imunitu proti SARS-CoV-2.

Adenovirové vektorové vakcíny nebyly před vypuknutím COVID-19 široce používány, ale jejich úspěch není neočekávaný. Viry jsou obecně velmi vhodnými očkovacími platformami. Jsou biologicky optimalizovány a přizpůsobeny pro transport nukleových kyselin a vyvolávají imunitní reakce. Adenoviry mají mnoho vlastností, které z nich činí obzvláště ideální kandidáty na vakcínu. Mají nízký a dobře charakterizovaný patogenní profil spojený s vysokou infekčností. Jsou technologicky přístupné a byly široce používány pro vektorizaci. Jejich vysoký produkční výnos a stabilita umožňují průmyslovou výrobu za podmínek správné výrobní praxe (GMP) a poskytují praktické vlastnosti (tj. skladování) pro regionální distribuci za snížené náklady [1]. Kromě toho je dodání buněk Ad do buněk prezentujících antigen efektivní a přirozeně vyvolávají vrozenou imunitní odpověď, která působí jako adjuvans pro zvýšení úspěchu očkování [2,3].

Pochopení biologie Ad bylo zásadní při vývoji vektorů založených na Ad (vakcíny). Například použití nehumánních nebo vzácných sérotypů Ad v některých aktuálně prodávaných vakcínách proti SARS-CoV-2 bylo záměrně zvoleno, aby se předešlo snížení účinnosti vakcíny již existující vektorovou imunitou. Použití vektorů s odstraněným virovým genem poskytuje zlepšenou bezpečnost vektorů. Stále však existuje mnoho aspektů životního cyklu viru, které nebyly brány v úvahu při vývoji očkovacích vektorů založených na Ad, a znalosti o vzácných nebo nehumánních genotypech jsou omezené, včetně těch, které se v současnosti používají jako vakcíny proti SARS-CoV-2 . Touto recenzí bychom rádi zvýšili povědomí o potenciálních modifikacích, které by bylo možné využít při vývoji vektorů reklamy pro lékařské účely včetně očkování.

Zaměřujeme se na virovou kapsidu a na to, jak výběr genotypů ovlivňuje příjem a následné subcelulární třídění. Popisujeme, jak pochopení vlastností kapsidy, jako je stabilita během procesu vstupu, může změnit osud vstupujících částic a jaké různé výsledky imunity jsou pozorovány. Jako příklad toho, jak lze změnit stabilitu a osud kapsidy, podrobně diskutujeme o tom, jak mutace membránového lytického kapsidového proteinu VI ovlivňuje viry druhu C. Nakonec krátce diskutujeme, zda takové přístupy mají potenciál být využity pro vývoj vakcín a/nebo vektorů.

1.1. Adenoviry tvoří rozmanitou rodinu infekčních patogenů

Historicky byl Ad poprvé izolován v roce 1953 z adenoidů pacientů s respiračními infekcemi [4] a brzy poté byl všeobecně přijat termín „adenovirus“ [5]. Čeleď Adenoviridae má více než 120 členů, rozdělených do pěti rodů – v závislosti na tom, zda infikují savce (např. Mastadenoviridae), ptáky (např. Aviadenoviridae), plazy (např. Atadenoviridae), obojživelníky (Siadenoviridae) nebo ryby (Ichtadenoviridae ) [6,7]. Rod Mastadenoviridae také představuje více než 70 typů lidských Ads [8,9], které jsou klasifikovány do sedmi druhů (A–G) podle jejich morfologických, biologických a fyzikálně-chemických vlastností, jak je uvedeno v tabulce 1 [10, 11].

Kromě toho se Ads mohou také spontánně rekombinovat, a tím generovat nové druhy [12], jako tomu bylo v případě AdE4, což je jediný virus lidského druhu E a pravděpodobně vznikl rekombinací mezi lidským druhem B a opičím Ad [13 ]. Ačkoli jsou infekce u lidí nehumánními Ads přirozeně vzácné, nejsou nemožné [14,15]. Schopnost různých nehumánních Ads infikovat (nebo transdukovat) lidské buňky z nich činí atraktivní (vakcínové) vektorové platformy. Mezi nimi jsou reklamy odvozené od šimpanzů [16–18], goril [19], ovcí [20], krav [21], psů [21,22] nebo opice nového světa [23].

Adenovirové infekce mohou způsobovat různé patologie v závislosti na jejich buněčném nebo tkáňovém tropismu včetně respiračních, očních, močových nebo gastrointestinálních onemocnění (viz tabulka 1). Tkáňový tropismus je často výsledkem odlišného využití receptorů různými Ads a může také souviset s vnitřní stabilitou částic [24]. Většina infekcí způsobených Ads je u imunokompetentního hostitele mírná nebo asymptomatická. Primární infekce Ad se většinou vyskytují v dětství a mají za následek silnou ochrannou imunitu. Naproti tomu u imunosuprimovaných jedinců může Ads způsobit nekontrolované, závažné a život ohrožující systémové infekce vedoucí k závažné buněčné toxicitě, která může vyústit v nadměrný zánět a selhání více orgánů, což způsobuje vysokou mortalitu [12].

Nejlépe prozkoumanými lidskými Ads jsou viry druhu C typu 2 a 5, které se vyskytují převážně u pacientů s infekcemi horních cest dýchacích a gastrointestinálního traktu [25] a na které se tento přehled zaměří. Adenoviry mohou být zodpovědné za příležitostná ohniska, jako jsou viry druhu B způsobující zápal plic (např. Ad3, 7 a 14) mezi imunitně kompetentními jedinci [26] nebo Ad40/41 druhu F a Ad12, 18 a 31 druhu A , které infikují gastrointestinální trakt (jak je uvedeno v [26,27]). Viry druhu D jsou velmi různorodou skupinou a jsou náchylné k rekombinaci a jsou hlavní příčinou očních infekcí [28].

1.2. Adenovirové kapsidy jsou metastabilní struktury

Navzdory své rozmanitosti se všechny reklamy řídí podobným strukturálním a organizačním rámcem. Adenoviry jsou neobalené DNA viry obsahující relativně velký, 26–45 kb lineární genom dvouvláknové DNA [29–31]. Kapsida má průměr ~70–90 nm a má tvar dvacetistěnu s 20 fasetami a 12 vrcholy [32]. Kapsida se skládá ze tří hlavních strukturních proteinů (hexon, penton a vlákno) a řady menších cementových proteinů (tj. IIIa, VI, VIII a IX u virů druhu C), které stabilizují strukturu. Struktura několika Ad kapsid s vysokým rozlišením byla získána kryoelektronovou mikroskopií a rentgenovou krystalografií [24,33–36]. Ikosahedrální kapsida má pseudo-T25 strukturu se 720 exony sestavenými v různých trimerech v závislosti na jejich umístění v kapsidě. 20 fazet kapsidy se skládá z devíti sestavených exonů (tzv. GON pro skupinu devíti), zatímco ve 12 vrcholech jsou exony sestaveny v GOS (pro skupinu šesti) (podrobnosti viz [37,38] ). Pentamerický pentonový základ je vložen do 12 vrcholů a slouží jako základ pro vyčnívající trimerní vlákno [39,40]. Interakce mezi hlavními a vedlejšími kapsidovými proteiny stabilizuje kapsidu, především prostřednictvím interakce s šestiúhelníky.

