Dva lidské metabolity zachraňují model Alzheimerovy choroby C. Elegans prostřednictvím odpovědi cytosolického rozloženého proteinu Ⅲ

Obr. 6 RTqPCR ukazuje, že karnosin a kyselina kynurenová aktivují cytosolickou nesbalenou proteinovou odpověď zvýšením hladin transkriptů J proteinů.dnj-12 adnj-19 za den 5 červů GMC.Červi GMC byli podáni 15μM každý z karnosinu a kyseliny kynurenové a jejich hladiny mRNA byly monitorovány pomocí RTqPCR.a Žádné známky jsme nepozorovalififinedochází ke změnám v hladinách mRNAhsf-1, hsp-90, ahsp-70. Léčba karnosinem signififivýrazně zvýšené hladiny transkriptů J-proteinů třídy A a B, DNJ-12, DNJ-13 a DNJ-19. Kyselina kynurenová však zvýšila pouze hladiny J-proteinů třídy A, DNJ-12 a DNJ-19. Změny v hladinách transkriptů J-proteinů korelují se změnami hladiny proteinů a jsou také podporovány našimi knockdown experimenty RNAi, kde DNJ-13 nevykazuje roli při odstraňování agregátů A 42 agregátů (obr.8a, b). b Testovali jsme také jakékoli změny v UPRER a UPRmt po podání karnosinu a kyseliny kynurenové, ale nenašli jsme žádné známkyfifinelze měnit značky,hsp-4ahsp-6, odpovídající aktivaci těchto drah, resp. Všechna data představují čtyři biologické replikáty dne 5cistancheGMC. Osa Y představuje podmínku/GEOMEAN, kde podmínka se vztahuje na každou z nichhsf-1, daf-21, hsp-70, dnj-12, dnj-13, dnj-19, hsp-4,ahsp-6a GEOMEAN je geometrický průměr dvou genů pro úklidrpb-2acdc-42pro normalizaci. Provedli jsme statistiku pomocí GraphPad Prism s použitím jednocestné ANOVA s Tukeyovým párovým porovnáním sloupců proti neošetřeným GMC (AD) červům pro každý stav léčený metabolity. Všechny chybové úsečky představují standardní chybu průměru (SEM). Významp-hodnoty jsou uvedeny nad sloupcovým grafem. ns označuje statisticky nevýznamné.

Kliknutím sem získáte další informace o Cistanche pro anti-Alzheimerovu chorobu

zvýšené hladiny molekulárních chaperonů jsme použili RNA interferenci (RNAi) ke snížení specifických genů a zeptali jsme se, zda to zrušilo účinky karnosinu nebo kyseliny kynurenové na agregaci a toxicitu A42. Pokud HSF-1 hraje roli při odstraňování agregátů A 42, pak knockdown HSF-1 by ukázal zjevný agregátně pozitivní fenotyp se zvýšenou paralýzou červů. To byl skutečně případ, kdy jsme provedli RNAi proti hsf-1 (viz část "Metody") a ošetřili GMC červy vodou, karnosinem a kyselinou kynurenovou (obr. 7). V prázdném vektoru L4440 vidíme, že jak karnosin, tak kyselina kynurenová čistí A 42 agregace a zvyšují celkovou zdatnost ve srovnání s červy RNAi, kde je hsf-1 sražen před léčbou těmito dvěma metabolity (obr. 7a) . U těchto knockdown červů GMC hsf-1 vidíme vyšší počet agregátů A 42 (obr. 7b, c) spolu s poklesem celkové zdatnosti (obr. 7a), i když jsou doplněny o metabolity. Celkově tedy vidíme, že příznivé účinky karnosinu a kyseliny kynurenové byly po sražení hsf-1 pomocí RNAi výrazně sníženy (obr. 7a). Všimněte si, že červi N2 divokého typu, léčení i neléčení, nevykazovali žádné zjevné rozdíly v celkové paralýze při knockdownu hsf-1 (obr. 7a radarový graf a sloupcový graf N2). Předchozí studie ukázaly, že úplný účinek RNAi může trvat déle než 48 hodin, než se ustaví významný knockdown fenotyp52,53, takže v den 5 jsou naše výsledky ve shodě. Jako další studie bude zajímavé prozkoumat vliv těchto metabolitů na časový průběh stárnutí u zdravých červů. Dále jsme jednotlivě srazili geny daf-21 (HSP90), hsp-1 (HSP70), dnj-13, dnj-12, dnj-19 a hsp-110 pomocí RNAi ke studiu následných účinků nacistanchemotility po léčbě kyselinou kynurenovou. DNAJ (HSP40) interaguje s HSP70 pro podporu refoldingu a HSP110 pro podporu disagregace. s kyselinou kynurenovou (obr. 8a, b). I když jsme nepozorovali žádné. Proto jsme také v naší studii RNAi uvažovali, že HSP110 má signifikantní účinky v každém knockdownovém stavu (obr. 8c) v den 5, kontrola celkových behaviorálních účinků a agregace A 42 v C. dospělosti po léčbě kyselinou kynurenovou. byl elegán. Pozorovali jsme zvýšené A42 agregáty v každém knock-signifikantní zvýšení celkové zdatnosti ve skupině s prázdným vektorem L4440 down GMC, která byla jinak potlačena ošetřením po ošetření kyselinou kynurenovou ve srovnání s neošetřenými GMC (AD) červy. To ukazuje, že kyselina kynurenová skutečně odstraňuje agregáty A 42, což je zprostředkováno těmito chaperony, což vede ke zlepšení motility červů exprimujících A 42-. Celkově naše data z western blotů, RTqPCR a RNAi naznačují, že léčba kyselinou kynurenovou a karnosinem zvyšuje hladiny HSF-1 vcistanchemodel AD, což má za následek transkripční upregulaci a tedy zvýšené hladiny J-proteinů DNJ- 12 a DNJ-19. Zdá se, že to spolupracuje a alespoň vyžaduje více základních chaperonů, jako jsou HSP70, HSP90 a HSP110, aby se chránilo proti agregaci A 42 a související toxicitě vcistanche(obr. 8c). Naše data společně ukazují, jak dva metabolity spouštějí cytosolickou rozloženou proteinovou odpověď v acistanchemodel AD k odstranění agregátů A42 a jejich související toxicity. Vzhledem k tomu, že hladiny těchto metabolitů mohou souviset s věkem nebo nemocí, navrhujeme, aby metabolity byly induktory ochranných buněčných odpovědí kontroly kvality, které chrání předagregace proteinů související s onemocněním(obr. 8c).

