TUNEL Assay: Výkonný nástroj pro hodnocení poškození ledvin

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstraktní:Test terminálního deoxynukleotidyltransferázy dUTP nick-end značení (TUNEL) je dlouho zavedeným testem používaným k detekci fragmentace DNA spojené s buněčnou smrtí (3'-OH konce DNA) endonukleázami. Protože tyto enzymy jsou zvláště aktivní v ledvinách, TUNEL se široce používá k identifikaci a kvantifikaci fragmentace DNA a buněčné smrti v kultivovanýchledvina buňky a zvířecí a lidské ledviny vyplývající ztoxické nebo hypoxické poškození. Časná charakterizace TUNEL jako apoptotického testu vedla k četným chybným interpretacím mechanismůledvinová buňka zranění.Přesto je TUNEL stále oblíbenějšíporanění ledvinhodnocení, protože může být univerzálně použit v kultivovaných a tkáňových buňkách a pro všechny mechanismy buněčné smrti. Kromě toho je citlivý, přesný, kvantitativní, snadno se spojuje s konkrétními buňkami nebo tkáňovými kompartmenty a může být kombinován s imunohistochemií, aby umožnil spolehlivou identifikaci buněčných typů nebo pravděpodobných mechanismů buněčné smrti. Tradičně byla analýza TUNEL omezena na přítomnost nebo nepřítomnost signálu TUNEL. Další informace o mechanismu buněčné smrti však lze získat z analýzy vzorů TUNEL.

léčba poruchy ledvin sexuálního vzrušení pomocí doplňkového prášku cistanche

Úvod DNA je jediná molekula v buňce, kterou lze opravit, ale po poškození ji nelze zcela znovu syntetizovat. Destrukce DNA je jednou z konečných fází vícestupňového procesu buněčné smrti, který je potenciálně reverzibilní až do bodu terminální fragmentace DNA. Proto je posledně jmenovaný společný atribut a mechanistický marker ireverzibilní buněčné smrti [1,2]. Fragmentace DNA spojená se smrtí buněk je obvykle „vizualizována“ testem terminálního deoxynukleotidyltransferázy dUTP nick-end značení (TUNEL), DNA laddering nebo kometovým testem [3]. Elektroforéza v pulsním poli [4] a analýza syntézy s náhodným oligonukleotidem (ROPS) [5] jsou dvě další zřídka používané sekundární analýzy. Použití kometového testu je omezeno pouze na in vitro (kultivované buňky) a jeho kvantifikace je pracná [6]. Provádění kometových testů v izolovaných buněčných jádrech je možné, ale je spojeno s dalšími matoucími faktory během izolace jader. Druhý, DNA laddering assay, není kvantitativní metodou, a původní naděje, že žebříkový vzor vs. nátěr by rozlišoval mezi apoptózou a nekrózou, v daném pořadí, byla rozptýlena, protože se tento přístup ukázal jako nespolehlivý [7]. Ze tří hlavních metod je TUNEL nejcitlivější, časově nejméně náročný a nejuniverzálněji použitelný. Může být použit v kultivovaných buňkách a tkáních a pro všechny mechanismy buněčné smrti. Je přesná, kvantitativní, snadno se spojuje s konkrétními buňkami nebo tkáňovými kompartmenty a lze ji kombinovat s imunohistochemií, aby umožnila spolehlivou identifikaci buněčných typů nebo mechanismů poškození buněk spojených s TUNEL-pozitivními signály [2].

Zlomy DNA měřitelné pomocí TUNELu jsou produkovány převážně apoptotickými endonukleázami. Nejaktivnější endonukleázy v ledvině jsou deoxyribonukleáza 1 (DNáza I) a endonukleáza G (EndoG) [8–10]. DNáza I je nejaktivnější a nejhojnější apoptotickou endonukleázou u savců [11]. Ledviny, slinné žlázy, slinivka a střevo jsou orgány, o kterých je známo, že produkují vysoké množství DNázy I. Epiteliální buňky ve slinných žlázách, slinivce a střevě vylučují DNázu I jako trávicí enzym v trávicím traktu. Některá buněčná DNáza I bojuje proti „cizí“ DNA napadající hostitelské buňky [12]. Nevylučovaná DNáza I představuje skryté nebezpečí pro DNA hostitelské buňky, ale normálně DNázy nepůsobí na DNA hostitelské buňky až do poškození nebo smrti buňky. V ledvinách je DNáza I vylučována tubulárními epiteliálními buňkami, pravděpodobně ke zničení virů a bakterií v moči. Tato funkce pravděpodobně probíhá ve spojení s proteinázami, zejména meprinem, který je hlavní proteinázou v moči [13]. I když je protektivní proti infekci, přítomnost vysoce aktivní DNázy v ledvinách činí tento orgán náchylným k poranění, přičemž je známo, že aktivita DNázy je cytotoxická pro hostitelské buňky. DNázy podporují buněčnou smrt vyvolanou toxickými nebo hypoxickými stimuly a ničí všechny DNA buňky hostitelské ledviny uvolněné v důsledku buněčné smrti.