Například GON je stabilizován pomocí IX [41]; IX a IIIa jsou samy stabilizovány svou interakcí s VIII, která je spojuje s GOS a GON [37]. Molekuly VIII nastiňují GON a pomáhají stabilizovat šestiúhelníky na vnitřní straně kapsidy. Protein VI také stabilizuje hexon vazbou na centrální dutinu trimeru hexonu vystavenou vnitřnímu lumenu viru [42–44].

Kapsida obklopuje a chrání virové jádro složené z virového genomu, proteinů virového jádra (tj. V, VII, Mu u virů druhu C) a terminálního proteinu (TP), který je kovalentně vázán na každý 5' konec viru. genom Ad. Menší kapsidové proteiny interagují s proteiny jádra a vytvářejí spojení mezi kapsidou a genomem; jejich prostorová organizace mezi proteiny jádra však zůstává špatně pochopena. Bylo prokázáno, že V udržuje DNA uvnitř kapsidy interakcí s VI (strana kapsidy) a VII (strana genomu) [45–47] a pravděpodobně přispívá k uvolňování genomu v jaderném póru [48]. VII je hlavní kapsidový protein spojený s virovou DNA a podporuje její kondenzaci uvnitř kapsidy [49–51]. VII také chrání virový genom před imunitní detekcí prostřednictvím buněčných faktorů [50,52–54]. Je zajímavé, že kapsidový protein IX a protein V jsou přítomny pouze u Mastadenoviridae [55,56] a virové kapsidy mohou být produkovány bez IX [57] nebo proteinu VII [58], což vykazuje určitou flexibilitu ve struktuře kapsidy.

Genom lidských Ads kóduje ~45 proteinů (včetně strukturních proteinů), organizovaných do časově regulovaných transkripčních jednotek [59]. Transkripční faktor E1A je prvním exprimovaným proteinem a je nezbytný k zahájení exprese virového genu [60]. Genom také obsahuje 5' enkapsidační sekvenci a invertované terminální repetice (ITR) na každém konci, které jsou nezbytné pro replikaci [59,61–64]. Adenoviry kódují adenovirovou proteázu (AVP), která je zabalena do částice a zpracovává několik proteinů (tj. IIIa, VI, VII, VIII, µ, TP a 52,55K u virů druhu C) [65–67]. Tento krok je nutný pro tvorbu zralých infekčních částic a indukuje tvorbu metastabilních (tj. méně stabilních) kapsid připravených pro demontáž kapsidy po připojení a vstupu buněk [68,69]

Existují také druhově specifické rozdíly ve struktuře lidských Ads, např. v délce vlákna a pružnosti, která přímo ovlivňuje vazbu receptoru [70–72]. Rozdíly lze pozorovat také v pentonové montáži. Pentony virů druhu B mohou vytvářet inter-pentonové kontakty, což vede k alternativním a méně stabilním virům podobným částicím, které jsou bez genomů a příležitostně bez vláken. Takové částice se nazývají dodekaedry a jsou studovány pro buněčný přenos plazmidů nebo peptidů jako alternativa k vektorům Ad. Dodekaedry lépe exponují krátký peptidový motiv RGD přítomný v pentonu většiny druhů Ad, který je nutný k navázání cílových buněk [73,74]. Rozdíly ve stabilitě kapsidy, jak je diskutováno níže, mohou být důležitou vlastností, která určuje vstupní osud částic Ad.

1.3. Adenoviry sledují lytický životní cyklus

Cyklus infekce Ad byl rozsáhle přezkoumán jinde [75–77]. Zde se stručně zaměříme na vstupní část životního cyklu, a pokud není uvedeno jinak, budeme odkazovat na viry druhu C, které jsou nejlépe prozkoumané (obrázek 1). Adenoviry používají kapsidové vlákno jako primární molekulu pro připojení buňky. Většina Ad, včetně virů druhu C, využívá k navázání cílových buněk coxsackievirus a Ad receptor (CAR) [78–81]. Naproti tomu některé viry druhu B se přednostně vážou na receptor CD46 [82] nebo desmoglein 2 [83] a u některých virů druhu D bylo prokázáno, že interagují s kyselinami sialovými [84,85] nebo přímo s integriny v (viz tabulka 1) [ 86].

Přepínání vláken mezi druhy je tedy atraktivní strategií ke změně tropismu [87–89]. Primární úlohou molekuly vlákna je zprostředkovat fyzickou asociaci s cílovými buňkami, po které následuje druhá interakce mezi pentonem a integriny, jako je v 5 [90]. Tato interakce je zprostředkována RGD peptidovým motivem v pentonové sekvenci [91]. Absence tohoto motivu, jako u virů druhu F, je spojena s méně účinným vstupem do buněk [92]. Vazba integrinu má za následek shlukování integrinu na buněčném povrchu [93], které spouští signální kaskádu vedoucí k reorganizaci aktinového cytoskeletu [94,95] a endocytárnímu vychytávání prostřednictvím klatrinem zprostředkované endocytózy nebo mikropinocytózy [96,97]. Vazba RGD může také destabilizovat kapsidu [98] snížením kontaktů mezi pentonem a hexonem, což napomáhá odkrytí kapsidy [99]. V důsledku toho částice Ad ztrácejí své vlákno a uvnitř endozomu lze nalézt disociovaný hexon a penton [100–102]. Endozom je dynamická organela připravená ke zrání do degradačních lysozomů a Ads musí rychle uniknout do cytosolu. Okyselení endozomu může urychlit proces úniku dalším oslabením kapsidy [100,103]. Proces penetrace endozomu závisí na uvolnění vnitřního kapsidového proteinu VI [103,104].

Uvolněný VI je charakterizován N-koncovou amfipatickou šroubovicí, která se váže na vnitřní cíp endozomu a indukuje pozitivní zakřivení membrány, což vede k lokálně omezené ruptuře membrány [75,103,105,106]. Buňky reagují na virem indukovanou rupturu membrány a aktivují lokalizovanou autofagickou reakci, aby odstranily poškozenou organelu [107–109]. Aby se zabránilo degradaci, Ads zastaví autofagii prostřednictvím krátkého peptidového motivu PPxY v proteinu VI, dokud částice nedosáhne bezpečnosti cytosolu [104,108]. Bylo prokázáno, že viry druhu C unikají z časných endozomů [110]. Jiné druhy včetně A, B a D se nejprve přesunou do lysozomu, než uniknou do cytosolu [111–113], což může ovlivnit imunitní aktivaci spouštěnou těmito viry [114].

Jakmile Ads dosáhnou cytosolu, zapojí se do dyneinových motorů a použijí retrográdní transport podél mikrotubulů k dosažení centra organizujícího mikrotubuly [115–117]. Vazba motoru je pravděpodobně zprostředkována hexonem [115] a může vyžadovat kyselou aktivaci [118]. V blízkosti jádra mění kapsidy směrovost transportu, pravděpodobně vazbou na motorické proteiny kinesinu a akumulací v jaderném obalu [115,117,119,120]. Ukotví se v komplexu jaderných pórů, pak se kapsidy zcela rozeberou a genomy se uvolní a importují do jádra [51,121–124]. Jakmile je uvnitř jádra, cyklus pokračuje aktivací transkripce genomu a expresí bezprostředního časného genu E1A, který slouží jako transkripční faktor pro všechny ostatní časné transkripční jednotky [60,125–130]. Po expresi replikačních enzymů se virové genomy replikují a akumulují na periferii replikačních center [131].