Obr. 7 Karnosin a kyselina kynurenová chrání proti agregaci A 42 a toxicitě způsobem závislým na HSF-1-. aRNAi knockdown hsf- ukazuje sníženou motilitu u GMC (AD) červů. L4440 je prázdný vektorový ovládací prvek. Při léčbě karnosinem a kyselinou kynurenovou je pozorováno významné zvýšení motility u fenotypu L4440 ve srovnání s poklesem ve skupinách hsf-1(RNAi). Kontrolní červi N2 nevykazují žádný významný účinek metabolitů karnosinu (Car) a kyseliny kynurenové (Kyn). Radarový graf zobrazuje celkověfitness porovnáním tří kvantitativních proměnných: rychlosti šneku (mm/s), ohybů za minutu a živého poměru, jak je vidět na jeho ose. Vložený sloupcový graf ukazuje, že snížení RNAi hsf-1 významně zhoršuje příznivé účinky karnosinu a kyseliny kynurenové. Statistiky byly provedeny za použití jednocestné ANOVA, Dunnettova vícenásobného srovnávacího testu s neošetřeným A 42 prázdným vektorem. ****p< 0.0001; ***p< 0.001; **p< 0.01; *p< 0.05 (b). A corresponding decrease in NIAD-4 aggregates is observed in AD worms treated with carnosine and kynurenic acid (Scale bars, 80μm). For NIAD-4 staining, approximately 11–30 animals were analyzed per condition. All error bars represent SEM. Statistics were performed using one-way ANOVA Dunnett's multiple comparisons test against the untreated Aβ42 empty vector.****p< 0.0001; ***p< 0.001; **p< 0.01; *p< 0.05.cRepresentative images of Aβ42 plaques show a signifificant clearance of aggregates in worms treated with carnosine (Car) and kynurenic acid (Kyn).hsf-1 knockdown worms even when treated with carnosine and kynurenic acid did not clear aggregates. White arrows point to NIAD-4-stained Aβ42 aggregates, which appear orange-red in color. For comparison, an empty RNAi vector L4440 GMC worm head is shown.

Obr. 8 Kyselina kynurenová zabraňuje toxicitě A 42 v a. Obrcistanchemodel AD působením molekulárních chaperonů. Při ošetření 10 μM kyselinou kynurenovou je cytosolická rozložená proteinová odpověď aktivována HSF-1 a zahrnuje HSP-90, HSP-70, HSP-110, HSP40 J proteiny DNJ{ {6}} a DNJ-19, ale ne DNJ-13 (panely a–c). Celková zdatnost (ohyby za minutu, rychlost a přežití) v acistanchemodel AD (červů GMC) je narušen i po ošetření 10 μM kyseliny kynurenové v hsf-1, daf-21, hsp-70, hsp{{4} }, dnj-12, dnj-13 a dnj{7}} ve srovnání s kontrolním L444{{30}} (c). Je pozorováno odpovídající zvýšení agregátů NIAD-4 (aab). Nevidíme však žádné agregáty při srážení dnj{{10}}, J-proteinu třídy B, což naznačuje, že nemusí hrát roli při odstraňování agregátů A 42. Bílé šipky ukazují na NIAD-4-obarvené agregáty A 42, které mají oranžově červenou barvu (měřítko, 80 μm). Pro testy motility, n=∼260–1000 zvířat na stav, pro test barvení NIAD-4 n=11–29 pro všechny stavy kromě knockdown hsp110, pro které n=4 . Všechny chybové úsečky představují SEM. a a c statistika byla provedena pomocí jednocestné ANOVA, Dunnettova vícenásobného srovnávacího testu proti kontrolní skupině L4440 AD léčené 10 uM kyselinou kynurenovou, ****p < 0,0001; ***p < 0,001; **p < 0,01; *p < 0,05. d Schéma mechanismu, kterým metabolity čistí proteinové agregáty zprostředkováním reakce tepelného šoku. Navrhujeme, že metabolická dysregulace tak může být hlavním faktorem přispívajícím k nerovnováze v homeostáze proteinů.