Ledvinyjsou filtrační orgány, které odstraňují toxické sloučeniny z těla. Vysoká aktivita DNázy I v ledvinách činí ledvinové buňky velmi citlivými na poškození toxickými sloučeninami a jejich metabolickými produkty. Díky tomu je TUNEL nejvhodnější a použitelnou metodou pro měření poškození ledvin. V tomto přehledu se zaměříme na TUNEL jako široce používaný, informativní a přesný test pro měření buněčné smrti a poškození tkáně v ledvině. Budeme diskutovat o aspektech TUNEL, jak se vztahuje na onemocnění ledvin a poranění, a identifikujeme vlastnosti, techniky a nedostatečně využívané vlastnosti TUNELu, abychom podpořili produktivní a vhodné použití tohoto výkonného testu ve výzkumu, diagnostice a terapii onemocnění ledvin. Budeme také diskutovat o různých obrazových vzorech TUNEL, které mohou být spojeny s mechanismy buněčné smrti. Body uvedené v tomto přehledu jsou široce použitelné pro použití TUNELu v jiných orgánech než ledviny.

klíčová slova:TUNEL; buněčná smrt; ledviny; DNázy; endonukleázy; poranění tkáně

Principy TUNELUTest TUNEL byl vyvinut v roce 1992 Gorczycou et al. [14] a Gavrieli et al. [15] za použití značení fluorochromem a avidin-peroxidázou. V té době byla zoufalá potřeba nových metod pro hodnocení apoptózy a TUNEL tuto mezeru úspěšně zaplnil. TUNEL, původně uváděný na trh jako test zlomů DNA během apoptózy nebo související s apoptózou [14,16], se při absenci lepších testů rychle stal standardním testem apoptózy [17,18]. Výzkumníci však téměř okamžitě rozpoznali, že TUNEL bez rozdílu měří jakoukoli fragmentaci DNA, nejen tu spojenou s apoptózou [19–21]. Nicméně potřeba apoptotických testů byla tak velká, že vzácné zprávy o tom, že TUNEL byl nespecifický pro apoptózu, byly obecně ignorovány. To vedlo k obrovskému množství falešně pozitivních zpráv o apoptóze v ledvinách a dalších orgánech, a to do té míry, že až 20 procenta celkových buněk byla hlášena jako apoptická i bez poškození [22–25], když došlo ke změnám jako malá jako 0,01 procenta by mohla být statisticky významným důkazem poškození tkáně.

Test TUNEL zažívá v posledních letech renesanci od konce boomu studií apoptózy před několika lety. Naše vyhledávání článků v časopisech PubMed obsahující výrazy „ledviny“ a „TUNEL“ přineslo více než 1500 výsledků od roku 1992 do roku 2020. V roce 2019 bylo publikováno 170 článků, což je nejvyšší počet za jediný rok za posledních 28 let (obr. S1) a který tvoří většinu článků zkoumaných pro tuto recenzi. Četné studie používaly TUNEL-pozitivitu jako univerzální měřítko buněčné smrti spojené s fragmentací DNA u jiných typů buněčné smrti kromě apoptózy. Například ferroptózu, nově objevenou formu programované, neapoptotické buněčné smrti spouštěnou oxidačním poškozením, ke kterému dochází u myší během renální ischemie-reperfuze (IR), lze detekovat pomocí TUNEL [26]. Ukázalo se, že pyroptóza, což je zánětlivá forma programované buněčné smrti, která se liší od apoptózy a nekrózy, je spojena s TUNEL-pozitivními signály [27,28]. Pozitivita TUNEL byla pozorována během nekroptózy, která přispěla k progresivní depleci buněk renálních tubulů u potkanů ​​podrobených subtotální nefrektomii [29]. V ledvinách a dalších tkáních byly pozitivní signály TUNEL nalezeny u nekrózy [30,31], dysregulované autofagie [32–35], anoikis [36,37], mitotické katastrofy [35,38], autolýzy [39], Pautolýzy [39], proptóza [40] a aponeuróza [30], což ukazuje, že TUNEL je skutečně univerzální test na nevratnou buněčnou smrt.