Poté jsou strukturní proteiny exprimovány z pozdní expresní jednotky pod kontrolou hlavního pozdního promotoru [132,133]. Exprese pozdních genů kulminuje v produkci a jaderné akumulaci všech strukturních proteinů, kde se skládají do potomstva a balí nově syntetizované genomy. Nukleární sestavení další generace Ads pak vede k výstupu částic a buněčné lýze [42,134–136]. Jak bylo uvedeno výše, po sestavení kapsid následuje zrání, tj. proteolytické štěpení několika kapsidových proteinů AVP za vzniku infekčních částic [66]. Důležitost tohoto procesu je ilustrována mutantem citlivým na teplotu, Ts1 původně identifikovaným ve screeningu mutageneze v Ad2. Při nepermisivní teplotě tento mutant nedokáže zabalit AVP a sestavené částice nepodléhají zrání, což má za následek hyperstabilní částice [137]. Zodpovědná AVP mutace byla geneticky zavedena do Ad5 se zachováním tohoto fenotypu. Kapsidy Ts1 jsou stále schopny vázat se na buněčné receptory a být endocytovány, ale pak zůstávají zachyceny v endozomu kvůli jejich selhání při uvolňování proteinu VI [103,138,139].

2. Imunitní detekce adenoviru

Adenoviry jsou rozšířené a velká většina populace se s tímto virem setkala především v dětství. Adenoviry jsou vysoce imunogenní a každé setkání vyvolává vývoj specifické imunity proti Ad, vrozené i adaptivní, která může trvat celý život. To je důležité v boji proti viru a činí Ads méně škodlivými pro imunitně kompetentního hostitele, ale může to být překážkou, když mají být Ads použity jako vektor ve vakcinologii nebo genové terapii [140,141]. Pochopení toho, jak Ad (a jeho vektorové deriváty) aktivuje imunitní systém, nám umožní zlepšit účinnost a bezpečnost vakcín. Pozorování in vivo od pacientů účastnících se klinických studií jasně ukázala, že vektory založené na Ad mohou indukovat silnou imunitní aktivaci [142,143], někdy s fatálními následky [144].

Kromě toho různé studie provedené in vitro nebo na zvířecích modelech [145] naznačují klíčovou roli samotné virové částice (tj. kapsidy a inkorporované DNA) při aktivaci počáteční imunitní odpovědi. Zde se stručně zaměříme na imunitní reakce spojené se vstupující kapsidou; pro podrobnější přehled viz dříve publikované přehledy [146–149].

2.1. Adenoviry spouštějí buněčnou vnitřní imunitu

S vývojem Ads jako vektorů se ukázalo, že buněčná vnitřní nebo vrozená imunita vyvolaná Ads je odpovědí na napadající virion. Je zajímavé, že jak replikativní, tak nereplikativní viry (tj. viry inaktivované UV zářením, nereplikativní vektory nebo prázdné kapsidy) aktivují imunitní reakce v infikovaných buňkách, což ukazuje, že kapsida má v této reakci klíčovou roli [145,150–156] .

Obecně jsou Ads snímány buňkami v několika krocích během celého životního cyklu viru a aktivují dráhy přirozené imunity (obrázek 1). Tato aktivace začíná vazbou Ad vlákna na buněčný povrchový receptor CAR, který aktivuje mitogenem aktivovanou proteinkinázu (MAPK) signalizaci, která vede k aktivaci transkripčního faktoru NF-KB. Tento spouštěč vede k produkci prozánětlivých cytokinů (IL-6, IL-8) [157,158]. V závislosti na druhu Ad však může použití jiných receptorů modulovat sílu signální kaskády zapojené do exprese cytokinů [159]. Interakce mezi virovým pentonem a buněčným integrinem je dalším spouštěčem imunitní aktivace. Studie na myších makrofázích ukázala, že tato vazba aktivuje expresi IL-1 prostřednictvím motivu RGD [160]. To může být omezeno na imunitní buňky, protože v jiných buněčných modelech (např. HeLa, linie epiteliálních buněk) nebyla úloha interakce integrin/RGD v produkci chemokinů a prozánětlivých cytokinů potvrzena [151,161,162]. To naznačuje důležitější roli samotného procesu internalizace v imunitní aktivaci než interakce s integriny. Pentonová vazba na integrin také aktivuje signalizaci fosfoinositid 3-kinázy (PI3K), aby se zvýšila internalizace viru [163].

Navíc se ukázalo, že aktivace PI3K po infekci Ad spouští produkci prozánětlivých cytokinů, jako je TNF [164], a proces internalizace byl popsán jako nutný pro imunitní aktivaci [165]. Tyto studie naznačují, že k imunitní aktivaci dochází hlavně v kroku po internalizaci, což zdůrazňuje důležitost třídění po vstupu (přehled v [166]).

Jakmile jsou Ads v endozomu, jsou vystaveny intraluminálním receptorům pro rozpoznávání patogenů (PRR), jako je TLR9, což je dvouvláknový DNA senzor omezený na imunitní buňky. Myší makrofágy mohou snímat vektory Ad prostřednictvím TLR9, aby indukovaly produkci prozánětlivých cytokinů [167]. TLR9 byl také striktně vyžadován pro produkci IFN/, když byly myším plazmocytoidním dendritickým buňkám (pDC) vystaven Ad [168]. Avšak v myších modelech TLR9 knock-out byl IFN/ stále produkován, což naznačuje, že v jiných buňkách než pDC dochází k produkci IFN nezávisle na signalizaci TLR9 [168,169].

Virové genomy (nebo vektorové genomy) se stávají přístupnými pro snímání během nebo po endozomálním úniku viru. Jakmile dosáhnou cytosolu, jsou snímány senzorem cytosolové dvouvláknové DNA cGAS [168,170]. Po rozpoznání virového genomu cGAS podporuje fosforylaci a nukleární translokaci transkripčního faktoru IRF3 k řízení exprese IFN, což vyvolává antivirový stav. Endozomální pasáž vyžaduje virem indukované poškození endozomální membrány, aby se usnadnil endozomální únik virových částic. Ruptura membrány tak významně přispívá k imunitní aktivaci, což je zvýrazněno skutečností, že únikový defektní mutant Ts1 nedokáže aktivovat kompletní a účinnou imunitní odpověď [161,162,170,171]. Klíčovou roli v zánětlivé odpovědi po penetraci Ad membránou hraje tank-binding kináza, TBK1, o níž se předpokládá, že je součástí downstream cytosolického snímání virového genomu cestou cGAS/STING [168,170].

Poškození membrány adenovirem také vede k uvolnění kathepsinu B z endo-lysozomálního kompartmentu, což způsobuje oxidační stres, který aktivuje zánět NLRP3, což vede k maturaci IL-1 [114]. Viry druhu C unikají z raných endozomů, zatímco viry druhu B se pohybují až do pozdních endozomů, pravděpodobně kvůli rozdílům ve využití receptorů. Acidifikace v pozdním endozomu/lysozomu pravděpodobněji aktivuje lysozomální kyselé hydrolázy. Oba druhy indukují aktivaci inflammasomu [172], ale pravděpodobně kvůli době pobytu v endozomu se rozsah jejich odpovědí liší. Globálně viry druhu B indukují silnější vrozenou a adaptivní imunitní aktivaci než viry druhu C [113,173,174]. To může vysvětlovat, proč jsou viry druhu B více patogenní a způsobují propuknutí u imunitně kompetentních hostitelů [26]. Dále naznačuje, že buňky mohou rozlišovat penetrační kompartment (tj. endozom vs. lysozom, [109]) a přizpůsobit účinnost imunity. Poškození endosomální membrány během procesu úniku Ad může být samo o sobě signálem nebezpečí. Jak je podrobně diskutováno níže, poškození membrány vede k cytosolické expozici intraluminálních glykanů, které jsou detekovány buňkou jako nebezpečné signály (jak je uvedeno v [109]). Detekce exponovaných glykanů galektiny následně aktivuje autofagii a spouští druhou větev antivirové imunity [108].