neléčené GMC (AD) červy. To ukazuje, že kyselina kynurenová skutečně odstraňuje agregáty A 42, což je zprostředkováno těmito chaperony, což vede ke zlepšení motility červů exprimujících A 42-. Celkově vzato naše data z western blotů, RTqPCR a RNAi naznačují, že léčba kyselinou kynurenovou a karnosinem zvyšuje hladiny HSF-1 v cistanche modelu AD, což vede k transkripční upregulaci, a tím ke zvýšeným hladinám DNJ{{ 3}} a DNJ-19 J-proteiny. Zdá se, že to spolupracuje a alespoň vyžaduje více základních chaperonů, jako je HSP70, HSP90 a HSP110, aby se chránilo proti agregaci A42 a související toxicitě v cistanche (obr. 8c). Naše data společně ukazují, jak dva metabolity spouštějí cytosolickou nesbalenou proteinovou odpověď v cistanche modelu AD, aby se odstranily agregáty A 42 a s nimi spojená toxicita. Protože hladiny těchto metabolitů mohou souviset s věkem nebo nemocí, navrhujeme, aby metabolity mohly být induktory ochranných buněčných odpovědí kontroly kvality, které chrání proti agregaci proteinů souvisejících s onemocněním (obr. 8c).

Diskuse

Ukázali jsme, jak síť proteinové homeostázy, která zahrnuje několik vzájemně závislých mechanismů včetně molekulárních chaperonů, detoxikačních enzymů a mechanismů clearance proteinů54, může být modulována endogenními metabolity. Uvedli jsme knihovnu endogenních metabolitů, u kterých lze dále zkoumat působení na různé buněčné mechanismy spojené s homeostázou proteinů, a charakterizovali jsme dva metabolity, karnosin a kyselinu kynurenovou, pro jejich roli při odstraňování proteinových agregátů. Tyto dva metabolity jsou schopny inhibovat agregaci A 42 v cistanche modelu AD spuštěním cytosolické rozbalené proteinové odpovědi zprostředkované HSF-1 a zvýšenými hladinami DNJ-12 a DNJ-19 J -proteiny. Očekáváme, že další studie odhalí, jak tyto metabolity zvyšují hladiny HSF-1 a tím regulují jeho funkci.

Navrhujeme model pro obnovu proteinové homeostázy endogenními metabolity (obr. 8c), kde dva endogenní metabolity regulují HSF-1 a downstream chaperony, aby vyčistily agregáty A 42. Pokud jde o odstraňování agregátů, je pravděpodobné, že (1) agregáty jsou hromadně odstraňovány autofagií, protože autofagie byla spojena s aktivitou HSF-1 Kumsta a spolupracovníků55, nebo (2) zvýšené chaperony podporují obrat A 42 proteinu, čímž se potlačí tvorba agregátů. Nemůže to být tak, že chaperony pouze blokují agregaci, protože nevidíme odpovídající zvýšení hladin rozpustného A 42. Karnosin je dipeptid, který se přirozeně vyskytuje v mozku, ledvinách a kosterních svalech ryb, ptáků a savců56. Postmitotické dospělé buňky mají vyšší koncentrace karnosinu než aktivně se dělící buňky, i když důvody nejsou jasné57,58; syntéza karnosinu je spojena pouze s konečnými stádii zrání gliových buněk. Je také přítomen pouze v postmitotických neuronech sítnice, když energetický metabolismus přechází z glykolýzy na oxidativní fosforylaci56. Zajímavé je, že karnosin má také prospěšný, ale blíže nespecifikovaný organizační účinek na mitochondrie; jeho hladiny se mění s ohledem na energetický metabolismus buňky ve stárnutí56. Dohromady tyto studie naznačují, že karnosin má příznivé účinky na buněčnou aktivitu.