Test TUNEL je založen na značení 3'OH konců DNA enzymem specifickým pro 3'OH konec, terminální deoxynukleotidyltransferázou (TdT) (obrázek). Použití DNA polymerázy nebo DNA polymerázy Klenowova fragmentu místo TdT může pomoci určit typ 3'OH konců (zářezy, mezery nebo přečnívající oligo), protože DNA polymerázy potřebují templát (opačný řetězec DNA), a proto nebudou značit. visící nebo vyčnívající konce DNA. Je důležité si uvědomit, že produkce konců DNA 3ZOH není jedinečná pro apoptotické (DNA-degradující) endonukleázy. Konce 3'OH DNA jsou hlavním „komunikátorovým“ signálem, společným jmenovatelem většiny enzymů DNA. Jsou produkovány a využívány téměř všemi enzymy DNA v eukaryotech, včetně reparačních (apurinových/apyrimidinových, AP) endonukleáz, exonukleáz, DNA polymeráz, DNA ligáz, DNA transferáz a topoizomeráz. Navíc konjugáty 3'Id 3z-cukr nebo 3z-protein mohou být převedeny na 3'OH konce pomocí fosfatáz, glykosyláz a proteináz, v daném pořadí. Proto je pro úspěšnou aplikaci TUNEL a interpretaci jeho výsledků nezbytné přesné pochopení toho, co se měří.

Ve srovnání se dvěma dalšími primárními metodami měření fragmentace DNA, DNA ladder a kometovým testem, má TUNEL tu výhodu, že je založen na identifikaci konců DNA spíše než na fragmentech (obrázek 2). Teoreticky by měl být TUNEL citlivější a lineárnější pro identifikaci počáteční (nízké) fragmentace DNA než žebříček DNA nebo kometa, přičemž oba mají lag-periódu akumulace malých fragmentů s vysokou pohyblivostí. V každém případě studie kombinující TUNEL buď s kometou )41,42] nebo žebříčkem DNA [43,44] mají určitou výhodu v zachycení časné fragmentace DNA s maximální citlivostí.

Aplikace TUNELTUNEL se používá k identifikaci a kvantifikaci poškození ledvin v klinických a základních toxikologických studiích v různém rozsahu aplikací, včetně lékařské léčby [45], environmentálních [46], zemědělských [41] a průmyslových [47] expozic a zvířat [48 ] a potravinářské vědy [49]. TUNEL je použitelný pro všechny typy buněk, orgány a druhy, které mají DNA a DNázy, což zahrnuje téměř všechny druhy. TUNEL byl použit k identifikaci a kvantifikaci poškození ledvin u široké řady zvířat, včetně zebrafish [50], japonských rýžových ryb [51], kuřat [48], pískomilů [52], myší [41], potkanů ​​[45], králík [53], miniprasátka [54] a lidé [55]. Důležitou výhodou TUNELu je, že jej lze použít ve fixovaných kultivovaných buňkách i ve fixovaných tkáních. To poskytuje metodologickou konzistenci pro srovnání mezi výsledky in vitro a in vivo ve studiích, ve kterých mohou být mechanismy zkoumány v kultivovaných buňkách ledvin, zatímco důsledky in vivo jsou hodnoceny v ledvinách zvířat. Lze také použít cokoli mezi celými buňkami a tkáněmi, včetně kultivovaných buněčných sféroidů [56] a ex vivo řezů ledvin [57,58].

Intenzita TUNEL ve smyslu síly signálu nebo počtu TUNEL-pozitivních buněk se může mezi druhy lišit v závislosti na aktivitě DNáz. Podle našich zkušeností má ledvina potkana aktivnější DNázu I než ledvina myší a síla signálu pozitivního na TUNEL s tím koreluje. Když se ledvina porovná s jinými orgány, její TUNEL-pozitivní signál je velmi intenzivní a podobný jiným orgánům s vysokou aktivitou DNázy I, jako je střevo a slinná žláza. Na druhém konci spektra je nejnižší síla TUNEL-pozitivního signálu pozorována v mozku a nádorových/rakovinných buňkách, kde je exprese DNázy I s největší pravděpodobností inaktivována alternativním sestřihem v kódující oblasti [59]. TUNEL-pozitivní signál je pozorován u všech typů buněk v ledvině. V průměru je tubulární epitel poškozen častěji než glomeruly, zejména u akutních poranění (obrázek 3A). To dobře koreluje s aktivitou DNázy I převažující v těchto typech buněk. Soudě podle rozdílů v pohlaví a věku pozorovaných v našich experimentech je DNáza I hojnější a aktivnější u samců než u samic a zvířat středního věku ve srovnání se zvířaty starého nebo novorozeneckého věku. Není však zřejmý žádný jasný rozdíl v pozitivitě TUNEL ve vztahu k pohlaví nebo věku, pravděpodobně proto, že výrazné nebo je převažováno jinými faktory. V některých modelech ledvin (jako je ischemie-reperfuze) je indukována DNáza I [9]; zatímco u jiných není a může být dokonce potlačena (např. u toxicity cisplatiny) [10]. Bylo prokázáno, že k aktivaci endonukleáz, pokud jsou přítomny, dochází během prvních 24 hodin po poškození ledvin [9,60,61]. Proto nebylo překvapivé, že alespoň polovina aplikací TUNELu ve výzkumu ledvin v tomto přehledu byla použita pro akutní poškození ledvin (AKI), protože hodnocení AKI se často provádí během 24 až 72 hodin po poranění, kdy jsou endonukleázy nejaktivnější. . Seznam studií AKI je dlouhý a zahrnuje toxická, septická, transplantační a hypoxická poranění. V této práci jsme zkoumali modely, typy expozice, léčby, časové osy hodnocení a typy buněk ovlivněné v těchto studiích. Studie, které byly zkoumány, zahrnovaly akutní a smíšené akutní-chronické způsoby poškození ledvin a chronické onemocnění ledvin.