2.2. Adenoviry vyvolávají adaptivní imunitní odpověď a potlačují antivirovou autofagii při vstupu do buňky

Vrozené imunitní reakce vyvolané Ads nebo jejich vektory se následně překládají do adaptivní imunity prostřednictvím sekrece chemokinů, které přitahují imunitní buňky (neutrofily, přirozené zabíječské buňky a makrofágy) a posilují silnou prezentaci antigenu [153,154]. Adenoviry jsou vysoce imunogenní a jejich hlavními imunogeny jsou hlavní kapsidové proteiny (hexon, penton a vlákno), které spouštějí druhově specifickou produkci neutralizačních protilátek B buňkami [175–177].

Neutralizační protilátky jsou většinou namířeny proti hypervariabilním smyčkám hexonového proteinu [178–180] a představují hlavní omezení pro použití Ads jako vektorů odvozených ze stejného sérotypu. Tento problém se podařilo obejít použitím méně séroprevalentních nebo nehumánních Ads [181–185]. Navzdory této anti-vektorové imunitě, když jsou Ads použity jako očkovací platformy (např. k vyvolání imunitní ochrany proti Ebola v klinických studiích), stále vyvolávají silnou odpověď B buněk, což umožňuje produkci protilátek proti požadovanému imunogenu vakcíny, která může trvat po dobu až 6 měsíců [186]. Kromě toho by již existující vektorová imunita mohla být překonána vyššími dávkami vakcinačního vektoru, jako v případě vakcinačního vektoru SARS-CoV-2 založeného na vysoké séroprevalenci AdC5 [187].

Stejně jako u neutralizačních protilátek, infekce Ad spouští trvalou imunitu T-buněk, hlavně prostřednictvím aktivace CD4 plus. Tuto ochranu lze stále nalézt u dospělých, což naznačuje dlouhotrvající imunitu od dětství [188–190]. Kromě toho je také popsána aktivace CD8 plus k udržení cytotoxické odpovědi [191–193]. Tato aktivace T-buněk není nutně sérotypově specifická a umožňuje zkříženou ochranu proti různým podskupinám a sérotypům Ad [192–194].

Navíc u pacientů s transplantovanými kmenovými buňkami infikovaných Ad byla popsána silná aktivace CD4 plus a CD8 plus [195]. Tato aktivace je namířena proti hexonovým peptidům a vede k odstranění Ad virémie, což zdůrazňuje hlavní roli aktivace CD4 plus a CD8 plus T-buněk v imunitní ochraně. Zatímco tato imunita založená na T-buňkách je namířena proti částici Ad, Ads také spouští silnou buněčnou imunitu založenou na odpovědi T-buněk proti antigenu vakcíny, což je výhoda pro dlouhotrvající imunitu při použití rekombinantních vektorů Ad jako očkovacích platforem [196,197 ]. Důležité je, že údaje z klinických studií potvrdily, že když je Ad použit jako očkovací platforma (s požadovaným antigenem jako transgenem), indukuje aktivaci cytotoxických CD8 plus T-buněk a CD4 plus T-buněk, což vede k paměťové imunitě proti exprimovaný transgen [184,186,198–202].

Aktivace T-buněk závisí na prezentaci virových peptidů prostřednictvím hlavního histokompatibilního komplexu (MHC). Stručně řečeno, prezentace antigenu MHC I. třídy je výsledkem proteasomální degradace a získané peptidy budou indukovat aktivaci CD8 plus T-buněk, což umožní aktivaci a proliferaci cytotoxické odpovědi T-buněk. Prezentace antigenu MHC třídy II je výsledkem lysozomální proteolýzy a výsledné peptidy budou po prezentaci indukovat aktivaci CD4 plus T-buněk, čímž spustí následnou aktivaci B buněk [203]. Nyní je dobře charakterizováno, že autofagie podporuje prezentaci peptidu molekulám MHC třídy II [204]. Není divu, že autofagie je jedním z nejstarších obranných mechanismů proti infekci a důležitou součástí buněčného repertoáru proti invazním patogenům, účastní se jak vrozených, tak adaptivních imunitních reakcí. Dokáže přímo sekvestrovat patogen pro degradaci (xenofagii) a podílí se na jeho prezentaci imunitnímu systému [205–207]. Makroautofagie (běžněji nazývaná autofagie) je konzervovaná lysozomální degradační dráha, která se účastní mnoha základních fyziologických procesů, jako je homeostáza a vrozená a adaptivní imunita [208–210]. Autofagie je charakterizována tvorbou dvojitého membránového vezikula zvaného „autofagozom“, který pohlcuje cytoplazmatické náklady (tj. organely, agregáty a patogeny) určené k degradaci (obrázek 2). Během tohoto procesu se autofagozomy obsahující náklad spojí s lysozomy, aby byly degradovány a recyklovány.

Prezentace antigenu prostřednictvím autofagie byla popsána pro MHC I. i II. třídy [204]. Po indukci autofagie jsou intracelulární antigeny pohlceny v autofagosomech, fúzují s kompartmenty obsahujícími MHC třídy II, aby jim poskytly vnější patogenní materiál (obrázek 2) [211]. Role autofagie v této konkrétní prezentaci antigenu MHC třídy II byla poprvé popsána u infekce virem Epstein-Barrové, kde inhibice autofagie vedla ke snížení aktivace CD4 plus T-buněk [212,213]. K dnešnímu dni příklady zahrnují několik virů včetně viru herpes simplex [214], viru chřipky [215] a viru lidské imunodeficience typu 1 (HIV-1) [216] a pravděpodobně se vztahuje i na Ads (viz níže). Prezentace MHC třídy II je konzistentní s procesem autofagie, protože se jedná o cytosolický obranný mechanismus. Autofagie se také účastní zkřížené prezentace extracelulárních antigenů MHC třídy II [214]. MHC prezentace extracelulárního ovalbuminu je skutečně účinnější, když je autofagický aparát (a zejména ATG5) funkční a bylo prokázáno, že příjem extracelulárního materiálu zahrnuje nekanonickou formu autofagie nazývanou LC3-asociovaná fagocytóza ( LAP) [217].

Jakmile jsou některé extracelulární antigeny přítomny v LAP-some, mohou být exponovány prostřednictvím prezentace MHC třídy II [218]. Autofagie je také do určité míry zapojena do prezentace MHC I. třídy, ačkoli naprostá většina epitopů je prezentována mechanismem striktně závislým na transportéru asociovaném s komplexem zpracování antigenu (TAP) [219]. Prezentace nezávislá na TAP zprostředkovaná autofagií byla dosud prokázána pouze za podmínek deplece TAP [219,220]. Pokud tento způsob prezentace skutečně existuje, zůstává kontroverzní [221] a je diskutován jinde [204,222,223].