Vidíme, že u onemocnění je karnosin downregulován (tabulka 1) a naše studie ukazují, že suplementace zachraňuje fenotyp onemocnění AD. Jeho následný metabolismus při suplementaci je problémem zdůrazněným pro budoucí studium. Objasnění mechanismu jeho působení v kontextu čištění proteinových agregátů je proto užitečné při využití jeho terapeutického potenciálu. Kyselina kynurenová je metabolit tryptofanu, který má protizánětlivé a imunosupresivní funkce59,60 kromě toho, že působí jako antagonista ovlivňující všechny ionotropní glutamátové receptory včetně NMDA, AMPA a kainitových receptorů61. Ačkoli se předpokládá, že kyselina kynurenová působí neuroprotektivně u velké většiny neurologických stavů, její mechanismy účinku nebyly plně objasněny. Uvádí se, že hladiny kyseliny kynurenové a souvisejících metabolitů jsou dysregulované u lidí s poruchami spánku62,63 a depresí64, což ukazuje jak upregulaci, tak downregulaci (tabulka 1). Bylo hlášeno, že vzorce spánku/bdění jsou v AD65 narušeny. Ačkoli byla deprese spojována jako rizikový faktor pro rozvoj AD, celogenomová asociační studie nenaznačila žádné významné genetické překrývání mezi těmito dvěma chorobami66; zajímavé je, že překrývání lze skutečně vysvětlit narušením homeostázy neurotransmiterů67. Dále bylo hlášeno, že vytrvalostní cvičení zvyšuje plazmatické hladiny kyseliny kynurenové 68. Dříve se předpokládalo, že kynureninová dráha je regulátorem proteinové toxicity související s věkem69.

V modelu cistanche van der Goot et al. ukázat, že vyčerpání tryptofanu 2,3-dioxygenázy (na-2), prvního enzymu v kynureninové dráze degradace tryptofanu, zvyšuje hladiny tryptofanu a potlačuje toxicitu proteinů náchylných k agregaci; navíc ukazují, že podávání L-tryptofanu také potlačuje toxicitu69. V této studii ukazujeme záchranu fenotypu onemocnění AD suplementací kyseliny kynurenové; je známo, že u cistanche a savců je kyselina kynurenová generována v prostorově omezených vzorcích v nervovém systému, takže si myslíme, že endogenní modifikace jejích hladin tkáňově specifickým způsobem dále poskytne pohled na to, jak její endogenní hladiny ovlivňují cílové proteiny . Naše výsledky o jeho mechanismu účinku na čištění proteinových agregátů vrhají světlo na systematické využívání jeho terapeutického potenciálu. Celkově vzato naše výsledky zdůrazňují potřebu podrobněji prozkoumat účinek abnormální homeostázy metabolitů na vývoj poruch nesprávného skládání proteinů. Závěry Výsledky, které jsme uvedli v této studii, podporují názor, že homeostáza metabolitů a homeostáza proteinů jsou úzce propojeny a nezbytné pro celkovou buněčnou homeostázu. Zejména homeostáza metabolitů může být narušena způsobem souvisejícím s věkem a může být spojena s nemocemi nesprávného skládání proteinů. Naše výsledky obecně podporují názor, že obnovení rovnováhy buněčné homeostázy prostřednictvím udržování homeostázy metabolitů může nabídnout preventivní přístupy pro neurodegenerativní onemocnění.

Metody

Identification of endogenous metabolites in the HMDB. We used 200 molecules as starting points, hereby referred to as seeds, from Calamini et al. 34 to calculate fragments using a method reported by Joshi et al. 35. We screened the HMDB using similarity and Tanimoto coefficients (>0.6) počátečních semen. Získané shody byly filtrovány, pokud splňovaly následující podmínky: endogenní, kvantifikované a detekované, detekované v CSF. Dále jsme vypočítali, zda byly upregulovány nebo downregulovány na základě normálních vs. abnormálních fyziologických koncentrací uváděných v HMDB. Tento krok byl proveden rešerší v literatuře k posouzení jejich asociace s onemocněním, kde jsme seřadili metabolity na základě asociačního skóre, které jsme operativně definovali jako počet studií, ve kterých byl metabolit hlášen jako dysregulovaný u AD. Za tímto účelem jsme hledali v PubMed "Alzheimerova choroba A metabolit", kde "metabolit" odkazuje na každý metabolit v doplňkových údajích 1.

Exprese, purifikace a příprava vzorků peptidu A 42 pro kinetické experimenty.