Zda je poškození ledvin s TUNEL-pozitivním signálem pozorováno v tubulech nebo glomerulech, závisí na typu poškozujícího agens nebo onemocnění. Například lupusová nefritida u lidí a poškození nanočásticemi niklu byly popsány jako mající striktně glomerulární TUNEL-pozitivní signály [62,63]. Na druhé straně, ischemicko-reperfuzní a streptozotocinem indukovaná diabetická nefropatie u potkanů ​​produkovala TUNEL-pozitivní buňky pouze v tubulech [64,65]. Proximální tubuly, Henleova klička, distální tubuly a kolektivní dukty jsou u ischemicko-reperfuzních modelů často TUNEL-pozitivní. TUNEL-pozitivní buňky v glomerulech i tubulech byly popsány u potkanů ​​vystavených lékům, jako je cyklosporin A [66] a doxorubicin [67] nebo spotřebním materiálům, jako jsou nanočástice oxidu zinečnatého [68] a na potkaním modelu diabetes mellitus [ 69]. AKI vyvolaná septickým šokem u lidí byla také spojena s glomerulárními i tubulárními TUNEL-pozitivními buňkami [70]. strangulated uzavřená smyčka obstrukce tenkého střeva způsobila TUNEL-pozitivitu v ledvině za 3 hodiny [87].

AKI se může objevit po transplantaci a hypoxických poraněních. Rejekce aloštěpu u lidí je běžně spojena se zvýšením počtu TUNEL-pozitivních buněk [88,89]. Po studené ischemii byly TUNEL-pozitivní buňky obvykle pozorovány během 2–24 hodin během reperfuze [90] nebo úžeji mezi 14 a 17 hodinami po ischemii [91] a někdy jsme stále pozorováni až po 7 dnech odmítnutí transplantátu [92]. Podobně v ischemicko-reperfuzních modelech byly TUNEL-pozitivní buňky nejčastěji pozorovány 24 h po reperfuzi [44,93,94] nebo v rozmezí mezi 4 [95,96] a 72 h [97]. V transplantačních i ischemických studiích AKI byly TUNEL-pozitivní buňky lokalizovány do epiteliálních buněk distálního a proximálního tubulu [44,93]. V myšiledvinypo ischemicko-reperfuzním poškození byly TUNEL-pozitivní buňky popsány jako koncentrované v kortikomedulární junkci, obvyklém cíli ischemického poškození [98].

U lidských transplantátů bylo pozorováno smíšené akutní a chronické poškození, kdy toxické expozice, chorobné stavy a/nebo hodnocení byly akutní (tj. hodiny, dny) i chronické (tj. týdny, měsíce, roky) ve stejné studii rejekce (biopsie 1 týden až 3 roky po transplantaci) [88], prasečí infekce virem hepatitidy E (7 a 14 dní po inokulaci) [52], CO2 pneumoperitoneem indukovaný stres u hydronefrotických onemocněníledviny(2 týdny hydronefróza, 2 dny po pneumooperitoneu) [53], mesangiální proliferativní glomerulonefritida vyvolaná hadím jedem (1 až 14 dní po injekci) [99], jednostranná ureterální obstrukce (1 až 14 dní obstrukce) [100], expozice octanu uranylu (1 až 28 dní expozice) [101], nefropatie kyseliny aristocholové (5 a 30-denní denní expozice) [102] a neonatální hyperoxie (testováno 1 až 60 dní po narození, nejprve vystaveno hyperoxii 14 dny) [103]. Čtrnáct dní po dopadu je velmi častým časovým bodem pro hodnocení těchto druhůporanění ledvin[52,53,99,101,103]. Ve většině případů byly TUNEL-pozitivní buňky lokalizovány v tubulech a kolektivních kanálcích. Jedinou výjimkou byla toxicita hadího jedu, který primárně poškodil glomeruly [99].