Aby zabránil prezentacím MHC, Ads věnuje velkou část svého genomu, jmenovitě oblasti E3, k podkopání systému prezentace MHC v buňkách [224–228]. Ve většině (vakcinačních) vektorech tyto geny chybí a nedávná práce naznačuje, že zvýšení prezentace antigenu pomocí MHC by mohlo zlepšit účinnost vakcíny proti Ad [229,230]. Autofagie hraje klíčovou roli při zpracování antigenů Ad pro prezentaci MHC třídy II v imunitě indukované Ad [108,229].

Montespan a kol. ukázaly, že Ads indukují autofagii po penetraci endozomu a že vstupující částice očištěné autofagií v tomto procesu jsou účinně prezentovány imunitnímu systému [108]. Toto pozorování je v souladu se studií publikovanou Kleinem et al. ukazující, že v kontextu onkolytických Ads jsou virové antigeny vyzrálé formou autofagie závislou na JNK [229]. Autofagie v kontextu rakoviny však hraje dvojí roli. Autofagie jako strážce homeostázy omezuje iniciaci nádoru [231], zatímco u pokročilé rakoviny autofagie působí jako proces přežití, který podporuje růst nádoru [232,233]. V kontextu onkolytických vektorů by tedy měly být pečlivě vyhodnoceny nádorově specifické autofagické rysy.

3. Adenoviry jako (vakcínové) vektory

Vektorizace viru zahrnuje využití jeho přirozených vlastností při současné minimalizaci souvisejícího biologického rizika. V těchto termínech jsou Ads vynikajícími vektorovými kandidáty pro vývoj vakcíny [234]. Adenovirové vektory jsou stabilní, lze je snadno produkovat do vysokého titru a mají velké klonovací kapacity. To umožňuje inzerci transgenu, tj. expresi vybraného antigenu. Mají široké spektrum infekčnosti a transdukují nedělící se buňky a jejich genom je neintegrativní [1]. Jak je popsáno výše, také vyvolávají zánětlivou reakci v buňkách prezentujících antigen (APC), které slouží jako adjuvantní funkce k zesílení imunitní reakce nezbytné pro účinné očkování [2,3,142,235,236].

Navíc vektory odvozené od Ad byly široce používány v preklinických a klinických studiích k prokázání jejich bezpečnosti [237,238]. Aby se eliminovala nechtěná část replikačního cyklu, je třeba potlačit replikaci viru, aby se zabránilo buněčné lýze a šíření viru. Vývoj adenovirových vektorů začal na počátku 90. let jako platforma pro širokou škálu terapeutických přístupů, jako je genová terapie, onkolytické vektory a vývoj vakcín. Většina raného vývoje vektorů byly modifikované verze virů druhu C.

3.1. Vývoj adenovirových vektorů, generační přístup

První generace Ad vektoru byla vytvořena delecí oblasti El a E3 z virového genomu, zejména kódující bezprostřední časný transkripční faktor, který těmto vektorům brání v replikaci. Tyto vektory měly klonovací kapacitu přibližně 8 kb pro vložení transgenu s regulačními sekvencemi [239–241]. Vektory první generace byly produkovány v buňkách lidských embryonálních ledvin (HEK) stabilně transformovaných částí virového genomu Ad5, který doplňuje oblast El in trans [242–247]. Jednou z hlavních nevýhod tohoto systému je, že umožňuje rekonstituci replikačně kompetentních genomů po spontánní rekombinaci [248]. Dodatečná delece E3, která není nezbytná pro produkci vektoru, zvyšuje velikost transgenní kazety [243] a podporuje lepší imunitní odpověď [240].

Bohužel, vektory Ad první generace nebyly zcela transkripčně inertní a stále vyvolávaly silnou imunitní odpověď proti virovým kapsidovým proteinům, které byly exprimovány na výchozích hladinách [141,249,250]. Tato lentivectorová imunita přispěla k vektorové toxicitě a krátkodobé eliminaci transdukovaných buněk [145]. Druhá generace Ad vektorů měla navíc oblasti E2 a E4 odstraněné z vektorového genomu. E2 kóduje replikační enzymy a další regulační proteiny E4 [251–253]. To umožnilo prostor pro 10,5 kb transgenních sekvencí, včetně až čtyř expresních kazet [254]. Podobně doplňkové delece silně redukovaly nežádoucí rekombinaci a prodloužily expresi transgenu [255]. To bylo pravděpodobně důsledkem snížené aberantní virové genové exprese, která dále snižuje anti-vektorovou imunitu [141,250,251]. Adenovirové vektory třetí generace jsou koncepčně odlišné. Skládají se ze sbaleného vektorového genomu a nezabaleného virového genomu (pomocný virus), který produkuje vektorové částice. Takové vektory jsou také známé jako "helper-dependent", "gutless" nebo "high-capacity" (HC-Ad) vektory. Mají nejvyšší možnou klonovací kapacitu a mohou nést sekvence o velikosti až 36 kb [256–258]. Vysokokapacitní Ads postrádají jakoukoli virovou kódující sekvenci kromě ITR a krátkého enkapsidačního signálu, který umožňuje sbalení genomu a který chybí v pomocném viru [259–262]. Tato strategie nám umožnila konečně překonat většinu anti-vektorové imunity a umožnila dlouhodobou expresi transgenů [263–267]. HC-Ads však nejsou součástí současného repertoáru vakcínových vektorů.

3.2. Adenovirus jako vektor vakcíny

Než prozkoumáme, jak byly vektory Ad využívány, je třeba zmínit, že očkování proti virům Ad druhu B typu 4 a typu 7 samotným bylo vyvinuto na počátku 70. let 20. století [268]. Tato orální živá vakcína je povinná od roku 2011 pro vojenské rekruty v USA a dramaticky snížila míru infekce, která dosahuje prakticky nuly [269–271]. To zdůraznilo skutečnou účinnost a bezpečnost Ads jako vakcíny a otevřelo pole pro použití Ads jako očkovací platformy. K dnešnímu dni vstoupilo do klinických studií více než 200 vakcín na bázi Ad [272]. Mnohé z nich jsou zaměřeny proti infekčním patogenům, jako je HIV{10}} a Ebola [230,273,274]. Vakcíny na bázi adenoviru nejsou bez nevýhod. Nedávno vyvinutá vakcína proti HIV, založená na viru druhu C Ad5, používala směs vektorů exprimujících geny HIV-1 gag, pol a nef [275,276]. Vektory byly bezpečné, imunogenní a dobře tolerované. Výsledná klinická studie STEP musela být bohužel předčasně zastavena [277–279]. Nejen, že se ukázalo, že tato vakcína nechrání před infekcí HIV, ale epidemiologické údaje naznačují, že očkování Ad v tomto případě zvyšuje riziko infekce HIV [280–282]. Preexistující imunita proti Ad5 byla identifikována jako potenciální postvakcinační rizikový faktor [283,284]. Toto pozorování však nebylo v podobných studiích potvrzeno [285,286] a zůstává mechanicky nejasné [287,288]. Vedle HIV byly v boji proti ebole (Ad-EBOV), opakující se hrozbě v západní Africe, vyvinuty vektorové vakcíny založené na Ad [289]. Všechny vakcíny Ad-EBOV používají jako antigen vakcíny glykoprotein Ebola (GP). Počáteční preklinické studie na hlodavcích a primátech používaly Ad5 a prokázaly ochranu po dobu 3 měsíců s produkcí neutralizačních protilátek a aktivací CD8 plus [273,290–292]. Tato vakcína prošla klinickou studií fáze II; preexistující imunita proti Ad5 u očkované populace však vedla k rozdílům v hladině vyvolaných neutralizačních protilátek [293–297]. K překonání tohoto problému byly vyvinuty vakcíny založené na méně rozšířeném druhu D Ad26 [186,298,299].