Rekombinantní peptid A 42 (MDAEFRHDSGYEVHHQKLVF FAEDVGSNKGA IIGLMVGGVVIA) byl exprimován v kmeni Escherichia coli BL21 Gold (DE3) (Stratagene, CA, USA) a purifikován, jak bylo popsáno dříve70. Stručně, v postupu čištění byly buňky E. coli sonikovány a inkluzní tělíska byla následně rozpuštěna v 8 M močovině. Diethyl-aminoethylcelulózová pryskyřice byla poté použita k provedení iontoměničové chromatografie a shromážděný protein byl lyofilizován. Tyto frakce byly dále purifikovány pomocí kolony Superdex 75 26/60 (GE health, IL, USA) a frakce obsahující rekombinantní protein byly spojeny, zmraženy a znovu lyofilizovány. Roztoky monomerního proteinu byly připraveny rozpuštěním lyofilizovaného peptidu A 42 v 6 M GuHCl a purifikovány v 20 mM pufru fosforečnanu sodného, ​​20}0 uM EDTA, pH 8,0 za použití Superdex {{15} }/300 kolona (GE Healthcare) při rychlosti 0,5 ml/min. ThT byl přidán z 2 mM zásobního roztoku, čímž byla získána konečná koncentrace 20 uM. Všechny vzorky proteinů byly získány ze stejného jediného přípravku a poté pipetovány do zkumavek Eppendorf s nízkou vazbou. Každý vzorek byl poté pipetován do několika jamek 96-jamky s poloviční plochou, nízkou vazbou, čirým dnem a PEG potahovací destičkou (Corning 3881), 80 ul na jamku, v nepřítomnosti a přítomnosti různých molárních ekvivalenty karnosinu nebo kyseliny kynurenové, čímž se získá konečná koncentrace 1 procento DMSO (v/v). Agregace A 42 (při koncentraci 2 uM70,71,72 byla zahájena umístěním 96-jamkové destičky do čtečky destiček (Fluostar Omega nebo Fluostar Optima od BMG Labtech, Aylesbury, UK) při 37 stupních v klidu ThT FL fluorescence byla monitorována v triplikátech na vzorek, jak bylo měřeno pomocí spodní optiky s 440 nm excitačním a 480 nm emisním filtrem. Poté byly získány kinetické stopy pro každou jamku a poté zpracovány na frakci fibrilární hmoty normalizací fluorescence ThT FL hodnoty v daném čase t proti počáteční hodnotě fluorescence ThT FL (která se bere jako 0) a konečné hodnotě fluorescence ThT FL na konci reakce (která se bere jako 1,0).

Cistancheexperimenty Média. Pro propagaci cistanche73 byly použity standardní podmínky. Stručně, zvířata byla synchronizována chlornanovým bělením, vylíhnuta přes noc v M9 (3 g/l KH2P04, 6 g/l Na2HP04, 5 g/l NaCl, 1 uM MgS04) pufru a následně kultivována při 20 stupních na médiu pro růst nematodů (NGM ) (CaCl2 1 mM, MgSO4 1 mM, cholesterol 5 µg/ml, 250 µM KH2PO4 pH 6, agar 17 g/l, NaCl 3 g/l, kasein 7,5 g/l) naočkováno s kmenem E. coli OP50. Nasycené kultury OP50 byly pěstovány naočkováním 50 ml média LB (trypton 10 g/l, NaCl 10 g/l, kvasničný extrakt 5 g/l) s OP50 a inkubací kultury po dobu 16 hodin při 37 stupních. NGM destičky byly naočkovány bakteriemi přidáním 350 ul nasyceného OP50 na každou destičku a ponecháním destiček při 20 stupních po dobu 2–3 dnů. 3. den po synchronizaci byla zvířata umístěna na NGM plotny obsahující 5-flfluor-2′deoxy-uridin (FUDR) (75 uM), aby se inhiboval růst potomstva, a teplota byla zvýšena na 24 stupňů . Kmeny. Všechny kmeny byly získány z Caenorhabditis Genetics Center v Minnesotě, které je podporováno NIH P40 OD010440. Pro tyto experimenty byly použity dva kmeny. Lidský kmen exprimující A citlivý na teplotu dvIs100 [unc-54p::A-beta-1-42::unc-54 3′-UTR plus mtl-2p::GFP ] (GMC101), ve kterém mtl-2p::GFP způsobuje střevní expresi GFP a unc{56}}p::A-beta- 1-42 exprimuje lidský peptid A 42 v plné délce ve svalových buňkách tělesné stěny. Zvýšení teploty nad 20 stupňů ve stadiu L4 nebo dospělého způsobuje paralýzu kvůli agregaci A 42 ve svalu tělesné stěny. Kmen N2 byl použit pro červy divokého typu.

Metabolitem potažené destičky. Alikvoty NGM média byly autoklávovány a nality a naočkovány 350 ul OP50 kultury a pěstovány přes noc. Po inkubaci po dobu až 3 dnů při teplotě místnosti byly přidány alikvoty L-karnosinu (karnosinu) nebo kyseliny kynurenové (nebo jiných metabolitů) rozpuštěné ve vodě v různých koncentracích. Destičky NGM obsahující FUDR (75 uM, pokud není uvedeno jinak) byly naočkovány 2,2 ml alikvoty sloučeniny rozpuštěné ve vodě ve vhodné koncentraci. Destičky se poté umístily do digestoře s laminárním prouděním při pokojové teplotě, aby se vysušily a červi se přenesli na destičky potažené metabolitem v larválním stádiu L4. Šest metabolitů bylo zpočátku testováno v kapalném médiu41. Karnosin byl připraven při teplotě místnosti na zásobní koncentraci 5 mM. Kyselina kynurenová byla připravena v 5 mM a rozpouštění sloučeniny bylo provedeno při 100 stupních. Zásoby sloučeniny byly až do použití udržovány při -20 stupních a nikdy nebyly rozmraženy více než jednou.