Chronickýledvinaonemocnění (CKD), definované jako přítomnostledvinapoškození nebo snížená rychlost glomerulární filtrace (GFR) u lidí po dobu delší než 3 měsíce, je také častým předmětem hodnocení TUNEL, které může určit, zda je CKD spojeno s progresivnípoškození ledvin.Nejčastěji studovaným CKD, u kterého je TUNEL aplikován, je diabetická nefropatie. Poškození identifikované pozitivitou TUNEL se vyskytlo v tubulech a podocytech [69] u diabetických pacientů s nástupem diabetu před testováním TUNEL v rozmezí 7 až 30 let [104,105] a 2 až 16 týdnů po léčbě streptozotocinem u hlodavců [106,107]. Podobná TUNEL-pozitivní histopatologie byla popsána u imunoglobulinové A nefropatie [22]. U lupusové nefritidy a membranoproliferativní glomerulonefritidy byla pozitivita TUNEL pozorována především v glomerulech [62,108,109]. Na druhou stranu studie bezpečnosti léků cisplatiny [110], chlorochinu [45], doxorubicinu [67], finasteridu [23], takrolimu [111] a levetiracetamu [24] pozorovaly převážně tubulární poškození. Stejně tak pokračující akutní poškození identifikované tubulárními TUNEL-pozitivními buňkami bylo popsáno ve studiích nefropatie kyseliny močové [112], deficitu methioninu [48], expozice environmentálním toxinům microcystin-LR [50] a kadmiu [113] a v asociace s indukovanou kalcium-oxalátemledvinakameny [114] a kalcifikující nanočástice [115]. Zatímco identifikace progresivního poškození ledvin během CKD pomocí testu TUNEL je užitečným diagnostickým nástrojem, kombinace testu TUNEL s imunohistochemií (IHC) by možná byla ještě více informativní při určování mechanismu poškození.

Kvantifikace a kolokalizační techniky TUNEL

Metody kvantifikace TUNEL se liší. Ve většině zpráv jsou TUNEL-pozitivní buňky/jádra kvantifikovány jako procento celkového počtu buněk/jader [83,116,117]. Zdá se, že je to správné, ačkoli počet buněk pozitivních na TUNEL pravděpodobně přesně neodpovídá počtu mrtvých buněk. Některé buňky možná nedosáhly identifikovatelné úrovně fragmentace DNA, zatímco jiné již mohly být eliminovány makrofágy. Používá se také kvantifikace počtu TUNEL-pozitivních buněk na čtvereční jednotku (mm2) [118], ale tato metoda se zdá méně přesná, protože závisí na umístění a obsahu typu buněk v oblastech. Kortikální sekce obsahují většinou glomeruly, tubuly, krevní cévy a dřeňové paprsky, zatímco dřeňové sekce obsahují především Henleovy smyčky, sběrné kanály a krevní cévy. Kvantifikace "na Fifield" jistě závisí na tom, o jaké pole se jedná [72,119], a kvantifikace "na sekci" je ještě více nedefinovaná [61,120]. Zdá se, že špatně identifikovaná měření, jako je „histologické skóre“ [121], „apoptotický index“ [113], „míra apoptózy“ [92], „procento apoptózy“ [122] nebo procento neléčené kontroly [123,124] být ještě méně vhodné a znesnadňují interpretaci a nejsou srovnatelné s většinou studií.

Buněčná smrt v sousedních buňkách začíná nerovnoměrně, protože závisí na vaskularizaci, buněčném cyklu a dalších proměnných. To často vede k nerovnoměrnému TUNEL barvení buněk ve tkáni [45,96,125]. Překvapivě se pro měření TUNEL nepoužívá obecná intenzita TUNEL-pozitivního signálu, přestože přímo závisí na stupni fragmentace DNA. Je to možná proto, že buňky jsou považovány za mrtvé nezávisle na intenzitě signálu TUNEL, protože buňka nemůže být „mrtvější“, pokud je barvení TUNEL intenzivnější. Ačkoli je obtížné porovnávat studie, které používají širokou škálu metod ke kvantifikaci výsledků TUNEL, množství TUNEL-pozitivních buněk u kontrolních zvířat je obvykle pod 2 procenty [75,99,100,116,126]. Akutní poranění je spojeno s ~5–40× zvýšením pozitivity TUNEL [79,126,127]. Během chronického poranění je nárůst TUNEL-pozitivních buněk o něco nižší, ~2–20-krát, [29,43,65] ve srovnání s neléčenými kontrolami.

Počáteční test TUNEL založený na barvení diaminobenzidinem (DAB) byl navržen pro světelnou mikroskopii [14,15]. Tato tradiční metoda byla stále používána ve dvou třetinách studií zkoumaných v tomto přehledu a v drtivé většině studií lidských biopsií. Kvantifikace se provádí ručním počítáním buněk a i když je přesná, je časově náročná. Kvantifikace se často vůbec nepoužívá a výsledky jsou prezentovány pomocí obrázků ošetřených a obarvených vzorků jako jednoduchý důkaz, že došlo k buněčné smrti. Automatizace může urychlit proces kvantifikace [128,129]. DAB však nelze kombinovat s žádným jiným barvením ve stejném vzorku, a proto TUNEL na bázi DAB může poskytnout pouze počet mrtvých buněk bez jakékoli identifikace typu buňky (kromě vizuálního rozpoznání) nebo mechanismu buněčné smrti.