Ad26 je však u lidí méně imunogenní, což má za následek sníženou účinnost očkování a vyžaduje primární posílení pomocí vakcíny na bázi viru spalniček (MVA). Tento očkovací režim dosáhl fáze III klinických studií [289 300 301]. Ve vývoji bylo také použití nehumánních vektorů Ad [184]. Použití šimpanzího ChAd3 jako očkovací platformy proti EBOV prokázalo ochranu u hlodavců a šimpanzů [302,303] a klinické studie využívající tyto vektory jsou v různých krocích pokroku [17,300,301,304–306].

Až donedávna byly vakcíny proti HIV{0}} a EBOV dvěma hlavními příklady použití vakcín založených na vektoru Ad, ale nejsou jediné. Byly učiněny různé pokusy využít vektory vakcín Ad proti různým patogenům, jako je Mycobacterium tuberculosis [307–310], virus dengue [311–313], hepatitida B a C [314–320], vzteklina [321–324] nebo chřipka [325–328]. Jejich účinnost však byla vždy pod očekáváním (více podrobností viz [18,142,300,329]). Kandidát na vakcínu EBOV zůstal jedinou prakticky používanou vakcínou proti Ad a používá se s určitými omezeními v Demokratické republice Kongo. Tato vakcína je založena na typu Ad26 (Ad26-ZEBOV/MVA-BN-FILO) a v květnu 2020 dostalo 20 339 lidí první dávku očkování a 9 560 bylo plně očkováno [230 301 330].

Adenovirus-vektorizované vakcíny získaly velkou podporu veřejnosti v reakci na pandemii SARS-CoV-2. Naléhavost situace umožnila zúročit jejich vývoj, včetně zkušeností získaných s vakcínami proti koronavirům, které způsobily předchozí regionálně omezené propuknutí SARS-CoV-1 [331]. Koronavirový spike (S) glykoprotein byl identifikován jako nejlepší vakcinační antigen pro imunitu vůči koronavirovým infekcím [332,333]. K dnešnímu dni jsou čtyři vakcíny Ad vektor, všechny kódující spike antigen, v pokročilém stavu a byly schváleny pro nouzové použití ve velkých částech světa. Použité vektorové strategie byly mírně odlišné, ale v podstatě zahrnují použití vektorů první generace. Pohybují se od použití vektorů založených na Ad5-druhu C (Ad5-nCoV), překonání již existující imunity vysokou dávkou vektoru (CanSino) [187 334] až po použití méně rozšířeného viru druhu D Ad26, za použití stabilizovaného spike glykoproteinu (JNJ-78436735/Ad26.COV2.S) [335]. Alternativní přístup využívá ChAdOx1-S-(AZD1222), vektor Ad od šimpanzů [336,337]. Jediná používaná vakcína založená na heterologní prime-boost strategii k překonání vektorové imunity (Gam-COVIDVac/Sputnik V) aplikuje nejprve vektor založený na Ad26-a poté v posilovací injekci používá vektor Ad5 [338,339]. Ve všech případech byly údaje z klinických studií velmi slibné, ukazující vysoké úrovně indukované ochranné imunity a v několika zemích bylo povoleno nouzové použití pro použití vakcín na bázi Ad. Epidemiologické průzkumy probíhajících očkovacích kampaní v různých zemích navíc naznačují ohromný úspěch v používání vakcín proti SARS-CoV-2 založených na reklamě.

4. Modulace účinnosti vektoru adenoviru (vakcíny), kapsid vede cestu

Návrh vektoru adenoviru (vakcíny) musí brát v úvahu několik faktorů. Ty zahrnují udržení dlouhé a trvalé exprese kódovaného antigenu a aktivaci imunologického kontextu (adjuvantní účinek), který umožňuje účinnou translaci exprese antigenu do trvalé adaptivní imunity namířené proti imunogenu, ale ne proti samotnému vektoru. Imunologický kontext je poskytován vrozenou imunitní aktivací, kterou vakcinační vektor vyvolává během podávání. V tomto kontextu je důležitá účinnost, s jakou vrozené imunitní senzory detekují vektor, a ta zase určí amplitudu adaptivní reakce. Jak je popsáno v oddílech výše, vrozené imunitní snímání probíhá hlavně na úrovni po vstupu, současně s penetrací endozomu Ad. Účinná exprese (vakcínového) antigenu pak závisí na rovnováze mezi úrovní clearance vektoru vs. úspěšným dodáním a expresí vektorových genomů do jádra. S vývojem kapsidových displejových vektorů není k vyvolání imunitní aktivace vyžadována exprese transgenu. Tato strategie je založena na vložení požadovaného epitopu do proteinů kapsidy Ad, což umožňuje jeho přímé vystavení imunitnímu systému. I když má tento přístup určité výhody, většina vakcinačních vektorů se spoléhá na geneticky kódované geny. Další informace o vektorech zobrazení kapsid naleznete v těchto recenzích [340,341].

Preexistující imunita proti virovému vektoru (např. 30–90 procent proti viru druhu C Ad5, v závislosti na geografické poloze) může snížit příjem vektoru a snížit expresi antigenu a výslednou imunitní odpověď [342–344]. Bylo vyvinuto několik strategií ke snížení imunity proti vektorům a nedávno byly přezkoumány [249]. Stručně řečeno, neutralizační protilátky rozpoznávají hlavně hypervariabilní smyčku exonů a v důsledku toho jsou sérotypově specifické [178–180]. Tyto hypervariabilní smyčky mohou být proto nahrazeny smyčkami jiného, ​​méně rozšířeného sérotypu [178,345]. Tím se zabrání neutralizaci a inaktivaci vektoru. Vzhledem k tomu, že Ad5 je nejvíce séroprevalentní typ, použití vzácných sérotypů, jako je Ad26, Ad35 nebo nehumánní Ads, by se tomuto problému také zabránilo [177,346–350].

Avšak hlavní nevýhodou použití vzácných typů je jejich nižší imunogenicita, která je činí méně účinnými, pokud jde o vývoj vakcíny [298]. Proto by měly být strategie pro snížení anti-vektorové imunity vyvinuty paralelně se strategiemi pro zvýšení imunogenicity vektoru, aby se získal nejúčinnější vektor. I když je počáteční hladina neutralizačních protilátek proti vektoru nízká, vakcinace daným typem vektoru může vyvolat reakci, která zabrání jeho budoucímu použití. Priming anti-vektorové odpovědi také probíhá na post-entry úrovni, kdy jsou vektorové částice tříděny a zpracovávány jako samotné antigeny. Vyvolání imunologicky příznivého kontextu pro úspěšnost vakcinace může přijít na úkor zvýšené aktivace vektorové imunity. Pochopení parametrů, které určují osud Ad vektorů po příjmu, může poskytnout příležitost pro návrh vektorů.