Automated motility assay. At different ages, animals were washed off the plates with M9 buffer and spread over an OP50 un-seeded 6 cm plate, after which their movements were recorded at 20 fps using a recently developed microscopic procedure for 60–90 s41,74. Approximately 100–600 animals were counted per condition at each indicated time point, unless otherwise specified for >600 (doplňková data 2). Software pro automatizované sledování motility zabraňuje podcenění chyb způsobených kolizemi červů a překrýváním; detekuje celkový počet červů a také poskytuje horní limit chyb tím, že bere v úvahu maximální počet červů přítomných v jednom snímku ve stejnou dobu (doplňková data 2)41.

barvení a zobrazování NIAD-4. Roztok NIAD-4 byl připraven rozpuštěním ve 100% DMSO na 1 mg/ml. Před inkubací červů bylo vytvořeno ředění 1/1000 v M9. Po screeningu pomocí Wide-Field Nematode Tracking Platform bylo ~300 červů za podmínek shromážděno v médiu M9 a centrifugováno při 20 stupních při 2000 otáčkách za minutu po dobu 2 minut na peletu. Poté byl k peletě přidán 1 ml zředěného roztoku NIAD-4 v M9 a umístěn za mírného třepání (80 ot./min) po dobu 6 hodin. Červi pak byli přeneseni na nenaočkované NGM plotny a inkubováni při 20 stupních po dobu dvanácti hodin. Červi se znovu promyli z destiček médiem M9, odstředili, promyli 10 ml M9 a resuspendovali ve 2 ml M9. Po gravitační sedimentaci bylo 15 ul roztoku červů naneseno na 4% agarózové polštářky. Pro anestetizaci zvířat byly přidány 4 ul 40 mM NaN3 a následně skleněné krycí sklíčko. Červi byli zobrazeni pomocí Zeiss Axio Observer

Fluorescenční mikroskop A1 FL (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Německo) s objektivem ×20 a filtrem 49004 ET-CY3/TRITC (Chroma Technology Corp, VT, USA). Byla použita doba expozice 1000 ms. Nominální zvětšení bylo × 40 a snímky byly pořízeny pomocí kamery Evolve 512 Delta EMCCD s vysokou kvantovou účinností (Photometrics, Tucson, AZ, USA). Přibližně 11–30 zvířat bylo analyzováno na podmínky, pokud není uvedeno jinak, a statistiky byly provedeny pomocí jednocestné ANOVA proti neléčené skupině.

Všechny zde uvedené statistiky byly provedeny pomocí GraphPad Prism. Kvantifikace byla provedena pomocí ImageJ (NIH, MD, USA) pro stanovení střední intenzity ve stupních šedi v hlavě každého zvířete. "Ohnivý" filtr byl v ImageJ použit pro vizualizaci NIAD-4-zabarvených agregátů. Celková intenzita (průměrná hodnota šedé) hlavy červa byla vypočtena nastíněním oblasti hlavy červa od nosu k hltanu. V den 5 je maximální průměr červů přes hlavu 80 µm. Potom bylo vypočteno průměrné (tři odečtené hodnoty) pozadí stejné oblasti jinde na snímku a odečteno od celkové průměrné hodnoty šedé hlavy červa. Výsledná intenzita, po odečtení pozadí, poskytuje údaje o NIAD-4 obarvených agregátech, které vypadají oranžově-červeně a jsou označeny šipkami na příslušných panelech obrázků. Westernové skvrny. Přibližně 3000 červů za podmínek bylo lyžováno v PBS.

K lyzátu byl přidán koktejl inhibitorů proteázy (Sigma MS-SAFE Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail). Anti-tubulin (monoklonální anti-alfa tubulin protilátka produkovaná u myší, Sigma, T6074) byl použit pro detekci konstitutivně exprimovaného tubulinu pro normalizaci koncentrací proteinů. Protilátka HSF1 byla získána od Veena Prahlad (Iowa), HSP90 (králičí anti-DAF-21) od Patricie Van Oosten-Hawle (Leeds), HSP40 (anti-DNJ-12, DNJ-13 a DNJ-19, všechny chované na králících) od Janine Kirstein (Berlín), HSP70 od Johna Labbadia (UCL, Londýn).