Zatímco studie na lidech se v drtivé většině spoléhají na TUNEL na bázi DAB využívající světelnou mikroskopii, přibližně polovina studií na zvířatech používá fluorescenční mikroskopii FL (obrázek 3). Fluorescenční TUNEL je vizuálně atraktivní, snadno interpretovatelný a má několik hlavních výhod. Kromě přesné kvantifikace identifikací TUNEL-pozitivních jader nebo střední intenzity barvy může být FL fluorescenční signál TUNEL kolokalizován s jinými barvami pro histochemii (např. DAPI) (obrázek 3A) nebo IHC (obrázek 3B). V druhém případě může použití proteinových markerů pomoci identifikovat TUNEL-pozitivní signály spojené s různýmiledvinanebo poskytují informace o typu buněčné smrti. Nenašli jsme žádné příklady TUNEL kombinovaného s dvojitým barvením IHC protilátkou. Zatímco taková kombinace by byla velmi informativní, například pro identifikaci mechanismu buněčné smrti u určitých typů buněk, technické potíže spojené s takovým barvením mohou převážit výhody.

Identifikaceledvinatyp buňky rozhodně není pro zkušeného problémledvinapatolog [104]. Z tohoto důvodu je použití dalších markerů pro identifikaci buněčného typu, například pomocí CD31 pro identifikaci endoteliálních buněk, vzácné [130]. Často se však používá použití proteinových markerů IHC pro charakterizaci poškození tkáně. Většina studií používá TUNEL-pozitivitu jako jediný důkaz apoptózy. V jiných studiích vedlo zjištění, že TUNEL-pozitivita není specifická pro apoptózu, k mnoha morfologickým (např. hematoxylinem a eosinem nebo barvením kyselinou jodistou – Schiffovo barvení), biochemickým a IHC markerům, které mají být kombinovány s barvením TUNEL k potvrzení apoptózy. Nejčastěji používaným markerem apoptózy závislé na kaspáze je štěpená (aktivní) kaspáza-3 pomocí protilátky, která nerozpoznává kaspázu plné velikosti-3 [131,132]. Testy TUNEL i štěpené kaspázy{12}} ukázaly výlučně tubulární, nikoli glomerulární barvení u ischemicko-reperfuzních potkanů ​​[64]. Jiné kaspázové studie používaly kaspázu-1 [27], -9 [53], -11 [28] a -12 [75]. Mezi další apoptotické markery patřila rodina B-buněčného lymfomu 2 (Bcl2) proteinů Bcl-2 [27], Bcl2L1 [43], Bcl-xl [71], Bax [99], Bak [49] a Bad [43]; apoptotický receptor Fas [52] a apoptotický receptor-ligand FasL [66]; proteinové transkripční faktory forkhead box (FOX) Fox01 [133] a Fox03 [27]; a cytochrom c [53]. Zánět byl identifikován pomocí IHC tumor nekrotizujícího faktoru alfa (TNF ) [134]; nádorové růstové faktory TGF [66] a TGF- 1 [135]; serin/threonin kináza 1 (SGK1) [135]; flavoprotein s přenosem elektronů, beta-podjednotka (ETF) [136]; Janus kináza-2 (JAK2) [137]; převodník signálu a aktivátor transkripce 3 (STAT3) [137]; nukleární faktor kappa-light-chain enhancer aktivovaných B buněk (NF-κB) [137] a jeho inhibiční protein IκB [137]. Proledvinahodnocení poranění, molekula poranění ledvin-1 (KIM-1) [24], aquaporinový-1 kanál (AQP-1) [45], hypoxií indukovatelný faktor {{7} }transkripční faktor alfa (HIF-1 ) [103], přenašeč aminokyselin typu Asc-1 (Asc-1) [121], savčí cíl rapamycinu (mTOR) [131] kináza a transglutamináza II [89]. Oxidativní poškození ledvin bylo studováno pomocí markerů, jako je 8-hydroxyguanosin (8OHdG) [102], neutrofilní gelatináza-asociovaný lipokalin (NGAL) [102], NAD-dependentní deacetyláza sirtuin-1 (SIRT1) [138] a hemoxygenáza 1 (HO-1) [90]. Intenzivně byly studovány kinázy, včetně c-Jun N-terminální kinázové (JNK) dráhy [101], fosfoinositid 3-kinázy/proteinkinázy B/nukleárního faktoru erytroidního 2-transkripčního faktoru souvisejícího s faktorem 2 (PI3K/ Akt/Nrf2) dráha [46], pannexin-1 (PANX1) plazmatický membránový gap junction protein [26] a mitogenem aktivovaná proteinkináza/kináza regulovaná extracelulárním signálem (MAPK/ERK) [26]. Studie apoptotických endonukleáz zahrnovaly DNázu aktivovanou kaspázou (CAD) [139], DNázu I [108] a EndoG [139] a markery poškození DNA zahrnovaly nádorový protein p53 (p53) [99] a dynamin-příbuzný protein 1 (PARP1 ) [66]. Některé studie také zjistily, že hodnocení stresem zprostředkované apoptózy endoplazmatického retikula a poškození tkáně je užitečné [75].