4.1. Stabilita spočívá v druhu

Receptorem zprostředkované vychytávání a únik z endo-lysozomálního kompartmentu jsou charakteristické znaky infekce Ad a transdukce vektoru. Počáteční příjem je určen interakcí molekul virového vlákna a pentonu s buněčnými receptory. Vláknina a penton jsou společné všem Ads, ale podle jejich druhu se zapojují do různých buněčných receptorů (tabulka 1). Viry druhu C využívají CAR a vstupující částice unikají z časného endozomálního kompartmentu [79]. Pokud jsou viry druhu C (Ad5) zkonstruovány tak, aby obsahovaly molekulu vlákna z viru druhu B (Ad16), výsledná částice (Ad5F16) pak unikne z lysozomálního kompartmentu (jak je ukázáno barvením lysozomálním markerem LAMP1) místo raného endozom [351]. Tento opožděný únik z lysozomů je rys sdílený se všemi testovanými viry druhu B [111,352,353].

Kromě toho hybridní Ad5F16 stejně jako viry druhu B vyvolávají silnější prozánětlivou odpověď než viry druhu C [159,351]. To je přičítáno zvýšené detekci prostřednictvím intraluminálního TLR9 v imunitních buňkách [354]. Poškození lysozomální membrány navíc na rozdíl od časného poškození endozomu způsobuje silný oxidační stres. Ruptura lysozomu současně uvolňuje lysozomální hydrolázy, jako je katepsin B, které mohou poškodit mitochondrie, a tak zesílit reakci na poškození prostřednictvím aktivace zánětu [355–357]. Proces vychytávání Ad destabilizuje kapsidu a umožňuje uvolnění virového proteinu VI [103,106]. Uvolněný protein VI pak proniká membránou z endo-lysozomálního kompartmentu, aby umožnil viru získat přístup k cytosolu. Srovnání druhů C a B ukazuje, že oba viry jsou stejně účinné při vstupu do cytosolu a přenosu genomu, ale liší se v kinetice úniku [111]. Skutečnost, že jednoduchá výměna vláken může přenést vstupní a imunogenní vlastnosti z viru druhu B na virus druhu C, je pozoruhodná. Poskytuje důkaz koncepce, že lze navrhnout hybridní vektory se specifickými vlastnostmi. Základní rozdíl se zdá být v tom, že uvolňování proteinu VI je zpožděno u virů druhu B (nebo hybridního viru) a může vyžadovat buď okyselení nebo jiný neznámý spouštěč rozkladu.

Protože uvolňování proteinu VI je v tomto případě zpožděno, mohlo by to odrážet zvýšenou stabilitu kapsidy. U virů Ad5 druhu C se skutečně ukázalo, že uvolňují molekulu vlákna po navázání na buňky, což je krok, o kterém se předpokládá, že oslabí kapsidu a spustí proces rozkladu pro uvolnění proteinu VI. V tomto kontextu se ukázalo, že Ad5 bez vláken je méně stabilní než nativní částice [358]. Naproti tomu nezralé, hyperstabilní Ts1 Ad2/5 neuvolňují vlákninu nebo protein VI a jsou slabými induktory zánětu, protože nespouštějí TLR9 ani nezpůsobují poškození membrány [114,138,359,360].

Zda záměna vláken s druhem B zabraňuje počátečnímu uvolnění vlákna a činí kapsidu druhu C stabilnější, nebylo zkoumáno, ale je pravděpodobné. Stabilita kapsidy může být základním determinantem osudu kapsidy po vstupu a v rozšíření i rysem, který by mohl být využit pro návrh vektorů. Viry druhu B mohou být stabilnější díky použití jiného receptoru nebo díky jedinečné interakci vlákno-penton. Naproti tomu viry druhu F Ad40/41 infikují gastrointestinální trakt a mají zvýšenou stabilitu kapsidy díky svému tropismu a jejich adaptaci na drsné střevní prostředí [24,361]. Střevo má vnitřní teplotu, která je několik stupňů nad horními dýchacími cestami cílenými viry druhu C (37 ◦C vs. 33 ◦C) [362]. Ad40/41 jsou tedy ve své podstatě termostabilnější, podporují proces infekce [24], což ztěžuje jejich šíření [24,361,363].

Navíc jim chybí motiv RGD v molekule pentonu, což má za následek další snížený vstup do buněk [92]. Není známo, zda se tyto jedinečné vlastnosti kapsidy promítají do úniku z lysozomálního kompartmentu nebo částečného rozkladu/defektů uvolňování proteinu VI při vstupu. Naproti tomu tyto vlastnosti mohou poskytnout kontext pro vývoj aplikací orálních vakcín. Na rozdíl od vláken druhu B mají vektory obsahující vlákna druhu F sníženou imunitní aktivaci [364], když jsou aplikovány na standardní podmínky prostředí. Pokud je nyní daný lidský druh Ad vytržen z kontextu a použit jako vektor vakcíny, mohlo by být užitečné podívat se na přirozený tropismus tohoto vektoru a hledat vodítka k předpovědi jeho chování. V současnosti používaný vakcinační vektor založený na Ad26 je virus druhu D a jeho přirozeným tropismem jsou oči a gastrointestinální trakt [365]. Viry druhu D včetně Ad26 jsou méně imunogenní než Ad5 [366] a bylo prokázáno, že se pohybují do pozdního endozomálního kompartmentu, pravděpodobně zahrnující zpožděné uvolňování proteinu VI.

V důsledku toho blokování acidifikace pozdního endozomálního kompartmentu dále snižovalo jeho imunogenicitu [113]. Na rozdíl od lidských Ads jsou znalosti o nehumánních Ads používaných také při očkování a vektorizaci velmi omezené. Ads pocházející ze šimpanzů včetně ChAd3 jsou blízce příbuzné virům druhu D [367,368]. Je zajímavé, že vektory Ad5 jsou více imunogenní než vektory Ad odvozené od šimpanzů a mají vyšší transdukční potenciál. Toto pozorování nebylo spojeno s rozdíly v pentonovém RGD motivu nebo vláknu a jeho mechanický důvod zůstává neznámý [369]. Potenciální rozdíly ve stabilitě kapsidy nebyly zkoumány. Další nehumánní reklama využívaná jako vektor je psí reklama typu 2 (CAV-2). Tento vektor má pozoruhodnou vlastnost selektivně transdukovat neurony, ale ne obklopující gliové buňky, na rozdíl od kontrolního vektoru Ad5, přestože oba vektory používají stejný receptor [370–372]. Tato schopnost může být spojena se zvýšenou stabilitou kapsidy, což umožňuje odstranění povlaku pouze v neuronových buňkách. Psi mají tělesnou teplotu o ~2 ◦C vyšší než lidé, což potenciálně vede ke zvýšené stabilitě kapsidy CAV-2 [373], obdobně jako u virů druhu F. CAV-2 špatně vyvolává vrozenou imunitní odpověď, což je v souladu s nedostatkem účinného rozkladu v cílových buňkách [372]. CAV2 vektory tedy mohou být dalším příkladem, kde biofyzikální vlastnost spojená s jeho přirozeným tropismem nebo hostitelem má potenciál poskytnout nové vlastnosti vektoru.