Byly použity myší a králičí sekundární protilátky (konjugované sekundární protilátky Alexa Fluor 488-). Všechny kvantifikace byly provedeny pomocí softwaru ImageJ za účelem stanovení intenzity proteinového pásu pomocí denzitometrie.3-4 Pro jednotlivé podmínky byly použity technické replikáty a statistiky byly provedeny pomocí dvoucestné ANOVA proti neošetřenému divokému typu (N2) a ošetřené A 42 ( GMC) červi, skupiny. Všechny statistiky byly provedeny pomocí GraphPad Prism.

RNA interference. Bakterie nesoucí prázdný vektor (L4440) nebo vektor obsahující hsf-1 dsRNA byly pěstovány při 37 stupních přes noc v LB obsahujícím 100 ug/ml ampicilinu. Po růstu přes noc byly kultury indukovány 5 mM IPTG a pěstovány další 3 hodiny při 37 stupních. Kultury RNAi se nechaly ochladit na teplotu místnosti a poté se naočkovaly na plotny NGM obsahující 100 ug/ml ampicilinu a 1 mM IPTG. Bakteriální trávníky byly poté ponechány sušit 4 dny na lavičce. Kontrolní, hsf{10}} a downstream chaperonové RNAi klony byly získány z Ahringer RNAi knihovny a byly před použitím sekvenčně validovány. Kromě toho bylo v předchozích publikacích ukázáno, že tyto klony srazily své zamýšlené cíle48,75,76.

Extrakce RNA, syntéza cDNA a RTqPCR. Přibližně v 700, 5. den, byli dospělí červi resuspendováni v 250 ul Trizolu a homogenizováni trojnásobným vortexováním po dobu 10 min nepřetržitě s 20minutovou přestávkou periody na ledu mezi každým kolem vortexování. Byl přidán chloroform (1/5 objemu) před tím, než byly vzorky třepány po dobu 15 s ručně, a poté centrifugovány při 13,000×g po dobu 15 minut. Vodná fáze byla shromážděna a smíchána se stejným objemem 70% ethanolu. RNA pak byla purifikována pomocí soupravy RNeasy podle pokynů výrobce. cDNA byla poté syntetizována z 1 ug celkové RNA za použití iScript cDNA syntézních činidel (BioRad). RTqPCR byla provedena pomocí BioRad Advanced SYBR green master mix a BioRad CFX96 termocykleru s použitím primerů popsaných v tabulce 2. Ke kvantifikaci genové exprese byla použita metoda standardní křivky a relativní exprese genů zájmu byla normalizována na provozní geny rpb{{15} } a cdc{16}}. Statistika a reprodukovatelnost. Data prezentovaná jako průměr ± SEM byla testována na významnost v jednocestné ANOVA za použití GraphPad Prism. Post-hoc srovnání byla provedena pomocí Dunnettova mnohočetného srovnání (obr. 3, 5, 7 a 8) a Tukeyho párového srovnání (obr. 6). Pro kinetické profily agregace na obr. 4 jsou chybové úsečky znázorněny ze tří technických replikátů. Velikost vzorku: (a) testy motility n=100–600 červů, pokud není uvedeno jinak (b) western bloty n=~3000 červů pro každý experimentální replikát, (c) agregace NIAD{29}} test n=11–30 zvířat na stav pro GMC a n=~10–12 zvířat na kontrolu (N2) a (d) qPCR n=4 biologických replikátů. Všechny screeningy, včetně RNAi, byly prováděny pomocí sledovače motility červů, který zaslepoval skupinovou identitu a poté se porovnával. Významné výsledky byly označeny podle kritických p-hodnot: ****p < 0,0001; ***p < 0,001; **p < 0,01; *p < 0,05.

Reference

1. De Strooper, B. & Karran, E. Buněčná fázeAlzheimerova choroba. Cela 164, 603–615 (2016).

2. Knowles, TP, Vendruscolo, M. & Dobson, CM Amyloidní stav a jeho souvislost s nemocemi nesprávného skládání proteinů. Nat. Mol. Cell Biol. 15, 384–396 (2014).

3. Selkoe, DJ & Hardy, J. The amyloid hypothesis ofAlzheimerova chorobave 25 letech. EMBO Mol. Med. 8, 595–608 (2016).

4. Hipp, MS, Park, SH & Hartl, FU Porucha proteostázy u nemocí s chybným skládáním a agregací proteinů. Trends Cell Biol. 24, 506–514 (2014).

5. Morimoto, RI & Cuervo, AM Proteostáza a proteom stárnutí ve zdraví a nemoci. J. Gerontol. A 69 (Suppl. 1), S33–S38 (2014).

6. Gomes, AP & Blenis, J. Nexus pro buněčnou homeostázu: souhra mezi metabolickými a signálními transdukčními cestami. Curr. Opin. Biotechnol. 34, 110–117 (2015). 7. Wilson, DF Regulace buněčného metabolismu: programování a udržování metabolické homeostázy. J. Appl. Physiol. (1985) 115, 1583–1588 (2013).