Vzhledem k velkému počtu zkoumaných mechanistických studií a výhodě kombinace TUNEL s IHC markery pro identifikaci mechanismů buněčné smrti by se dalo očekávat mnoho studií využívajících kolokalizaci mezi těmito dvěma. Analýza může být provedena kolokalizací pixel po pixelu mezi TUNEL-pozitivními buňkami a IHC markery, střední intenzitou IHC markeru v TUNEL-pozitivních oblastech nebo TUNEL-pozitivním signálem znamená intenzitu v IHC marker-pozitivních oblastech. Bohužel tato výhoda TUNELu byla využita pouze v několika studiích. TUNEL-pozitivní buňky byly kolokalizovány s odštěpenou kaspázou-3 inledvinatubulů během toxicity acetaminofenu u potkanů ​​[74]. IHC kolokalizace s TUNEL-pozitivním signálem umožnila identifikaci buněčné smrti mezangiálních buněk během Habu nefritidy [99]. Ve světelné mikroskopii byla kolokalizace s mechanistickými markery toxicity provedena v sériových řezech, jak uvádí Ott et al. [89].

Problémy a omezení TUNELU

Při práci s TUNELem se může vyskytnout několik potenciálních problémů, které je třeba očekávat. Jedním z nich je, že 30OH DNA konce se vyskytují nejen během buněčné smrti v důsledku působení endonukleázy, ale také jako normální intermediární metabolit v téměř všech enzymatických reakcích s DNA. Primární buněčnou funkcí, která produkuje 30OH konce, je syntéza DNA, ve které mohou četné Okazakiho fragmenty teoreticky produkovat falešně pozitivní signál TUNEL, zejména ve vysoce citlivých modifikacích testu. Běhemporanění ledvin,Oprava DNA může také přispívat k falešným TUNEL-pozitivním signálům v důsledku působení AP endonukleázy. Masivní oxidativní poškození ledvin vyvolané chemickým (peroxid vodíku, bleomycin) nebo fyzikálním (gama záření) poškozením se může přidat k počtu 30OH konců, což zvyšuje falešně pozitivní hodnoty TUNEL kromě fragmentace DNA zprostředkované endonukleázou.

Častěji a pravděpodobněji mohou nevhodně nastavené experimentální podmínky TdT reakce (čas, teplota, enzymatická aktivita nebo kofaktory) vést k uměle zvýšenému TUNEL-pozitivnímu signálnímu pozadí. Ačkoli zůstává nedefinováno, co je považováno za normální výchozí hodnotu pro neošetřené vzorky ledvinové tkáně, zdá se pravděpodobné, že přibližně 1 procento celkových buněk by bylo rozumné číslo. 10% nebo vyšší pozadí je jistě jasným důkazem buď necharakterizovaných a nerafinovaných podmínek testu nebo odchylky od vhodných podmínek skladování vzorku.

Dalším problémem, který lze očekávat, je nízká aktivita DNázy I v některých typech buněk (např. endotel),ledvinakompartmenty (např. glomeruly) nebo patologické tkáně (např. nádory). U těchto buněk by se mělo očekávat, že budou vykazovat nízkou pozitivitu TUNEL, ne proto, že by byly odolné vůči poranění, ale proto, že neexistuje dostatečná aktivita endonukleázy k produkci měřitelného signálu v TUNEL. Podle našich zkušeností mohou být i změny mezi {{0}},01 procenta a 0,1 procenta TUNEL pozitivních buněk statisticky významné a mohou být použity jako solidní důkaz poškození ledvin (jiné tkáně).

Konečně problém s kvantifikací barvení TUNEL nastává, když je množství fragmentace DNA příliš vysoké, například v pozdních stádiích buněčné smrti nebo při poraněních s vysokou intenzitou, kdy zbývající DNA nemůže být řádně obarvena pomocí DAPI kvůli rozebrání dvoušroubovice (obrázek 3D). V těchto případech TUNEL-pozitivní signály „visí ve vzduchu“ a zdánlivě nejsou spojeny s jádrem. Stává se odpovědností patologa interpretovat je jako TUNEL-pozitivní buňky spíše než artefakt. U fluoresceinem značeného TUNELu existuje nebezpečí identifikace autofluorescence pozadí ve tkáni jako TUNEL-pozitivity [140]. V těchto případech se doporučuje přejít na červené spektrum TUNEL [51,54].