4.2. Jemné doladění struktury kapsidy, příklad proteinu VI u druhu C Ad2/5

Jestliže stabilita kapsidy a uvolňování proteinu VI určují downstream osud virové kapsidy, vyvstává otázka, zda to lze modifikovat ve vektorech Ad, tj. přisuzovat virovým vektorům nové vlastnosti (obrázek 3). Většina našich znalostí o tom, jak Ads pronikají do endo-lysozomálního kompartmentu, pochází z virů druhu C Ad2/5. Pro pochopení tohoto procesu byl zásadní objev proteinu VI jako membránového lytického faktoru [103,106]. Protein VI kóduje N-terminální amfipatickou šroubovici, která je skutečnou membránovou lytickou částí proteinu. Během produkce viru je protein VI exprimován jako prekurzorový protein, který se asociuje s hexonovými trimery prostřednictvím amfipatické šroubovice [42,374]. Komplex je importován do jádra prostřednictvím transportních signálů kódovaných na N- a C-konci proteinu VI, které jsou odstraněny během sestavení viru a zrání virovou proteázou. C-koncový peptid s 11 aminokyselinami také aktivuje proteázu a poskytuje chytrý způsob, jak propojit sestavení viru se stíněním amfipatické šroubovice. Mutantní virus Ts1 Ad2/5 má defekt balení proteázy a žádný z kapsidových proteinů, včetně proteinu VI, není zpracován. Výsledné částice jsou hyperstabilní, zadržují vlákna a neuvolňují protein VI.

V důsledku toho jsou částice Ts1 tříděny do lysozomů po endocytóze zprostředkované receptorem. Přesné umístění proteinu VI ve zralém viru není jasné, ale odštěpený N-konec se lokalizuje na vnitřním hexonovém povrchu peripersonálních exonů [37,104,375]. Ukázalo se, že dvě bodové mutace v proteinu VI, G33A a S28C zvyšují stabilitu kapsidy Ad5 (obrázek 3A) [376,377]. První mutant předchází N-terminální místo štěpení proteázy v proteinu VI a zhoršuje zpracování. Výsledné částice jsou částečně nezralé a jsou charakterizovány defektem lýzy endozomu, což naznačuje, že N-konec proteinu VI stabilizuje interakce protein-protein uvnitř virionu [376]. Druhý mutant byl vybrán pro svou schopnost tvořit intramolekulární disulfidové můstky [377].

Virus obsahoval částečně nezpracované proteiny, potenciálně včetně proteinu VII, ale překvapivě nevykazoval žádné defekty infekčnosti, navzdory jeho zvýšené stabilitě. Není známo, zda některý z virů má změněný profil imunitní aktivace. Další bodovou mutací proteinu VI, která ovlivňuje osud viru, je mutace proteinu VI L40Q přímo umístěná v amfipatické šroubovici (obrázek 3A) [378,379]. Viry s touto mutací normálně dozrávají, ale jsou částečně defektní pro krok lýzy endozomu. Na rozdíl od výše uvedených mutantů jsou viriony L40Q méně stabilní než jejich protějšky divokého typu. Místo zpoždění se protein VI a penton uvolňují předčasně z kapsidy L40Q. Viriony L40Q jsou méně infekční a podléhají částečnému třídění lysozomů. Mutace L40Q však zcela nezruší lýzu membrány a některé viry uniknou do cytosolu, což má za následek celkově ~čtyřnásobně sníženou infekčnost vektoru L40Q [379,380]. Pozorování naznačují, že amfipatická šroubovice přispívá svou interakcí ke stabilitě částic. Není známo, zda a jak mutace L40Q mění imunogenní vlastnosti vektorů Ad5. Nedávná pozorování naznačují, že uvolňování proteinu VI z kapsidy je spouštěno vnitřní kompeticí s proteinem VII o stejná nebo překrývající se vazebná místa v exonech [375].

Mutantnímu viru bez proteinu VII se konzistentně nedaří uniknout z endozomu a má defekt v lýze endozomu [58]. Další pochopení strukturní a dynamické organizace vnitřní kapsidy (tj. protein VI) a jádrových proteinů (tj. protein V a VII) v částici a během buňky, vstup velmi pomůže pochopit, co určuje (reverzibilní) stabilitu kapsidy.

Řízení účinnosti imunitní aktivace Ad vektorů je hlavním zájmem pro vývoj vakcín a rozšíření MHC prezentace antigenů by zlepšilo vývoj vakcín [381]. Jak již bylo zmíněno dříve, autofagie reguluje imunitní aktivaci a dodává peptidy do MHC. Autofagie je jedním z nejstarších buněčných obranných mechanismů proti infekci, ale Ads, jako adaptované lidské patogeny, si nevyvinuly mechanismy, které by zabránily autofagii při vstupu. Místo toho se zdá, že přijímají aktivaci autofagie a odvádějí odpovědnost na podporu infekce. Protein VI hraje ústřední roli v řízení autofagické odpovědi buňky. Lýza membrány adenoviru proteinem VI vede k náboru galektinu 3 a galektinu 8, které jsou buňkou rozpoznány jako nebezpečné signály (obrázek 3B) [108,109,382]. Detekce míst pronikání Ad galektiny aktivuje selektivní autofagii v infikované buňce, jak ilustruje nábor autofagických receptorů (např. NDP52 ap62) a tvorba LC3 punctae [108].

Je zajímavé, že vektorovým částicím Ad5 se podaří uniknout z prasklého endozomu a mohou se přesunout do jádra. Inhibice autofagie neovlivňuje virovou infekčnost, ale zpožďuje dodání jejich genomu do jádra, což ukazuje, že Ads unášejí buněčný aparát pro svůj zisk [108]. Únik z endozomu tedy umožňuje viru vyhnout se degradaci autofagií prostřednictvím aktivního procesu. Tento proces objevil ještě další mutant proteinu VI, mutant M1. Všechny lidské Ads (a několik nehumánních Ads) kódují vysoce konzervovaný peptidový motiv PPxY v proteinu VI. V mutantě M1 byl tento motiv změněn na PGAA (obrázek 3) [104]. Jak divoký typ, tak mutant M1 účinně uvolňují protein VI po vstupu a spouštějí autofagii po prasknutí endozomální membrány. M1 mutantní virus však není schopen účinně uniknout do cytosolu a EM snímky ukázaly, že M1 mutantní viry jsou zachyceny v roztržených endozomech, na které se zaměřuje autofagie.

V důsledku toho se ukázalo, že mutantní virus M1 má silný defekt infekčnosti, který se obnoví po farmakologické a genetické inhibici autofagie. Studie ukázala, že viry divokého typu využívají svůj motiv PPxY k rekrutování ubikvitin ligázy NEDD4.2 a omezují zrání autofagozomů dostatečně dlouho na to, aby unikly do cytosolu. Kromě toho tato vlastnost umožňuje viru omezit jeho antigenní prezentaci [108]. Důležité je, že mutantní vektor M1 injikovaný myším vedl k mnohem silnější anti-vektorové imunitě a snížené odpovědi CD8 plus na kódovaný transgen, což ukazuje, že jednoduchá změna kapsidy může mít hluboký dopad na imunogenicitu kapsidy Ad5. Není známo, zda některá z dalších mutací proteinu VI ovlivňuje imunogenicitu. Přítomnost motivu PPxY ve viru L40Q však může vysvětlovat, proč si vektor zachovává relativně vysokou infekčnost navzdory defektu lýzy membrány [379,380]. Protože lýza endozomu je méně účinná a vektory L40Q končí částečně v lysozomálním kompartmentu, je možné, že vyvolaná imunitní odpověď je ještě odlišná od kapsid divokého typu, Ts1 nebo M1 Ad5.