8. Fontana, L. & Partridge, L. Podpora zdraví a dlouhověkosti prostřednictvím stravy: od modelových organismů k lidem. Cela 161, 106–118 (2015).

9. Longo, VD & Mattson, MP Fasting: molekulární mechanismy a klinické aplikace. Cell Metab. 19, 181–192 (2014).

10. Sinclair, DA Směrem k jednotné teorii kalorického omezení a regulace dlouhověkosti. Mech. Aging Dev. 126, 987-1002 (2005).

11. Burkewitz, K., Zhang, Y. & Mair, WB AMPK ve spojení energetiky a stárnutí. Cell Metab. 20, 10–25 (2014).

12. Johnson, SC, Rabinovich, PS & Kaeberlein, M. mTOR je klíčovým modulátorem stárnutí a nemocí souvisejících s věkem. Příroda 493, 338–345 (2013).

13. Salminen, A. & Kaarniranta, K. AMP-aktivovaná proteinkináza (AMPK) řídí proces stárnutí prostřednictvím integrované signální sítě. Ageing Res. Rev. 11, 230–241 (2012).

14. Zoncu, R., Efeyan, A. & Sabatini, DM mTOR: od integrace signálů růstu k rakovině, cukrovce a stárnutí. Nat. Mol. Cell Biol. 12, 21–35 (2011).

15. Burte, F. a kol. Narušená mitochondriální dynamika a neurodegenerativní poruchy. Nat. Rev. Neurol. 11, 11–24 (2015).

16. Bush, AI Metallobiologie Alzheimerovy choroby. Trendy Neurosci. 26, 207-214 (2003).

17. D'Amelio, M. & Rossini, PM Vzrušivost mozku a konektivita neuronových sestav u Alzheimerovy choroby: od zvířecích modelů po lidské nálezy. Prog. Neurobiol. 99, 42–60 (2012).

18. Freer, R. a kol. Proteinová homeostáza ve zdravých mozcích rekapituluje zranitelnost tkání vůči Alzheimerově chorobě. Sci. Adv. 2, 1600947 (2016).

19. Ishii, M. & Iadecola, C. Metabolické a nekognitivní projevy Alzheimerovy choroby: hypotalamus jako viník i cíl patologie. Cell Metab. 22, 761–776 (2015).

20. Knobloch, M. & Jessberger, S. Metabolismus a neurogeneze. Curr. Opin. Neurobiol. 42, 45–52 (2017).

21. Labbadia, J. & Morimoto, RI Biologie proteostázy při stárnutí a nemocech. Annu. Biochem. 84, 435–464 (2015).

22. Lovell, MA & Markesbery, WR Oxidační poškození DNA u mírné kognitivní poruchy a pozdního stadia Alzheimerovy choroby. Nucleic Acids Res. 35, 7497-7504 (2007).

23. Menzies, FM, Fleming, A. & Rubinsztein, DC Kompromitovaná autofagie a neurodegenerativní onemocnění. Nat. Neurosci. 16, 345–357 (2015).

24. Palop, JJ & Mucke, L. Neuronální dysfunkce indukovaná amyloidem beta u Alzheimerovy choroby: od synapsí k neuronovým sítím. Nat. Neurosci. 13, 812–818 (2010).

25. Weissman, L. a kol. Defektní oprava excize DNA bází v mozku od jedinců s Alzheimerovou chorobou a amnestickým mírným kognitivním poškozením. Nucleic Acids Res. 35, 5545–5555 (2007).

26. Winner, B. & Winkler, J. Neurogeneze dospělých u neurodegenerativních onemocnění. Cold Spring Harb. Perspektiva. Biol. 7, a021287 (2015).

27. Wyss-Coray, T. Zánět u Alzheimerovy choroby: hnací síla, přihlížející nebo prospěšná reakce? Nat. Med. 12, 1005–1015 (2006).

28. Yao, J. a kol. Mitochondriální bioenergetický deficit předchází Alzheimerově chorobě u myších modelů Alzheimerovy choroby. Proč. Natl Acad. Sci. USA 106, 14670–14675 (2009).

29. Chiti, F. & Dobson, CM Chybné skládání proteinů, tvorba amyloidu a lidské onemocnění: shrnutí pokroku za poslední desetiletí. Annu. Biochem. 86, 27–68 (2017).

30. Benilová, I., Karran, E. & De, B. Strooper, toxický oligomer Abeta a Alzheimerova choroba: císař, který potřebuje oblečení. Nat. Neurosci. 15, 349–357 (2012).

31. Gidalevitz, T., Prahlad, V. & Morimoto, RI Stres chybného skládání proteinů: od jednotlivých buněk k mnohobuněčným organismům. Studený jarní Harb. Perspektiva. Biol. 3, a009704 (2011).

32. Walter, P. & Ron, D. The unfolded protein response: from stress pathway tohomeostatická regulace. Science 334, 1081–1086 (2011).

Požádejte o více:E-mail:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950