Vzory TUNEL jako zdroj dalších informací

Lze jasně rozlišit několik vzorů TUNEL a použít je k určení potenciálního mechanismu a stupně poranění (tabulka 1, obrázek 3). Obvykle je typ vzoru TUNEL tvořen pouze jádry mírným poškozením, zatímco silnější poškození (tj. zvýšená expozice) vede k silnějšímu zabarvení a rozpadu jader nebo buněk. Striktně apoptotickým vzorem TUNEL je jaderná fragmentace jako výsledek tvorby apoptotických tělísek (obrázek 3E). Malé fragmenty TUNEL-pozitivních jader, která jsou pravděpodobně apoptotickými tělísky, byly pozorovány při ischemické reperfuzi u potkanů ​​za 24–72 hodin [97]. Apoptotická tělíska byla také pozorována při TUNEL značení jader v renálním tubulárním epitelu a intersticiu 14 dní po ischemicko-reperfuzním poškození u potkanů ​​[141]. Zvyšující se dávky levandulového oleje redukovaly vzory TUNEL pouze s jádry a převedly je na TUNEL podobný nekróze s cytoplazmatickým prosakováním [94]. Ten byl výsledkem destrukce jaderného obalu v důsledku působení proteináz a lipáz při nekróze. Cytoplazmatický TUNEL (obrázek 3F), viděný jako TUNEL-pozitivní cytoplazma, byl pozorován ve světelné mikroskopii v modelu rabdomyolýzy v potkaních tubulech [142] a v podocytech kultivovaných v přítomnosti vysoké glukózy a při diabetické nefropatii u myší [135]. Cytoplazmatický TUNEL byl také popsán u renální ischemie-reperfuze u myší pomocí FL fluorescenčního TUNELu [98] a u ischemicko-reperfuze u potkanů ​​pomocí světelné mikroskopie [143]. Chloridem rtuťnatým indukované hluboké a výhradně tubulární poškození se silným cytoplazmatickým barvením TUNEL svědčícím o poškození jaderné membrány [60]. Pokud zranění pokračuje nebo se dávka poškozujícího činidla zvýší, cytoplazmatický TUNEL může být převeden na „nepořádný“ obraz rozptýleného TUNELu (obrázek 3G) připisovaný pozdním stádiím buněčné destrukce v důsledku nekrózy a rozlití buněčné cytoplazmy a úlomků. Například cytoplazmatický i dispergovaný TUNEL byl pozorován u myší léčených cisplatinou [71,72] a potkanů ​​[144] a při poškození podocytů u diabetických potkanů ​​vyvolaných streptozotocinem [145]. Dispergovaný nekrotický TUNEL byl také pozorován během nefrotoxicity indukované uranylacetátem u myší [101]. A konečně další proměnnou signálu TUNEL, které je třeba věnovat pozornost, je intenzita TUNEL-pozitivních signálů, která se může lišit od buňky k buňce v závislosti na počtu zlomů (stupeň poškození), kterým každá buňka zažije, jak dokumentují některé studie [45,96,125 ]. U modelů, ve kterých je pozorována různá intenzita signálu TUNEL, se doporučuje kvantifikace jak počtem TUNEL-pozitivních objektů, tak střední intenzitou barvení.

Závěry

Vzhledem k vysoké aktivitě apoptotických endonukleáz v ledvinách, zejména DNázy I a EndoG, je použití TUNELu provýzkum a diagnostika ledvinje velmi informativní. Může se stát ještě užitečnějším, pokud se TUNEL použije po počátečním použití jako metoda k identifikaci apoptózy. Použití TUNELu výhradně pro studie apoptózy je dobrým příkladem toho, jak může být věda neúmyslně nesprávně nasměrována nevhodně použitou metodou. Navzdory svému použití jako většinou akutního testu poranění lze TUNEL úspěšně použít k hodnocení AKI i CKD. U CKD by však měl být stupeň pozitivity TUNEL nižší než u akutního poranění. Protože aktivita endonukleáz (zejména DNázy I) je mnohem vyšší v tubulárním epitelu než v jiných kompartmentech ledvin, poškození ledvinových tubulů je obvykle považováno za výraznější. Glomerulární nebo vaskulární poranění však lze studovat také pomocí TUNEL, pokud k poranění skutečně dojde v těchto kompartmentech. Kolokalizace FL fluorescenčního TUNEL s IHC markery umožňuje identifikaci a asociaci buněčných typů a mechanismů buněčné smrti se signály TUNEL. Kvantifikace TUNEL může přispět cennými informacemi o stupni buněčné smrti a použití softwaru pro analýzu obrazu může být v tomto ohledu velmi užitečné. Vzhledem k rozmanitosti vzorů TUNEL se důrazně doporučuje vytvořit a předvést reprezentativní obrázky

TUNEL signály, které jsou považovány za pozitivní. A konečně, vzory TUNEL by měly být použity jako zdroj dalších informací, jako je mechanismus buněčné smrti a stupeň toxicity. Například rozlišování mezi TUNEL-pozitivními apoptotickými tělísky, přítomností cytoplazmatických signálů TUNEL nebo rozptýlenými TUNEL vzorci může pomoci identifikovat apoptotické vs. nekrotické TUNEL-pozitivní buňky pro přesnější interpretaci výsledků výzkumu a diagnostiky.

léčba poruchy ledvin sexuálního vzrušení